KR20160075692A - 저분자량 유기 양쪽성 이온들로의 엑소좀 회수 - Google Patents
저분자량 유기 양쪽성 이온들로의 엑소좀 회수 Download PDFInfo
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Abstract
엑소좀들을 분리하는 방법은 약 350달톤 이하의 분자량을 갖는 유기 양쪽성 이온의 존재에서 적어도 하나의 정제 단계를 수행하는 단계를 포함하며, 상기 유기 양쪽성 이온의 음성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 적어도 하나의 정제 단계가 수행되는 동작 pH 아래의 적어도 하나의 완전 pH 단위이고, 상기 유기 양쪽성 이온의 양성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 동작 pH 이상의 적어도 하나의 완전 pH 단위이다.
Description
여기에 개시되는 실시예들은 엑소좀들을 정제하는 방법들에 관한 것이며, 보다 상세하게는 엑소좀들의 정제에서의 저분자량 유기 양쪽성 이온들의 사용에 관한 것이다.
엑소좀들은 넓은 범위의 생물학적 유체들과 관련되는 약 30㎚ 내지 120㎚의 세포 유래 소수포(vesicle)들이다. 비록 이들의 생물학적 기능들은 아직 완전히 특정되지 않았지만, 다양한 진단 및 치료적 적용들에서 이들의 잠재적인 유용성이 고려되어 왔다. 이들은 통상적으로 초원심분리, 유세포 분석(flow cytometry), 여과, 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 및 장 흐름 분획(field flow fractionation)과 같이 크기에 기초하여 선별하는 기술들에 의해 정제된다(Kang, D. 등의 "J. Proteome Res."(7(2008) 3475-3480); Lasser, C. 등의 "J. Vis. Exp."(59(2012) e3037); Sokolova, V. 등의 "Colloids Surf. B: Biointerfaces"(87(2011) 146-150)).
엑소좀들의 조성은 A. Vlassov 등("Biochim. Biophys. Acta"(1820(2012) 940-948)에 의해 논의되었다. 이들은 추산된 10,000 이하의 뉴클레오티드 단위들 및 300 이하의 단백질들로 구성되는 뉴클레오티드 및 단백질 카고(cargo)를 포함한다. 이들은 상기 엑소좀들의 소스에 따라 콜레스테롤(cholesterol), 세라미드(ceramide)들, 스핑고지질(sphingolipid)들 및 긴 포화 지방 아실(fatty acyl) 사슬들을 갖는 포스포글리세리드(phosphoglyceride)들로 다양하게 농후화되는 지질 이중층막 내에 둘러싸인다. 외측 표면은 또한 만노오스(mannose), 폴리락토스아민(polylactosamine), 알파(alpha)-2,6-시알산(sialic acid) 및 복합 N-연결 글리칸(glycan)들을 포함하는 당류 기(saccharide group)들을 지닌다.
글리신(glycine)은 생리적 pH에서 양쪽성 이온의 형태로 존재하는 자연적으로 생성되는 아미노산이다. 이는 고체 입자들에 대한 엑소좀들의 공유 결합을 수반하는 이와 같은 입자들 상의 반응되지 않은 아미노-반응성 알데히드(aldehyde)들을 억제하기 위해 100mM의 농도로 엑소좀 연구의 분야에 흔히 사용된다(Vincent-Schneider, H. 등의 "Intl. Immunol."(14(2002) 713-722)). 이는 또한 정제된 엑소좀들의 조제에서 팽화제(bulking agent)로 기술되어 왔다(H. Lamparski 등의 미국 특허 제6,812,023호(B1)(2004)). 글리신은 단백질들과 소수성 표면들 사이의 비특이적 상호작용들을 증진시키는 것으로 알려져 있다(Gagnon, P.의 "J. Chromatog. A."(1221 (2012) 57-70); Muller, E. 등의 "J. Sep. Sci."(36(2013) 1327-1334)). 세포막들의 높은 지질 함량은 상승된 표면 소수성을 매개하는 것으로 이해되고 있다.
