RU2035914C1 - Способ получения туберкулина - Google Patents
Способ получения туберкулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2035914C1 RU2035914C1 RU93003234A RU93003234A RU2035914C1 RU 2035914 C1 RU2035914 C1 RU 2035914C1 RU 93003234 A RU93003234 A RU 93003234A RU 93003234 A RU93003234 A RU 93003234A RU 2035914 C1 RU2035914 C1 RU 2035914C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- tuberculin
- culture
- filtrate
- solution
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Область применения: микробиология, биотехнология, получение биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза у животных. Сущность изобретения: при получении туберкулина из культурального фильтрата производят предварительное концентрирование последнего с последующим осаждением белка трихлоруксусной кислотой с конечной концентрацией кислоты в фильтрате 8 - 10%, переосаждение белка сернокислым аммонием проводят при нейтральных значениях pH, а прогрев стандартного раствора туберкулина до 80 - 90°С позволяет стабилизировать белок без стабилизирующих добавок (например, Твин-80). Туберкулин, получаемый по предлагаемому способу, имеет стабильную во времени активность и высокий коэффицент специфичности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Description
Изобретение относится к микробиологии, в частности к получению биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза у животных.
Известен способ получения туберкулина [1] путем обработки инактивированных клеток Mikobacterium tuberculosis органическими растворителями, при этом фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией.
Однако использование органических растворителей требует специального оборудования, значительно ухудшает санитарно-гигиенические условия труда и экологию окружающей среды.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения очищенного туберкулина, представляющего собой раствор белковых фракций, выделенных химическим путем из культурального фильтрата туберкулеза, выращенного на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с аспарагином), осаждением белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ кислотой) или сернокислым аммонием с последующей очисткой его путем многократного переосаждения [2]
Однако для указанного способа характерна недостаточная специфичность препарата и небольшой выход доз препарата с 1 л питательной среды.
Однако для указанного способа характерна недостаточная специфичность препарата и небольшой выход доз препарата с 1 л питательной среды.
Целью изобретения является увеличение выхода туберкулина и повышение его специфичности.
Указанная цель достигается тем, что при получении туберкулина из культурального фильтрата по предлагаемому способу производится предварительное концентрирование культурального фильтрата с последующим осаждением белка ТХУ кислотой в конечной концентрации кислоты в фильтрате 8-10% переосаждение белка сернокислым аммонием проводится при нейтральных значениях рН (вместо рН 4-5 по прототипу); а прогрев стандартного раствора туберкулина до 80-90оС позволяет стабилизировать белок без стабилизирующих добавок (например Твин-80).
Предлагаемый способ соответствует критерию "Новизна", так как среди общедоступных источников информации не было обнаружено способа получения туберкулина с такой же совокупностью признаков.
Предлагаемый способ так же соответствует критерию "изобретательский уровень", так как его решение не вытекает явным образом из уровня техники. Известные способы получения туберкулина обладают другими совокупностями признаков, не приводящими к высоким качественным результатам.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Готовят матриксную расплодку на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с аспарапином). Осуществляют производственный посев и инкубируют культуру в течение 6-8 недель при 37оС. Стерилизуют посевы в течение 30 мин при 120оС или в течение 3 ч при 100оС. Концентрируют культуральный фильтрат на ультрафильтрационных мембранах с задерживающей способностью 15 000 Да в 10 раз. Осаждают из концентрата белок 50%-ным раствором ТХУ кислоты в конечной концентрации последней 8-10% После центрифугирования осадок растворяют из расчета 1 ч. белка и 6-10 ч. дистиллированной воды при подщелачивании 10%-ным раствором аммиака (ГОСТ 3760-79) до рН 7,4-7,6. Переосаждают белок равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония (ГОСТ 3769-78) при нейтральных значениях рН. Белок после центрифугирования растворяют в дистиллированной воде в соотношении (1:5)-(1:7); обессоливают белок электродиализом. Стерилизуют раствор белка. Раствор туберкулина разбавляют разбавителем, представляющим собой раствор хлористого натрия (ГОСТ 4233-77), глицерина (ГОСТ 6824-76 или ГОСТ 7482-76) и фенола (ГОСТ 6417-72) в деминерализованной воде (ГОСТ 6709-72). Получают стандартный раствор белка с содеражнием в 1 мл раствора 0,826 мг белка, 0,85 мг хлорида натрия, 1 мг глицерина и 0,3 мг фенола.
