CN110856752A - 一种自体脂肪干细胞+prp治疗骨性关节炎的实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体脂肪干细胞，具体涉及的是PRP治疗骨性关节炎的自体脂肪干细胞的实验方法，其包括以下的步骤：选取自体干细胞的成分为患者自身的脂肪干细胞和高浓度血小板血浆，用于分离培养脂肪干细胞2‑4周，获得培养后的脂肪干细胞，往脂肪干细胞中加入高浓度血小板血浆，获得脂肪干细胞混合物，再加入生长因子和转换因子，混合均匀，过滤，去掉滤渣，取其清亮的滤液作为注射液，在患者自身患有骨性关节炎的关节处选取注射点位进行注射，该种脂肪干细胞混合物可以有效的降低骨性关节炎的炎症反应和患者自身的免疫反应，对于治疗骨性关节炎有显著的效果。

Description

一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法

技术领域

本发明涉及一种自体脂肪干细胞的应用领域，具体涉及一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法。

背景技术

骨关节炎(OA)是一种常见于老年人的退行性疾病，临床以关节疼痛和活动受限为典型表现。随着全世界老龄人口的增多和生活方式的不同，骨骼肌肉系统疾病是世界范围内影响数以千万计人们、引起长期慢性疼痛和残疾的最常见原因。因此寻求创新出一种安全的、有效地，有大量来源的，不具有伦理争议的细胞移植治疗方法能为骨关节炎患者带来巨大的福音也能极大地满足当前的市场需求并具有极大的产业化前景。

骨关节炎(OA)，也被称为退行性关节炎、骨关节病，是一种潜在影响关节软骨和骨的关节疾病。骨关节炎可以发生在任何关节，但膝关节炎发病率最高，同时也是膝盖残疾的五个主要原因之一。疼痛是骨关节炎最典型的症状。常见的发展中骨关节炎的风险因素包括肥胖、年龄的增加、病前关节损伤、种族、关节的过度使用、荷尔蒙以及工作环境等因素，其中年龄是骨关节炎发生的最明显的风险因素。从年龄段18-24岁，骨关节炎的患病率仅为4％，而75-79岁这个年龄段，骨关节炎的发病率大幅增加到85％.到2012年止，美国约有2700万骨关节炎患者，而在英国这一数字达到800万。根据 WHO-ILAR COPCORD报道，在伊朗农村地区膝关节炎的发病率高达19.3％。骨关节炎的治疗多聚焦于改善症状尤其是疼痛，治疗策略包括药理学(口服药物和注射)和非药理学上的(包括教育、肌肉加强热模式,和经皮电神经刺激等)，而手术干预措施则作为最后的治疗手段使用。

自体脂肪间充质干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。自体脂肪间充质干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为"万用细胞"。因自体脂肪间充质干细胞在体内体外具有多向分化潜能，在特定的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等方向分化。自体脂肪间充质干细胞还具有分泌多种细胞因子，激活内源组织细胞活性、营养、免疫抑制、抗炎、抗纤维化及促进血管形成的作用。

PRP自体血清干细胞(Platelet Rich Plasma)是指富含血小板、血浆或富含生长因子的血液细胞。人们可以PRP技术是指利用自身的血液，提取出富含高浓度血小板和各种自身生长因子的细胞和血浆。PRP中有多种生长因子，各生长因子的比例与体内正常比例相符，使生长因子之间有最佳的协同作用，这在一定程度上弥补了单一生长因子刺激创面修复不佳的缺点；对患者的损伤小且制作简单，能有效降低医疗成本，促进患者的创面愈合。；PRP 含有大量纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架，还可以收缩创面，具有促凝血的作用，可刺激软组织再生，促进伤口早期闭合和防止感染；由于白细胞和单核细胞与血小板在血液中的沉降系数相近，所以经离心法制作的PRP 中还含有较大量的白细胞和单核细胞，这可以更好地起到防止感染的作用； PRP可用凝血酶凝固成胶状，不仅可以粘合组织缺损处，还可以防止血小板的流失，使血小板在局部长时间分泌生长因子，保持较高的生长因子浓度，避免了广泛应用于临床的液态重组生长因子试剂在伤口易流失易蒸发的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，以解决现有治疗骨性关节炎时引起长期慢性疼痛和残疾，可以更好地起到防止感染的作用，PRP可用凝血酶凝固成胶状，不仅可以粘合组织缺损处，还可以防止血小板的流失，使血小板在局部长时间分泌生长因子，保持较高的生长因子浓度，避免临床的液态重组生长因子试剂在伤口易流失易蒸发的缺点。