본 발명은 엑소좀들을 정제하는 방법들을 제공한다.
일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 약 350달톤(Dalton) 이하의 분자량을 갖는 유기 양쪽성 이온(organic zwitterion)의 존재에서 적어도 하나의 정제(purification) 단계를 수행하는 단계를 포함하는 엑소좀(exosome)들을 분리하는 방법들에 관한 것이며, 상기 유기 양쪽성 이온의 음성으로 대전된 부분의 완충(buffering) pK는 상기 적어도 하나의 정제 단계가 수행되는 동작 pH 아래의 적어도 하나의 완전(full) pH 단위이고, 상기 유기 양쪽성 이온의 양성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 동작 pH 이상의 적어도 하나의 완전 pH 단위이다.
엑소좀들과 작은 유기 양쪽성 이온들의 결합이 정제 동안에 엑소좀 회수를 향상시킬 수 있는 점이 발견되었다. 이론적으로 제한되지 않고, 향상된 회수는 엑소좀들 및 이들이 접촉하게 되는 표면들 사이의 비특이적 상호작용들의 감소에 의해 매개되는 것으로 나타난다. 이는 양쪽성 이온의 적절한 종들의 하나의 예인 글리신(glycine)이 단백질들과 소수성 표면들 사이의 비특이적 상호작용들을 증진시키는 것으로 알려져 있고, 외측 엑소좀 멤브레인의 지질 성분이 강한 소수성인 것으로 이해되어 있기 때문에 외견상으로는 반직관적이다. 비특이적 상호작용들을 감소시키기 위한 조건에 맞는 양쪽성 이온들의 분명한 능력은 수성 용액들의 극성을 상승시키는 양쪽성 이온들의 능력에 의해 매개되는 엑소좀 용해도의 증가를 반영할 수 있다. 엑소좀들이 정제 동안에 비특이적으로 상호작용할 수 있는 표면들은 여과(filtration) 매체 및 크로마토그래피(chromatography) 매체를 포함할 수 있다. 비특이적 상호작용들을 감소시키고 용해도를 증가시키는 것이 구별되는 현상들이거나 해명되도록 남아 있는 동일한 현상의 다른 측면들이든지, 아니면 양자의 경우에서 엑소좀들을 양쪽성 이온들과 결합시키는 것은, 여기에 개시되는 실시예들에 따르면, 정제 동안에 향상된 엑소좀 회수를 가져올 수 있다.
여기에 개시되는 방법들을 수행하기 위해 적합한 작은 유기 양쪽성 이온들은 특히 약 75달톤(Dalton: Da)의 분자량을 갖는 아미노산 글리신, 또는 약 89Da의 분자량을 갖는 알라닌(alanine)을 포함한다. 글리신은 일차 아미노기(amino group), 카르복실기(carboxyl group) 및 두 개의 수소 원자들에 연결된 중심 탄소로 구성되며, 여기서 상기 분자의 대향 측들 상에 전하들이 잔류한다. 상기 아미노 및 카르복실기들 사이의 배치와 거리로 인하여, 상기 양쪽성 이온 형태는 상승된 쌍극자 모멘트(dipole moment)를 가지며, 이는 잔류하는 상기 수성 용액들의 벌크(bulk) 유전 상수를 증가시키는 효과를 가진다. 베타민(betaine), 타우린(taurine) 및 타우로베타민(taurobetaine)과 같은 글리신 유사체들은, 베타민에서 상기 아미노기가 9 이상의 pH 값들에서 그 양전하를 유지하도록 화학적으로 변형되고(트리-메틸화되고(tri-methylated)), 타우린에서 상기 카르복실기가 2 이하의 pH에서 그 음전하를 유지하도록 술포기(sulfo group)로 치환되며, 타우리노베타민(taurinobetaine)에서 상기 아미노기 및 카르복실기는 분자가 약 3부터 약 12까지의 pH의 전체 범위에 걸쳐 양쪽성 이온성이 되도록 모두 변형되는 점을 제외하면, 동일한 이유들로 본질적으로 유사한 효과들을 가진다. 다아미노산(diamino acid)들, 트리아미노산(triamino acid)들 및 보다 큰 배수체(multiple)들과 같은 유사하거나 관련된 구조들은 상기 양의 및 음의 전하들 사이의 보다 큰 거리에 의해 생성되는 이들의 보다 큰 쌍극자 모멘트 때문에 보다 낮은 농도에서 보다 효과적일 수 있다. 이와 같은 화합물들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 동종 또는 이종의 조성의 펜타(penta)-아미노산들까지의 많은 다른 것들 중에서 글리실글리신(glycylglycine) 및 글리실글리실글리신(glycylglycylglycine)을 포함한다. 