JPS62181797A - 家畜，家禽の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＭ業上の利用分Ｖ） 本発明は、感染症診断に用いられる家畜（２）の病原性
細菌の産生ずる蛋白質性抗原の製法に関する。

（従来の技術） 最近の畜産業界の発展は目覚しく、特に生産性の向上を
目指し、多頭飼餐による規模拡大には驚くべきものがあ
る。しかし、それにともなって生産性の向上を阻害する
要因として慢性の疾病が畜産経営にとって大きな脅威と
なっており、これの浄化が急務であるがそのため、その
感染症の診断が重要である。特に、その感染症の診〜１
を簡便で適確な診断法として、家畜（２）の病原性細菌
の産生ずる蛋白質抗原を用いる診断法が好ましく採用さ
れているが、この蛋白質抗原を大量に製造するこ、とが
９１！請されて居り、従来の製法として、液体培養法を
通じての下記の製法がある。即ち、先づ、液体培地に病
原性細菌を培養し、遠心分離あるいは濾過除菌によって
コ体と培地中に産生された蛋白質抗原を含む上清あるい
ｒｉＰ液とに分離し、その上清あるいはｐ液を減圧濃縮
法ならびに限外濾過法（分画分子量の異なる幾つかの限
外濾過膜を用いる）を用いソ、一定濃度に濃縮・精製す
るか、また硫酸アンモニウム等の塩類を用い塩析によっ
て、その蛋白質抗原含有液を回収し使用する等の方法が
とられている。

又、別の製法として、次のようなものがある。

即ち、液体培地中に半透膜袋を懸垂し、その半透膜の袋
中に菌液（精製水、生理食塩液あるいは緩衝液に菌を懸
濁）を入れ、外液のある液体培地をマグネット・スター
ラー等で攪拌し乍ら培養し、培養後半透膜袋を取り出し
、遠心分離によって菌体と菌液中に産生された蛋白質抗
原を含む上清とに分離し、その上清を半透膜チューブに
詰め、濃縮剤で濃縮し、その抗原物質を回収する方法で
ある。

（発明が解決しようとする間１点） 上記従来の製法には夫々状のような欠点がある。即ち、
上記の限外濾過を行う場せ、培養細菌によって産生さｎ
たムフ多糖などの粘稠性物質あるいは培地中の獣・魚肉
エキス、ペプトン、あるいは獣１などの血液や血清成分
などの種・臀の高分子息の成分によって限外濾過がスム
ーズに進行しないため多くの時間を要し、ま次この操作
を２回以上繰り返し行うことなどから、濃縮・精製工程
が煩雑でしかも、必要とする蛋白質抗原物質が限外濾過
膜に吸着され元すするので、その抗原物質の回収も悪い
。

又、上記の遠心分離による上滑あるいは濾過除菌による
ｐ液について、硫酸アンモニウム等の塩類を用いｔ塩析
法によって蛋白質抗原を回収する場合は、大量の塩類を
少量ずつ加えるため長時間を要し、塩析後遠心分離を行
い、その沈渣を少量の精製水で溶解し、半透膜チューブ
に詰め、その塩類を透析によって除去し々ければならな
い。それには大量の精製水、および生理食塩液、あるい
は緩衝液を用いる必要があり、その分離、精製、回収工
程が煩雑で時間も多く要し、しかも回収後の抗原物質の
蛋白変性による失活もみられる。

又、上記の液体培地中に、半透膜袋を懸垂し、その半透
膜中に菌液を入れて培養する場合り。

使用液体培地量あ九りの蛋白質抗原物質の産生量が少な
く、また、その回収液には培地中に含まれる低分子量の
色素等が混入し、これら物質を除去するため、精製水、
および生理食塩液、あるいは緩衝液等で透析しても除去
すゐことが困難で、精度の高い良質の抗原製品が得られ
ない等の不都合を伴なう。