通过来自动物和人的临床实验和实践研究提供的依据使再生医学更具有临床意义。再生医学的原理是通过细胞学手段使病人恢复健康而不需要进一步的治疗，而大多数慢性病药物是无法做到这一点。目前已广泛认识到哺乳动物组织的损伤能够修复或自生，并且妊娠期间受伤或受损的新生儿组织可以完全实现再现。虽然这种固有能力随年龄和慢性损伤的条件下逐渐减少，成人干细胞从体内各种组织(包括骨髓、脂肪组织、肌肉、皮肤、肝脏、神经、嗅觉和肌腱)的成功分离表明再生和自我修复通路在成年哺乳动物的存在仍然是无可争议的。应用细胞治疗理论能够治疗多种疾病，其中间充质干细胞(MSC)受到了广泛关注。它是成人干细胞的一个子集，起源于中胚层并且存在于几乎所有的成年组织。如果MSC大多起源于血管周，那么就可以知道 MSC在整个身体的分布都是相对丰厚的。

已经证明MSC能够分泌广泛的生物活性物质和营养因子，对于细胞生存的微环境、保护、免疫调制和分化的影响至关重要。实验表明，MSC在合适的刺激下分泌的细胞物质可以使MSC适合软骨和骨修复。事实上，在临床中，骨髓和脂肪组织干细胞已经在骨折修复、关节炎治疗和其他疾病中成功被使用。

脂肪组织含有丰富的MSC，他们被确定为脂肪基质干细胞(ADSCS)。脂肪来源的MSC再生疗法有很多优势，它包含丰富的MSC，很容易从患者自身的自体脂肪组织获取，组织供应充足。MSC能够分泌广泛的生物活性物质和营养因子，对于细胞生存的微环境、保护、免疫调制和分化的影响至关重要。

因此，鉴于骨关节炎综合征的性质及其对多个组织和结构的影响，在整个治疗过程中，联合使用SVF细胞群和PRP治疗,补充适度的运动,使软骨组织再生、修复缓解疼痛和炎症并减少药物的使用。

本发明提供一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其包括以下步骤：

1)选取患者的一关节处采集自体脂肪干细胞200-300ml，用来进行分离培养脂肪干细胞；

2)分离培养脂肪干细胞2-4周，获得培养后的脂肪干细胞以待备用；

3)给培养后的脂肪干细胞中加入高浓度血小板血浆，获得脂肪干细胞的混合物；

4)给脂肪干细胞的混合物中加入生长因子和转换因子，混合均匀，过滤，去掉滤渣，取其清亮的滤液作为注射液；

5)在患者自身的患有骨性关节炎的关节部位选取注射点位；

6)将混合，过滤完成后的注射液注射到选取的注射点位中。

优选地：所述步骤3)中的脂肪干细胞与高浓度血小板血浆混合，具体为自体脂肪干细胞与高浓度血小板血浆以1:5的比例进行混合。

优选地：所述步骤1)中所说的分离培养脂肪干细胞，需经过离心机离心 5分钟左右，然后进行分层，分层后分别去除上层油脂和下层血性液体，得到中层纯脂肪，混入胶原酶消化，按照1:1的比例进行混合0.1％的胶原酶溶液，通过200rpm进行消化40分钟，按照1:6的比例加入生理盐水继续通过离心机离心分离，重复3-5次后经过过滤得到分离培养的自体脂肪干细胞。