이들 실시예들에서와 같이, 상기 분자의 대향 말단들에서 각기 대전된 기들을 지니고, 여기서 중간 탄소(intermediate carbon)들 상의 측기(side group)들은 실질적으로 대전되지 않으므로 적어도 하나의 중간 탄소를 갖는 분자의 대향 말단들에서 대향 전하들을 지니는 다른 양쪽성 이온들이 조건에 맞으며, 여기서 상기 중간 탄소들 상의 측기들은 실질적으로 대전되지 않는다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 알라닌은 이들이 인간 주입에 대해 안전한 것으로 알려진 FDA 승인 USP-목록에 있는 비활성 성분들이기 때문에 특히 유용할 수 있다. 글리신 및 알라닌은 이들이 또한 여러 공급자들로부터 낮은 가격으로 입수할 수 있기 때문에 보다 유용할 수 있다.
여기에 사용되는 바에 있어서, 글리신은 본 발명의 실시예들을 기술하는 목적을 위한 배타적이지 않은 예들로서 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 일부 실시예들에 따르면, 글리신은 1M, 2M 또는 포화되는 것(약 3M)을 포함하여 5mM, 10mM, 20mM, 50mM, 100mM 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에서 상기 오스몰 농도(osmolarity)를 정상적인 생리적 값들에 상당히 가깝게 유지하도록 100mM 또는 그 이하의 농도를 채용하는 것이 유익할 수 있다. 실험 데이터는 엑소좀들이 수성 용액 내에서 100mM의 글리신과 결합될 때에 정제에 대한 유리한 효과들이 적어도 1M의 글리신에서 얻어지는 바와 같이 양호한 점을 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 글리신의 농도는 1M, 2M, 3M 등을 초과할 수 있거나, 또는 포화될 수 있다.
여기에 개시되는 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제(zwitterionic agent)들은 헤페스(Hepes)(하이드록시에틸피페라진 에탄술폰산(hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid))와 같은 하나 또는 그 이상의 이른바 양쪽성 이온성 완충제(zwitterionic buffer)들과 결합될 수 있다. 헤페스는 약 7의 pK를 가지며, 통상적으로 약 10mM 내지 약 20mM의 농도들에서 엑소좀 완충제로 사용된다. 이와 같은 약제들은, 이들 경우들에서 그 쌍극자 모멘트 및 상기 용제의 유전 상수를 상승시키는 능력을 제거하는 것으로 여겨지는 상기 아미노기가 부분적으로 이온화되고 중성이 아닌 전하를 갖는 종들을 남기기 때문에, 이들의 pK의 1 pH 단위 이내에서 이들이 완충을 위해 사용될 때 개시되는 효과를 생성하는 상기 양쪽성 이온들 중에 계산되지 않는다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 계면활성제(surfactant)와 결합될 수 있다. CHAPS 및CHAPSO와 같은 일부 계면 활성제들은 양쪽성 이온성이지만, 전하들이 상기 분자의 대향 단부들에서가 아니라 서로 가깝게 위치함으로써 강한 쌍극자 모멘트를 생성하지 않으며, 이에 따라 상기 매체의 유전 상수를 상승시키는 능력이 결핍되기 때문에 개시되는 효과를 생성하는 종들 가운데 계산되지 않는다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 종래의 무기 완충제들 및 염들과 결합될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충제들은 인산나트륨(sodium phosphate) 및/또는 인산칼륨(potassium phosphate), 염화나트륨(sodium chloride) 및/또는 염화칼륨(potassium chloride), 그리고 다른 무기 완충제들 및 염들과 같이 통상적으로 사용되는 약제들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 단당류(monosaccharide)들 및 다당류(polysaccharide)들을 포함하여 당들과 결합될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 이들은 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 수크로오스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 또는 다른 당들과 같은 당들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 헤페스 또는 MES와 같은 완충제들과 결합될 수 있다. 