П р и м е р 1. Синтетическую питательную среду засевали пленкой культуры, адаптированной в этой питательной среде. Производили производственный посев и инкубирование в течение 7 недель при 37,5оС. Для изготовления туберкулина использовали культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида с типичным ростом и накоплением белка не менее 40 мг. Культуры стерилизовали при 100оС, в течение 3 ч. Для удаления бактериальной массы стерилизованную культуру фильтровали. Культуральный фильтрат концентрировали на ультрафильтрационных мембранах в 10 раз. Из сконцентрированного фильтрата культуральной жидкости производили осаждение белка 50%-ной ТХУ кислотой, в конечной концентрации кислоты в фильтрате 7,5% Перемешивали фильтрат в течение 4 мин с интервалом 15 мин и отстаивали 16 ч при 10оС. Осадок собирали и центрифугировали.
Осадок растворяли в дистиллированной воде из расчета 1 ч. белка и 6 ч. воды и подщелачивали 10%-ным раствором аммиака до рН 7,4.
Раствор белка смешивали с равным объемом насыщенного раствора сернокислого аммония (стерилизация автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин), перемешивали 3 раза через 15 мин и отстаивали 10 ч при 5оС. Надосадочную жидкость удаляли, осадок растворяли в дистиллированной воде в соотношении 1: 6, рН доводили до 7,4.
Раствор белка обессоливали электродиализом в течение 3,5 ч. После обессоливания раствор белка сливали в бутылки, тщательно перемешивали, подщелачивали 10%-ным раствором аммиака до рН 7,0 и проводили стерилизующую фильтрацию в стерильные емкости. Таким образом, получали концентрированный раствор очищенного туберкулина.
В реактор с разбавителем (представляющим собой раствор в деминерализованной воде хлористого натрия 0,85% глицерина 10% и фенола 03,), охлажденным до 13оС, при включенной мешалке со скоростью 60 об/мин вакуум-насосом засасывали концентрат туберкулина до конечной концентрации 50 000 МЕ и перемешивали в течение 30 мин.
Таким образом получали стандартный раствор белка с содержанием в 1 мл раствора 0,826 мг белка, 0,85 мг хлорида натрия, 1 мг глицерина и 0,3 мг фенола, который с целью стабилизации белка прогревали до 80оС, охлаждали до температуры окружающей среды и стерильно расфасовывали в пинициллиновые флаконы по 20 мл.
Результаты приведены в табл.1.
П р и м е р ы 2-6. Примеры выполнялись аналогично примеру 1. Изменяли лишь конечную концентрацию кислоты в фильтрате при осаждении белка из фильтрата культуральной жидкости 50%-ной ТХУ кислотой.
Результаты сведены в табл.1.
П р и м е р ы 7-13. Примеры выполнялись аналогично примеру 1. Изменяли лишь температуру стабилизации туберкулина. Активность препарата во всех примерах составила 50 000 МЕ.
Результаты зависимости активности туберкулина от температуры стабилизации белка после 3 мес хранения приведены в табл.2.
В качестве пояснения к примерам и таблицам необходимо отметить следующее.
Предварительное концентрирование культурального фильтрата на ультрафильтрационных мембранах с задерживающей способностью 15 000 Да уменьшает объем последнего. Экспериментами установлено, что оптимальным значением степени концентрации является 10. При большей кратности наблюдались значительные потери белка, меньшая не имеет смысла, так как увеличивает расход ТХУ кислоты, необходимой для осаждения белка. Уменьшение концентрации культурального фильтрата в 10 раз влечет за собой уменьшение количества ТХУ кислоты, необходимой для осаждения белка, в 10 раз. Во столько же раз уменьшается количество щелочи, необходимой для нейтрализации надосадочной жидкости, подлежащей утилизации.
Это позволяет сэкономить дефицитные и дорогие химреактивы, улучшает санитарно-гигиенические условия труда, уменьшает загрязнение окружающей среды.
Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы гидратных оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью и под действием различных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Одним из таких факторов является воздействие на молекулу белка ТХУ кислотой. При конечной концентрации кислоты 4-5% (прототип) осаждение белка не является полным. А большие концентрации кислоты приводят к необратимой денатурации белка.
Установлено, что оптимальной концентрацией для наиболее полного осаждения белка из культурального фильтрата, не подвергнутого необратимой денатурации, является концентрация ТХУ кислоты 8-10% Прямой зависимости количества осажденного белка от концентрации ТХУ кислоты авторы не наблюдали.