优选地：步骤4)中的生长因子包括地塞米松，氨基酸，维生素，人干细胞因子，透明质酸，胰岛素，表皮生长因子。

优选地：步骤4)中的转换因子包括地塞米松，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤。

优选地：步骤5)中的注射点位为一个或者多个。

优选地：所述注射点位为一个时则在关节中间，多个时则均匀分布在患有骨性关节炎的关节四周及中间。

具体实施方式

为了能进一步理解本发明的特征，技术手段以及所达到的目的，功能，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

本实施例的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其步骤包括；选取患者的一关节处采集自体脂肪干细胞200-300ml，用来进行分离培养脂肪干细胞；分离培养脂肪干细胞2-4周，获得培养后的脂肪干细胞以待备用；给培养后的脂肪干细胞中加入高浓度血小板血浆，获得脂肪干细胞的混合物；给脂肪干细胞的混合物中加入生长因子和转换因子，混合均匀，过滤，去掉滤渣，取其清亮的滤液作为注射液；在患者自身的患有骨性关节炎的关节部位选取注射点位；将混合，过滤完成后的注射液注射到选取的注射点位中，所述患者的一关节处为身体任意一健康的关节部位，所述脂肪干细胞与高浓度血小板血浆混合，具体为自体脂肪干细胞与高浓度血小板血浆以1:5的比例进行混合，所述分离培养脂肪干细胞，需经过离心机离心5分钟左右，然后进行分层，分层后分别去除上层油脂和下层血性液体，得到中层纯脂肪，混入胶原酶消化，按照1:1的比例进行混合0.1％的胶原酶溶液，通过200rpm进行消化40分钟，按照1:6的比例加入生理盐水继续通过离心机离心分离，重复3-5次后经过过滤得到分离培养的自体脂肪干细胞，所述生长因子包括地塞米松，氨基酸，维生素，人干细胞因子，透明质酸，胰岛素，表皮生长因子，所述转换因子包括地塞米松，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤，所述注射点位为一个或者多个，具体视其情况而定，所述注射点位为一个时则在关节中间，多个时则均匀分布在患有骨性关节炎的关节四周及中间。

同时此发明还需进行动物实验和临床实验研究其有效性：

一、用动物实验研究此方法的安全性和有效性

1.1实验分组

普通级青紫蓝兔6个月龄,平均体重2.54kg(2.0±2.9kg),雌雄兼用(上海罗泾实验动物房提供)，普通级青紫蓝兔24只，其右前腿膝关节的股骨内髁关节面用骨钻钻孔以破坏关节软骨，能用肉眼看到膝关节肿大变粗。随机分成A、B两组，一组12只。A组膝关节注射1.5ml自体脂肪干细胞+PRP，一月一次，B组为对照组，注射等体积的生理盐水。一个月为一疗程，共3个疗程。

1.2动物模型制备

健康普通级青紫蓝兔40只，术前禁食12小时，采用3％的戊巴比妥耳缘静脉麻醉(1ml/kg)。麻醉成功后，仰卧位用绷带将兔子四肢固定在手术台上，每只兔子用右侧前肢为实验侧，经剃毛、络合碘消毒，铺无菌手术单，将右前腿膝关节的股骨内髁关节面用骨钻钻孔以破坏关节软骨，能用肉眼看到膝关节肿大变粗，无菌生理盐水冲洗术野，3-0缝合线缝合切口，术后立即和术后第1、2天肌注青霉素40万单位，庆大霉素8万单位共3次。术后分笼饲养，按照实验分组设计进行处理。术后3个月内精心饲养观察兔子的一般状况。

1.3组织取材及蜡切片制备

术后1,2，3月每组取4只兔子行耳缘静脉空气栓塞处死，先对标本进行 X线片照片；然后切开术后关节软骨及周围结蹄组织观察骨痂生长情况，并在骨缺损伤处切取以切损段为中心，每端各含0.5cm正常骨质的2cm长骨段标本，标本进行骨密度测定后，生理盐水冲洗标本，迅速置入10％马尔马林液中固定72小时，经一系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为4-6um。