비록 이들이 양쪽성 이온성 완충제들로서 판매되지만, 대전된 잔기들의 적어도 하나가 부분적으로 적정되기 때문에 이들이 채용되는 pH 값들에서 적절하게 양쪽성 이온성이 되지 않는다. 이에 따라, 이들은 개시되는 과정의 유익한 효과에 기여하지 않는다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은, 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 또는 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 혹은 다른 것들을 포함하는 유기 용제들이나 폴리머들과 결합될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 금속 이온들의 특정한 종들과 결합될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 금속 종들은 칼슘, 마그네슘, 철, 금속 이온들의 다른 종들, 또는 금속 이온들의 하나 이상의 종들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 킬레이트제(chelating agent)들의 특정한 종들과 결합될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트 종들은 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)), EGTA(에틸렌클리콜테트라아세트산(ethyleneglycoltetraacetic acid), TREN, (트리스(Tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)), 다른 킬레이트제, 또는 킬레이트제들의 결합들을 포함하는 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 다른 물질들과 함께 사용될 때에 생리적 오스몰 농도의 한계들을 초과하지 않고 충분히 높은 농도의 글리신이 허용되기 위해 감소되는 이러한 다른 물질들의 농도를 채용할 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 염들의 농도는, 예를 들면, 상기 조성물의 전도도가 약 15mS/㎝의 정상적인 생리적인 값 아래가 되도록 감소될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 염화나트륨의 농도가 특히 약 25mM까지 감소될 수 있고, 인산염 완충제(phosphate buffer)의 농도가 약 20mM로 제한될 수 있으므로, 상기 글리신의 농도는 약 250mOsm/㎏ 내지 약 300mOsm/㎏의 오스몰 농도 타겟을 전체적으로 초과하지 않고 약 75mM가 될 수 있다. 이와 같은 다른 실시예에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도는 약 20mM의 인산염과 결합하여 약 50mM까지 감소될 수 있으므로, 상기 글리신의 농도는 약 50mM가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 당들이나 다른 삼투성 약제(osmotic agent)들의 농도가 유사하게 조절될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 엑소좀들과 결합될 때에 글리신이 계속적으로 공급될 수 있는 조건들 하에서 처리될 수 있으므로, 엑소좀들이 항상 글리신의 존재에 있게 된다. 다른 실시예들에 있어서, 글리신은 정제의 적어도 하나의 단계 동안에 엑소좀들과 함께 존재할 수 있지만, 계속적으로 존재할 필요는 없다.
일부 실시예들에 있어서, 엑소좀들과 함께 사용되는 글리신 또는 다른 양쪽성 이온성 약제들은 정제되지 않거나, 부분적으로 정제되거나, 고도로 정제된 엑소좀들을 포함하는 제제들 내의 사용을 포함할 수 있다.
정의들
다음의 용어들은 본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.