Переосаждение белка сернокислым аммонием при нейтральных значениях рН позволяет получить туберкулин с коэффициентом специфичности 1,1 в то время как при рН 4-5 (прототип) коэффициент специфичности 1,0.
Специфичность предлагаемого туберкулина проверена на 300 морских свинках, сенсибилизированных гетерогенными штаммами птичьего вида и гомогенными штаммами бычьего вида. Предлагаемый препарат дал достоверно более низкую реакцию в гетерогенной системе и имел активность, соответствующую контрольному препарату в гомогенной системе.
В процессе изготовления туберкулина в растворе обнаруживаются протеазы, ферменты, разрушающие белок. Прогрев стандартного раствора туберкулина до 80-90оС позволяет их инактивировать, что приводит к его стабилизации.
Claims (2)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА, включающий выращивание культуры микобактерий бычьего типа в синтетической питательной среде, инактивацию культуры, фильтрацию, отделение культурального фильтра с последующими осождением белка из фильтрата трихлоруксусной кислотой, очисткой раствором сернокислого аммония и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культуральный фильтрат дополнительно концентрирует на мембране с порогом удерживания 15000 Д, для осаждения белка используют трихлоруксусную кислоту в конечной концентрации 8 10 об. очистку осуществляют при нейтральном или слабощелочных значениях рН, а полученный целевой продукт стабилизируют прогреванием.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизацию проводят прогревом до 80 90oС.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93003234A RU2035914C1 (ru) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | Способ получения туберкулина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93003234A RU2035914C1 (ru) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | Способ получения туберкулина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2035914C1 true RU2035914C1 (ru) | 1995-05-27 |
RU93003234A RU93003234A (ru) | 1997-04-20 |
Family
ID=20135939
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93003234A RU2035914C1 (ru) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | Способ получения туберкулина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2035914C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2538624C1 (ru) * | 2013-09-04 | 2015-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения туберкулина для массовой диагностики и профилактики туберкулеза |
-
1993
- 1993-01-18 RU RU93003234A patent/RU2035914C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
1. Патент СССР N 582745, кл. A 61K 39/04, 1973. * |
2. Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного турберкулина для млекопитающих, утв. ГУВ. МСХ СССР 1970. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2538624C1 (ru) * | 2013-09-04 | 2015-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения туберкулина для массовой диагностики и профилактики туберкулеза |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4293571A (en) | Process for the preparation of a purified protein hydrolysate | |
Tager | Concentration, partial purification, properties, and nature of staphylocoagulase | |
JPH04158796A (ja) | ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の製造法 | |
JPH06506347A (ja) | カタラーゼ、その製法および使用 | |
SU933001A3 (ru) | Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью | |
Van Wagtendonk et al. | The culture of Paramecium aurelia in the absence of other living organisms | |
RU2035914C1 (ru) | Способ получения туберкулина | |
Dewey | Biochemical factors in the maximal growth of Tetrahymena | |
US3594284A (en) | Lysostaphin fermentation with accelerated time cycle | |
DE3539702C2 (ru) | ||
Pollock | A simple method for the production of high titre penicillinase | |
Glaser et al. | The culture of Paramecium caudatum free from living microorganisms | |
JPS60172316A (ja) | 凝集剤 | |
US4886779A (en) | Inactivation of human immunodeficiency virus (HIV) in protein-containing solutions by phenols | |
RU2360962C2 (ru) | Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов рода yersinia и vibrio | |
RU2687973C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА КОЛЛАЛИЗИН&αχιρχ;, ЛИОФИЛИЗАТА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ МЕСТНОГО И ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | |
RU2085212C1 (ru) | Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск | |
US4039657A (en) | Separating antigen from residual common sensitizing protein | |
CN112707940B (zh) | 一种甘油葡糖苷的杀菌方法 | |
SU1638156A1 (ru) | Способ получени аутоактиватора роста дл культивировани ЕSснеRIснIа coLI | |
RU2074249C1 (ru) | Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда "целат" для культивирования клеток эукариотов | |
SU819166A1 (ru) | Способ получени гидролизатов изМОлОчНОй СыВОРОТКи дл пРигОТОВлЕНи пиТАТЕльНОй СРЕды | |
RU2153534C1 (ru) | Способ получения пиобактериофага поливалентного | |
RU1526225C (ru) | Способ получения стафилококкового бактериофага | |
JPS62181797A (ja) | 家畜,家禽の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110119 |