1.4技术路线

按照实验设计要求，于术后1、2、3月取动物按照下述流程进行相关实验。

1.5观察指标流程

1.6其它观察指标

由于OA时软骨破坏的同时伴随着软骨修复的过程，所以还可以检测合成指标：

①Ⅱ型胶原，其前体中含有非螺旋结构的氨基端(N)和羧基端(C)前肽，这两种前肽，即Ⅱ型胶原C前肽(PⅡCP)和Ⅱ型胶原N前肽(PⅡNP)，裂解后进入体液，因此测定其含量可反映关节软骨的合成代谢，PⅡNP以及两种变异体PⅡANP和PⅡBNP的存在，通过开发出的特异性抗体，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PⅡANP、PⅡNP和PⅡBNP在软骨中的蛋白含量。

②骨涎蛋白，可能参与骨组织的矿化过程，OA时其血液水平升高，且其升高的程度和软骨破坏的程度程正相关。

③甲酸敏感蛋白，聚集蛋白聚糖的硫酸软骨素太脸上的多种抗原成分包括864抗原、人软骨糖蛋白(YKL-40)和软骨源性维甲酸敏感蛋白等，有研究表明甲酸敏感蛋白能够反映软骨的修复反应。

二、临床实验研究有效性

2.1研究设计

研究用于评估自体脂肪干细胞+PRP对不同条件下的骨性关节炎的治疗效果。主要采取关节腔注射的方式，然后跟踪病人来确定是否有任何的不良反应发生。

每个中心随机选取10位候选人，总受试者达到100例。男性23岁至59 岁，女性27岁至59岁，除KOOS评级达到V级(最严重)以外的膝关节骨性关节炎患者(单膝或双膝)。在完成治疗的三个月内严密关注是否有不良反应的发生。整个研究要随访1至3年。所以受试者治疗前患病关节应该拍摄 MRI片子作为诊断依据和前后对比依据。

KOOS/HOOS临床评定法进行病情评级

疼痛水平：0、没有疼痛1、轻度偶尔2、轻度经常3、中度4、严重5、不能忍受需要镇痛药

镇痛药的每周的服用频率：0、不需服用1、1到7片或者局部软膏2、8 到14次3、15到21次4、22到28次5、29次以上

跛行的严重程度：0、完全没有1、轻度不经常2、轻度频繁3、中度4、重度5、完全不能行走

关节活动度：0、不受限制1、20％受限2、21-40％受限3、41-60％受限4、 61-80％受限5、受限80％以上，不能活动

关节僵硬程度：0、没有1、轻度2、中度3、严重4、极重度5、不能行走

通过以上指标评估得出每个病人平均综合严重程度的评级，共5个级别。 (I-V级)

最终判定级别为：级。

脂肪微粒送达方式：膝关节腔内注射。

2.2受试者挑选标准

2.2.1合格标准

男性候选者23岁至59岁，女性患者27岁至59岁(育龄妇女确认没有怀孕且治疗4个月内放弃怀孕)，患有单腿或双腿膝关节退行性炎症，KOOS 分级为IV级以下，身体健康状况以ASA分级为I级、II级和III级为主。病人可以自主移动。

受试病人确认没有活动性肿瘤、没有活动性炎症、没有梅毒、艾滋病、育龄期妇女没有怀孕。事先拍摄患病膝关节的MRI片子。

如果以前接受过其他治疗或者目前正在服用治疗关节的药物也没关系。抗凝药物被建议停止服用，但如果必须服用，以主管医生和病人的切身需求为准。

参与受试人员必须要完全理解知情同意书并且自愿签署，而且要配合参与全称随访评估。

2.2.2排除标准

已知有活动性肿瘤；

系统性的活动感染。(迁延不愈的慢性感染和糖尿病足可以参加)；

男性小于23岁，男性小于27岁，所有人员超过60岁；

孕妇不能参与；

严重的心律失常、严重的心梗、ASA分级在III级(不含)以上；

三个月之内接受过其他实验性手术、药物治疗；

酒精和药物成瘾者；

没有能力或者不愿意签署《知情同意书》的人；

经过研究执行人员评估，即便参加研究也不能对受试者的状况有帮助的人。

2.3研究的实施

2.3.1实施、管理和过程

明确统一抽脂部位和注射关节，25cc-30cc的致密脂肪组织将在实验室被浓缩处理。脂肪样本用冷链运输送到实验室，每个人的脂肪干细胞将得到细胞计数。治疗剂量的细胞数量统一为1500万/1.5mlPRP/关节。