"양쪽성 이온(zwitterion)"은 동일한 분자 상에 있는 별도의 구별되는 양성으로 및 음성으로 대전된 성분들을 갖는 분자를 언급한다. 양쪽성 이온들은 폭넓은 범위의 아미노산들 및 둘 또는 그 이상의 아미노산 서브유닛들을 함유하는 아미노산 폴리머들을 포함하며, 여기서 특정한 폴리머 내의 각각의 서브유닛들은 동일할 수 있거나, 서로 구별될 수 있다.
"엑소좀(exosome)"은 세포 배양들을 포함하여 많은 생물학적 유체들 내에 존재하는 바와 같은 30㎚ 내지 100㎚의 직경을 갖는 세포 유래 소수포(vesicle)를 언급한다.
"오스몰 농도(osmolarity)"는 용액의 리터 당 용질 입자들의 오스몰(osmole)로 표현되는 용액 내의 하나 또는 그 이상의 삼투성이 있는 활성 물질들의 삼투 농도를 언급한다. 용액의 오스몰 농도는 흔히 생체 분자 또는 생체 분자 집합체의 기능성 및/또는 안정성에 대한 중요 인자가 된다.
"오스몰(osmole)"은 1몰(아보가드로 수)의 입자들(분자들 및 이온들)을 형성하기 위해 용액 내에 해리되는 용질의 양과 동등한 삼투압의 단위를 언급한다.
일부 실시예들에 있어서, 엑소좀들을 분리하는 방법은 약 350달톤(Dalton) 이하의 분자량을 갖는 유기 양쪽성 이온의 존재에서 적어도 하나의 정제 단계를 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유기 양쪽성 이온의 음성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 적어도 하나의 정제 단계가 수행되는 동작 pH 아래의 적어도 하나의 완전 pH 단위이고, 상기 유기 양쪽성 이온의 양성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 동작 pH 이상의 적어도 하나의 완전 pH 단위이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온은 적어도 하나의 탄소 원자에 의한 분리가 존재하도록 양성으로 대전된 질소기(nitrogen group) 및 상기 유기 양쪽성 이온 상의 상기 양성으로 대전된 질소기와 원위의 음성으로 대전된 기를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 탄소 원자는 대전되지 않은 곁가지(side chain)를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계의 동작 조건들 하에서 상기 유기 양쪽성 이온의 몰 유전 증가량(molar dielectric increment)은 20 이상이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계의 동작 조건들 하에서 상기 유기 양쪽성 이온의 몰 유전 증가량은 약 17 이상이다. 일부 실시예들에 있어서, 글리신의 경우의 몰 유전 증가량은 약 18(보다 이전의 측정들)부터 약 22.6까지의 범위 내에 있는 것으로 나타났었다. 예를 들면, bio.groups.et.byu.net/Dielectric_Increments.phtml의 월드 와이드 웹을 참조 바란다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온은 아미노산 또는 2부터 5까지의 아미노산들을 포함하는 펩티드(peptide)이며, 상기 아미노산 또는 펩티드 아미노산들은 글리신, 알라닌, N,N,N-트리메틸글리신(trimethylglycine), 즉 베타민 및 타우린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 유기 양쪽성 이온성 약제는 글리신 또는 알라닌이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온의 농도는 (a) 약 20mM부터 약 50mM까지, (b) 약 50mM부터 약 100mM까지, (c) 약 100mM부터 약 300mM까지, (d) 약 300mM부터 약 3M까지, 그리고 (e) 포화되는 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 이들 사이의 임의의 중간 값들 또는 범위들이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온의 농도는 (a) 약 5mM부터 약 20mM까지, (b) 약 20mM부터 약 50mM까지, (c) 약 50mM부터 약 100mM까지, (d) 약 100mM부터 약 300mM까지, (e) 약 300mM부터 약 3M까지, 그리고 (f) 포화되는 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 이들 사이의 임의의 중간 값들 또는 범위들이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계를 수행하기 전에, 상기 엑소좀들은 정제되지 않거나, 부분적으로 정제되거나, 고도로 정제된다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 정제의 레벨은 약 5%, 10%, 20%, 40%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 99.9% 정제된 것이다. 