Ｃ問題点を解決する友めの手段） 本発明は、か−る上記従来法の欠点を除去し、従来法に
比し著しく簡単な製造工程で、短時間に、高収率で且つ
高品質に蛋白質抗原を製造し得るようにした家畜ＣＩＩ
Ｑの病原性細菌の産生ずる蛋白質抗原の製法を提供する
もので、半固形培地上に半透膜を付着し、その半透膜上
に家畜（支）の病原性細菌を塗布し、本培養を行い、蛋
白質抗原を産生させた後、その半透膜をその産生した蛋
白質抗原と共に半固形培地上から分離し、洗浄等によっ
て該抗原を回収・濃縮・精製することを特徴とする。

（実施例） 次に本発明の実施例を詳述する。

本発明によれば、半固形培地を使用する、その代表に１
一般に、ゆ天培地として知られているものである。病原
性細菌用の寒天培地に、ペプトンｄ、　Ｍ　（魚）肉エ
キス、酵母エキス、塩類、綿羊、馬、場、牛、豚、兎な
どの血液、あるいは血清、ブドウ糖、デンプン等のＩＨ
Ａ％あるいｄＬ−塩酸システィン、ヘミン等から適宜選
択配合し、こ几に１〜２％の割分の寒天を加え、加熱、
溶解し、主に高圧滅菌１１０℃〜１２１℃、１０〜１５
分間）し、４５〜５０℃に冷えてから減菌ペトリ皿に１
５〜２０１１ｋｌ注ぎ固めたものである。尚、血液又は
血清を配合する場合は、これ以外の成分組成のものを前
記の高圧滅菌、冷却してから血液又は血清を加えてよく
攪拌、混合して寒天培地とする。次に、このように調製
し友所定組成の半固形培地上に、半透膜を付着する。半
透膜としては１目的とする蛋白質性抗原（）分子量は１
０．００ＯＮ２００．０００．更［サフユニットとして
その多くの分子ｆ１１Ｔｆｉ２０．００ト伽、０００で
あることから、分画分子量の範ｔｉｎが３．５００−５
０，０（’０のものを使、用するのが一般である。次に
、その半Ｓ膜上に、家畜（如の病原性細菌の種菌を績布
する。その病原性細菌としては、たとえばアクチノマイ
セス（Ａａｔｉｎｏｍｙａｅｓ）　囮、ボルデテラ（Ｄ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ　）　ＪＲ％パスツレラ（Ｐａａｔ
ｅｕｒｅｌｌａ）楓、７ソハクテ！Ｊ　ウＡ　（Ｆｕｓ
ｏｂａｃｔｓｒｉｕｍ　）　ｍ　ｓアクチノバチラス（
Ａｏｔｉｎｏｂａａｉｌｌｕａ　）　７４　％　へモフ
イルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ　）属に属する細菌
が使用される。

かかる病原性細菌の具体グリとしては、たとえばストレ
プトフッカス・エクイシミレス（８ｔｒｅｐｔｏａｏａ
ｃｕａ　ｅｑｗｓｉｍｉｌｉｓ　）　−ストレプトコッ
カス・ズイス（３ｔｒｅｐｔｏａｏａｏｕａ　ａｕｉｇ
　）　、ストレプトフッカス・ハイカス（５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｏｏｕｓｓｕｂｓｐ、　ｈｙｉａｕｓ　）、スタ
フィロコッカス−７ウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏａｏｏ
ｏｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　ｓ　　アクチノマイセス・
ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙａｅｓｐｙｏｇｅｎｅａ
　）　１ボルデテラーブロンヒセプテイカ（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｏｈｉｓｅｐｔｉｃａ　）　、ヘ
モフィルス自パラズイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕａ　ｐ
ａｒａｓｕｉｓ　）　％了りチノバチラス・プロエロニ
ューモニ了（Ａｃｔｉｎｏｂａｏｉｌｌｕｓ　　ｐｌｅ
ｕｒｏｐｎ＠ｕｍｏｎｉａｅ　　）　　　、　　ノイ　
スッレラ、マルトシダ（１’ａｓｔ＠ｕｒｅｌｌａｍｕ
ｌｔｏｃ１４ａ　）　、フンバクテリウム・ネクロフオ
ラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｓｒｉｕｍ　ｎ・ｏｒｏｐｈｏ
ｒｕｍ　）等があり、それらの細菌が産生ずる蛋白質性
抗原ならびにその対象動物は下記第１ｆｉに示される。