注射针剂制作完成通过冷链运输送回到相应的实验中心，由主管医生注射到对应受试者的膝关节腔中。

建议停用抗生素。抽脂部位的疼痛可以服用止痛药，如需要的话。

2.3.2其他措施

所有的材料都来自受试者本身，不需要其他任何措施和药物。

2.3.3其他伴随治疗

允许干预情况：如果病人十分必要继续原来其他疾病的治疗可以被允许。建议抽脂前一周停用任何抗凝药和血液稀释剂，但如果此方案制定医生不同意停药，则以他的意见为主。这样的后果是病人抽脂后将产生於斑，不过这是病人抽脂后常见的后遗症之一。其他任何正在进行的治疗，除非膝关节治疗研究不允许进行的，都可以按原来计划进行。

需要干预情况：受试者在关节注射一周之内避免让关节张力增加的活动，尽量避免上楼和攀登，在三周之内避免负重活动。

注射后不允许再接受其他关节干预治疗

2.4粘连评估

并没有对粘连有明确的评估标准，指标都是功效学方面的。这样更有利于我们确定如果有不良反应发生那么到底是什么样的。

2.5研究程序

2.5.1评估指标：

采用KOOS评估表格，分别在注射后的基点、1周、1个月、3个月、6、9、 12、15、18、21、24、27、30、33、36个月时完成。跟踪随访3年确认最终的疗效。

使用自体脂肪干细胞疗法治疗疾病在澳大利亚已被合法化(Excluded GoodsOrder 2011)。而且在治疗骨关节炎方面具有潜在的巨大优势，PRP治疗骨性关节炎在国外也已经达到广泛的认可，因此我们公司采用自体脂肪干细胞和PRP自体血清干细胞综合治疗骨性关节炎，并取得了显著效果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其步骤包括；

1)选取患者的一关节处采集自体脂肪干细胞200-300ml，用来进行分离培养脂肪干细胞；

2)分离培养脂肪干细胞2-4周，获得培养后的脂肪干细胞以待备用；

3)给培养后的脂肪干细胞中加入高浓度血小板血浆，获得脂肪干细胞的混合物；

4)给脂肪干细胞的混合物中加入生长因子和转换因子，混合均匀，过滤，去掉滤渣，取其清亮的滤液作为注射液；

5)在患者自身的患有骨性关节炎的关节部位选取注射点位；

6)将混合，过滤完成后的注射液注射到选取的注射点位中。

2.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：所述步骤3)中的脂肪干细胞与高浓度血小板血浆混合，具体为自体脂肪干细胞与高浓度血小板血浆以1∶5的比例进行混合。

3.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：所述步骤1)中所说的分离培养脂肪干细胞，需经过离心分层，混入胶原酶消化，加入生理盐水继续离心分离，重复3-5次后经过过滤得到分离培养的自体脂肪干细胞。

4.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：步骤4)中的生长因子包括地塞米松，氨基酸，维生素，人干细胞因子，透明质酸，胰岛素，表皮生长因子。

5.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：步骤4)中的转换因子包括地塞米松，1-甲基-3-异丁黄嘌呤。

6.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：步骤5)中的注射点位为一个或者多个。

7.根据权利要求1所述的一种自体脂肪干细胞+PRP治疗骨性关节炎的实验方法，其特征在于：所述注射点位为一个时则在关节中间，多个时则均匀分布在患有骨性关节炎的关节四周及中间。