즉, 정제의 임의의 레벨은 상기 적어도 하나의 정제 단계 이전에 얻어질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 엑소좀들의 순도의 레벨들은 오염 물질 질량(contaminant mass)의 1% 이하, 상기 오염 물질 질량의 1% 이상, 상기 오염 물질 질량의 10% 이상, 상기 오염 물질 질량의 50% 이상, 상기 오염 물질 질량의 90% 이상, 상기 오염 물질 질량의 95% 이상, 또는 상기 오염 물질 질량의 99% 이상, 혹은 이들 범위들 내의 중간 값들을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도는 약 250milliOsmoles/㎏부터 약 300 milliOsmoles/㎏까지의 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도는 약 250milliOsmoles/㎏ 이하이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도는 약 300milliOsmoles/㎏ 이상이다. 일부 실시예들에 있어서, 비록 양쪽성 이온들이 보다 높거나 보다 낮은 농도들에서도 유익한 효과를 가질 수 있지만, 상기 오스몰 농도는 약 250milliOsmoles/㎏부터 약 300milliOsmoles/㎏까지의 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 여과(filtering) 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 크로마토그래피(chromatography) 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 장 흐름 분별(field flow fractionation) 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 원심분리(centrifugation) 단계를 포함한다.
여기에 개시되는 방법들에서의 사용을 위한 특정 조성물들의 개발의 유용한 출발점은 100mM의 글리신을 함유하는 완충제로 엑소좀들의 수성 제제들을 평형화하는 것이다. 상기 완충제는 리터 당 약 280milliOsmoles 내지 약 310milliOsmoles의 이른바 생리적 오스몰 농도를 채용할 수 있다. 삼투압계(osmometer) 없이, 적절한 출발점의 하나의 예는 pH 7.0의 20mM의 헤페스, 25mM의 NaCl, 100mM의 글리신이 될 수 있었다. 다른 하나의 예는 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 50mM의 NaCl, 50mM의 글리신이 될 수 있었다. 헤페스는 히스티딘(histidine)과 같은 다른 양쪽성 이온성 완충제, 또는 양쪽성 이온성 완충제들의 혼합물로 치환될 수 있었다. NaCl은 선택적인 염, 또는 선택적인 염들의 혼합물로 치환될 수 있다. 글리신은 다른 양쪽성 이온성 종들, 또는 양쪽성 이온성 종들의 결합으로 치환될 수 있었다.
일부 실시예들에 있어서, 유익한 효과를 생성하는 데 사용되는 정해진 양쪽성 이온성 종들 또는 양쪽성 이온성 종들의 혼합물의 양은 엑소좀들의 정확한 정량화를 가능하게 하는 분석적 방법을 수반하여 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)와 같은 과정을 실행하여 결정될 수 있다. 여기에 개시되는 방법들에 있어서, 실험들은 반복하여 수행될 수 있고, 여기서 각 실험은 약 10mM, 약 20mM, 약 40mM, 약 80mM, 또는 약 160mM, 혹은 다른 농도들과 같은 고정된 농도들로 양쪽성 이온성 종들의 개별적인 종들을 채용한다. 일부 실시예들에 있어서, 방법들은 양쪽성 이온성 종들의 결합을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 상기 결합된 양쪽성 이온성 종들의 농도는 약 10mM, 약 20mM, 약 40mM, 약 80mM, 또는 약 160mM이다. 후속되는 처리 단계들은 모든 내성들이 원해지는 범위 내의 최소한의 효과적인 농도를 확인하도록 수행될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 염화나트륨 또는 다른 염들의 농도 또한 변화될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충 이온의 농도 또한 변화될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, pH는 일반적으로 6.5부터 7.5까지의 범위 내에서 변화될 수 있다. 실험 계획(DoE)과 같은 통계적 기술들이 다중 변수들이 평가되는 유효한 결과들을 얻기 위해 변수들을 처리하는 횟수를 크게 감소시키도록 채용될 수 있는 점이 인식될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 정제되지 않은 제제는 투석 여과(diafiltration)에 의해 양쪽성 이온을 함유하는 용액으로 평형화될 수 있고, 여기서 투석 여과의 과정 또한 멤브레인 내의 기공들을 통한 이들의 통과에 의해 일부 오염 물질들을 제거하는 효과를 가진다.