□ 即ち、予め滅菌処理し九半固形培地面に貼つ九特定の分
画分子量の半透膜上に、目的とする特定の抗原を産生ず
る病原性細ｍを予め培養した新鮮培−１ｌｌ―液の一定
量を置き、その菌液を均一に塗布する。これを、その菌
種に応じて、□好・気・、鎌気、炭酸ガス置換などの所
望の培養条件下で、２５〜４０℃の培養温度で１８時間
〜１・４日培養。

するｃ本培養）。この培養において、半固形培地に含ま
れる蛋、白質などの高分子物質が半、透・′膜を通過し
て、□、移植し几該菌と接触することがない反面、培地
中の塩類、ビタミン、・ペプチド、、アミノ酸、および
その他の低分子物質の栄養成分は半透膜を通過して該菌
に供給され、それらの栄養素によって菌は発育する。該
菌は発育、にともないその菌に応した種類の蛋白質抗原
物質を産生ずる。しかしその産生され九七の抗原物質は
高分子の几め半透膜を通過して、・培地中に・拡散する
ことはなく、半透膜上には１体と該菌が産生し友蛋白質
抗原物質および低分子凪の培地成分が残る。

尚、培地中の色素の多くは、蛋白質等の高分子物質と結
合している友め、半ｒ！１膜を通過することがない。微
量の遊離色素も、寒天によって固定せられるので半透膜
を通過して抗原物質側に混入することが防止される。

この本ｔ＊＝ｉ後、培地面の半透膜を剥ぎ取り、１ｍｍ
液液これに付着している抗原物質等の残ｄ物を洗い落と
し、その洗浄液について遠心分離を行うことで菌体と蛋
白質抗原質を含む上清とに分離量る。遠心分離はｓ、ｏ
ｏａ〜１５．０Ｇ０　ｒμで、１０〜６０分間の範囲で
操作すれば、菌体は遠心管底に１塊として残るので、上
清液のみ回収する。回収され次上澄液中には蛋白質抗原
物質と低分子量の培地成分および緩衝液の塩類等が含ま
れる。この上清液を半透膜チューブに詰め、市販の第１
工業薬品（株）製ムＧガム、和光純薬（株）製ポリエチ
レングコールナ６０００　ナトの濃縮剤で６縮し、培地
成分の低分子培地成分を除去し、かくして、蛋白質抗原
の濃度の高い溶液を得ることができる。

さらに、自縮さＡ　、’Ｃ蛋白質抗原溶液を半透明チュ
ーブに人几７ζま＼精製水で透８丁を操り返すことによ
って塩類などの低分子量を除去し、より純トｌの高い蛋
白質性抗原物質を得ることもできる。回収され７Ｉｉ１
．１縮液即ち抗原は、ポックスタイトレージョンによっ
て活性単位ヲ決定シ、一定の単位抗原になるように希釈
液（ｇ液液）を加え、蛋白質性抗原が変性、失活しない
方法で凍結乾燥し、診断用蛋白質性抗原１に得る。これ
で得られ九本発明による診断用抗原は、冷暗所などで長
期間安定に保存することができる。

尚、病原性細菌の菌株を分離し、純粋培養して不法の前
記本培養に用いる種菌又は元画を作製する培養法は、従
来用いられる任意の培養法でよく、液体培養、半固形培
養などで、その培地組成は゛、前記の半固形培地のそれ
と同じでよい。

又、所定の病原性細菌の菌株は、動物用生物学的製剤協
会、農林水産省家畜衛生試験場などから容易に人手でき
、又各感東症に羅患している家畜から分離、同定したも
のを使用すればよいＯ 次ににに本発明の具体的実施例につき説明する。

実施例　　゛ アクチノマイセス・ピオゲネス菌株（農林水産省家畜衛
生試験場から分与を受けｔものを用いるか、あるいはア
クチノマイセス・ピオゲネス感染豚から本国を分離し、
それからプロテアーゼ産生能の高い菌株を選択して使用
してもよい）を、半固形培地である血液寒天培地に接種
し、嫌気条件下で、５７℃、１〜２日培養し、寒天培地
上の集落を再度新しい血液寒天培地に移植し、５７℃で
１〜２日間嫌気的に培養し、種菌を得る。ここまでは従
来法と同様である。

この種菌を、下記表に示す組成の変法ＶＬ寒天培地又は
その表中の寒天を除いた組成の変法ＶＬ液体培地により
′培養し元画を作成する。

表１　変法ＶＸａ、’音地（１００為７分）の組成”　
ｗ類溶液　■　リン醜水素二カリウム　α６％上記１．
ｌをそれぞれ蒸留水に溶かす。

ａ１７０　Ｎりを化学天秤で秤口し、１００穐Ｊの蒸留
水に溶かす。この時２．３滴のアンモニア水を加えると
よく溶ける。

−即ち、この種菌を該変 法液体培地に！ＩＩ種し、嫌気条件下で、３７℃、１〜
２日培養後、無菌的に遠心（３，０００−８，００Ｏｒ
ｐｍ、１０〜３０分間）し、遠心上清を捨て、沈渣菌体
を滅菌リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，０−７２）（滅菌生
理食塩液、あるいは滅菌精製水でもよい）に懸濁し、元
請を得る。或は、前記種菌を、さらに半固形培地にした
該変法ｖｘＪ寒天培地に塗布し、嫌気的に３７℃で１〜
２日間培養し、その菌苔を滅菌リン酸綬衝食塩液（ＩＩ
Ｈ７，０〜ｚ２）（滅菌生理食塩液あるいは減口精製水
でもよい）に懸濁し、さらにこれを１〜２回繰り返し、
菌体を洗浄Ｃ遠心はいずれも３．Ｇｏｏ〜Ｂｅ　Ｏｏｏ
ｒｐｍｘ　１　’〜３０分間である）後、再び滅菌リン
酸緩衝食塩液（ｐＨ７，０〜１２）Ｃ滅菌生理食塩液あ
るいは滅菌精製水でもよい）に懸濁し、これを元請とす
る。

次に、別個に、あらかじめ滅菌した半透膜Ｃ分画分子ｆ
ｉｌ　８．　Ｇｏｏ〜１０．．０００の透析膜チューブ
から作る）を、無菌的に貼り付は九半固形培地である変
法ＶＬ寒天培地（前記と仝じ組成培地）の半′ｒｈ戻上
に、例えば、液体培養による元画の懸濁液（湿菌］約１
０鵬りβ１）１１ＡＪを均一に塗布後、嫌気的に３７°
Ｃで１〜２日間培養を行うｃ本Ｉ’ｍ養）。本＃！１１
後、培地面の半透膜を剥ぎ取り、ＩｌＩＭ）リス・塩酸
緩ａｉ液ｐＨａ　Ｏで洗浄し、その洗浄液について遠心
分離（８，０００ｒｐｍｘ３０分間）を行って、菌体と
プロテアーゼ抗原を含む上清とに分離する。菌体は遠心
管底に菌体塊として残るので、上清液のみ回収する。回
収され友上清中にはプロテアーゼ抗原と低分子量の培地
成分および緩衝液成分等が含まれる。

この上清液を半透膜チューブ（分画分子ｚａ、ｏｏ。

〜２０．Ｇｏｏ）　Ｋ詰め、冷暗室（約４℃）で濃縮剤
（ＡＧガムあるいはポリエチレングリコ−ルナ６、Ｇｏ
ｏ等）で処理して濃縮し、純度の高いプロテアーゼ抗原
を得る。回収され几プロテ了−ゼ抗原液はボックス・タ
イトレージョンによって活性単位を決定し−ａ、（その
抗原活性（寒天ゲル内沈降試験）は１：３２〜１：６２
であった。