일부 실시예들에 있어서, 엑소좀들은 원심분리에 의해 침전될 수 있고, 이들을 양쪽성 이온을 함유하는 완충제 내에 다시 현탁시켜 양쪽성 이온을 함유하는 환경으로 평형화될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 양쪽성 이온들은 건조 양쪽성 이온들의 직접적인 첨가, 또는 적어도 양쪽성 이온성 종들을 함유하는 농축된 용액의 첨가에 의해 엑소좀을 함유하는 제제에 첨가될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 엑소좀 제제는 간단한 건조, 동결 건조(lyophilization), 유리화(vitrification), 또는 다른 방법과 같은 상기 제제로부터 물을 효과적으로 제거하는 방법에 의한 그 보존 이전에 양쪽성 이온을 함유하는 용액으로 평형화될 수 있다.
실험예
실험예 1: 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 엑소좀들 및 글리신의 결합의 처리
1.6㎝의 폭 및 15㎝의 높이인 세파크릴(Sephacryl) S-400 HR의 30mL의 칼럼(column)이 pH 7.0의 25mM의 헤페스, 100mM의 글리신, 150mM의 NaCl을 포함하는 완충제로 평형화되었다. 접선 유동 미세여과(tangential flow microfiltration)에 의해 농축되었고 엑소좀들과 대체로 동등한 결합 자외선(UV) 흡광도(absorbance)로 오염 물질들을 포함하는 7mL의 엑소좀들의 수성 제제로 구성된 샘플이 상기 칼럼에 적용되었고, 분별이 60㎝/hr의 선형 유량으로 상기 칼럼에 제공된 완충제 내에서 수행되었다. 실행은 100mM의 글리신을 1M의 글리신으로 대체하여 반복되었다. 대조 실험은 글리신 없이 pH 7.0의 25mM의 헤페스, 150mM의 NaCl의 완충제를 사용하여 수행되었다. 나노사이트(NanoSight)에 의한 분석은 100mM의 글리신으로 상기 과정들의 실행이 약 99%의 엑소좀 회수를 가져왔던 점을 보여주었다. 1M의 글리신 실험은 약 95%의 회수를 가져왔고, 글리신이 결핍된 대초 실험은 약 90%의 회수를 가져왔다. 피크 정상에서 UV 흡광도에 의한 엑소좀 정량화는 각기 약 100%, 약 92% 및 약 67%의 상대적인 회수들을 나타내었다. 모든 단백질 오염 물질들의 약 95%가 모든 실험들에서 제거되었다. 이러한 실험예는 엑소좀 회수가 추정될 수 있는 두 가지 수단들을 나타낸다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 유사한 방법들이 엑소좀들 및 양쪽성 이온들을 포함하는 물질의 조성물들이 다른 표면들과 접촉된 후에 및/또는 다른 조건들 하에서 엑소좀 회수를 측정하는 데 이용될 수 있었던 점이 분명해질 것이다.
실험예 2: 100mM의 글리신 내의 사이즈 배제 크로마토그래피에 의한 엑소좀들의 처리
초여과에 의해 농축된 엑소좀들이 실험예 1에서 설명한 칼럼과 동일한 SEC 칼럼에 적용되었지만, 상기 엑소좀들은 pH 7.0에서 25mM의 헤페스, 25mM의 NaCl, 100mM의 글리신으로 평형화되었다. 나노사이트에 의해 측정된 바와 같은 엑소좀 회수는 약 99%였다. 비-엑소좀 단백질 함량은 약 95%로 감소되었다.
해당 기술 분야의 숙련자에게는 유전 상수의 양쪽성 이온들이 매개된 상승의 효과들이 정제 방법에 대하여 분명해야 하기 때문에 유사한 효과들이 분별이 크기에 기초하는 모든 정제 방법들에 대해 구현될 것이며, 분별이 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 같은 전하에 기초하는 모든 정제 방법들에 균등할 것인 점이 명백할 것이다.
여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개 문헌이나 특허 또는 특허 출원이 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 바와 동일한 정도까지 이들의 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 포함된다. 참조로 포함되는 공개 문헌들과 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항들과 모순되는 정도에 대해, 본 명세서가 임의의 이러한 모순적인 사항을 대체하거나 및/또는 우선하는 것으로 의도된다.
본 명세서와 특허청구범위에 사용되는 성분들, 크로마토그래피 조건들 등의 양들을 나타내는 모든 숫자는 "약"이라는 용어에 의해 모든 예들에서 변화되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설시되는 수치적 변수들은 본 발명에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 수행에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
본 발명의 많은 변경들과 변형들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 자명할 것인 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기재되는 특정 실시예들은 단지 예로서 제공되며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 본 발명의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것으로 간주되도록 의도된다.
Claims (16)
- 엑소좀(exosome)들을 분리하는 방법에 있어서, 약 350달톤(Dalton) 이하의 분자량을 갖는 유기 양쪽성 이온(organic zwitterion)의 존재에서 적어도 하나의 정제(purification) 단계를 수행하는 단계를 포함하며, 상기 유기 양쪽성 이온의 음성으로 대전된 부분의 완충(buffering) pK는 상기 적어도 하나의 정제 단계가 수행되는 동작 pH 아래의 적어도 하나의 완전(full) pH 단위이고, 상기 유기 양쪽성 이온의 양성으로 대전된 부분의 완충 pK는 상기 동작 pH 이상의 적어도 하나의 완전 pH 단위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온은 적어도 하나의 탄소 원자에 의한 분리가 존재하도록 양성으로 대전된 질소기(nitrogen group) 및 상기 유기 양쪽성 이온 상의 상기 양성으로 대전된 질소기와 원위의 음성으로 대전된 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 탄소 원자는 대전되지 않은 곁사슬(side chain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계의 동작 조건들 하에서 상기 유기 양쪽성 이온의 몰 유전 증가량(molar dielectric increment)은 약 17 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온은 아미노산 또는 2부터 5까지의 아미노산들을 포함하는 펩티드(peptide)이며, 상기 아미노산 또는 펩티드 아미노산들은 글리신(glycine), 알라닌(alanine), N,N,N-트리메틸글리신(trimethylglycine)(베타민(betaine)) 및 타우린(taurine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유기 양쪽성 이온성 약제(organic zwitterionic agent)는 글리신 또는 알라닌인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온의 농도는 (a) 약 20mM부터 약 50mM까지, (b) 약 50mM부터 약 100mM까지, (c) 약 100mM부터 약 300mM까지, (d) 약 300mM부터 약 3M까지, 그리고 (e) 포화된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기 양쪽성 이온의 농도는 (a) 약 5mM부터 약 20mM까지, (b) 약 20mM부터 약 50mM까지, (c) 약 50mM부터 약 100mM까지, (d) 약 100mM부터 약 300mM까지, (e) 약 300mM부터 약 3M까지, 그리고 (f) 포화된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계를 수행하는 단계 전에, 상기 엑소좀들은 정제되지 않거나, 부분적으로 정제되거나, 고도로 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도(osmolarity)는 약 250milliOsmoles/㎏부터 약 300milliOsmoles/㎏까지의 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도는 약 250milliOsmoles/㎏ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계 동안의 오스몰 농도는 약 300milliOsmoles/㎏ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 여과(filtering) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 크로마토그래피(chromatography) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 장 흐름 분별(field flow fractionation) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 원심분리(centrifugation) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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