又その液中には＠、素が認められなかった。）一定の単
位抗原になるように（Ｌ　Ｉ　Ｍ　トＩＪス・塩酸緩衝
液ｐＨａ　Ｏを加え、プロテアーゼ抗原が変性・失活し
１い真空凍結乾燥法で凍結乾燥し、診断用プロテアーゼ
抗原を得た。

比較例１ 精製水５１ｔＦ−溶解する各培地成分の量を２−７ｊの
精製水に溶靜し次変法ｖｒ、液体培地中に半透膜袋を懸
垂し、その半透膜袋中に前記実施例１で得九同じ元請で
あるアクチノマイセス・ピオゲネス（ＡｏｔＬｎｏｍｙ
ｏｅｓ　ｐｙｏｇｅｎｅａ　）　菌の懸濁液！１ｏｏｓ
Ｊを入れ、炭酸ガス培養後、半透膜袋を取り出し、遠心
分離によって菌体と７クチノマイセス・ピオゲネス菌が
産生じ次プロテ了−ゼＣ蛋自分解酵素）抗原が含まれる
上清とに分離し、その上清を回収し、濃縮し友ところ１
：３２以上の抗原活性（寒天ゲル内沈降試験）を示すプ
ロテアーゼ抗原液が約５〜１５ｓ／と少量しか得られな
かった。しかも培地中に含まれる低分子量の色素等が混
入してい次。これら物質の除去のため精製水、および生
理食塩液、緩衝液等で透析してもそれ等が除去されなか
った。

比較例２ 実施例ＩＫよって得たアクチノマイセス・ピオゲネスの
ＶＬ変法液体培養菌液の元請を同一量ｖＩＩ変法液体培
地に接種し、炭虐ガス培養し、遠心分！！ＩＫよって立
体と培地中に産生され次プロテアーゼ（蛋自分解酵講）
抗原を含む上清とに分離し、その上清を半透膜チューブ
に詰め、濃縮剤で釣部に濃縮し、さらに緩衝液で塩析し
た後、その上清を分画分子量の異なる２種の限外ｐ過膜
、Ｃ分画分子ｆｉ：３０万および１万）を用いｔ限外ｐ
過法で、プロテアーゼ抗原を一定濃度に濃縮・精製した
。その製造日数が１１〜１５日間要し次。

実施例１の本発明の製法で要する６〜７日と比較して２
倍以上の４日数を要し友。

比較試験例１ 実施例１によって得られた二Ｎ発明品と比較例２によっ
て得られた従来品との蛋白質抗原標品（治断用ブロテ了
−ゼ抗原）について、その１バイ了ルを３２倍１の蒸溜
水で希釈し、その吸収波長を比改検討し友。その結果を
添付図面に下す。この図ハアクチノマイセス・ピオゲネ
ス感染痛論Ｕｒ用プロテアーゼ抗原の紫外・可視吸収図
を下し７ｈもので、この図から、不発明品（破線）ＩＣ
ついては、可視波長領域で全く吸収を示さず、無色透明
の溶液となるが、一方従来品（実線）ではかなりの吸収
を示し、着色された溶液であることがわかる。

比較試験例２ 実施例１に示す本発明の製法と比較例２に示す従来の製
法とによるプロテアーゼ抗原液の収量を比較した。

その結果を下記＠２表に示す。

第２表 ＊　：　Ｌｏｗｒｙｌ法 上記表から明らかなように、６１ｉ！Ｉの試作で培地１
１当りの最終的回収抗原溶液について、不発明法は約１
８〜２０　ｍｌでめっｔのに対して、従来法μ約９〜１
１ａｊ！で、本発明法が約１．９倍も多い収量が得らｎ
た。また、蛋白蛍の比較で１不発明法ｎ　１１−６６　
Ｂ−Ｉｌ〜１ａ６８＃、便米ｉｉ７、１８２〜〜ａ７４
５．ダで、平均約２２借も不発明法が多かった。

（見開の効果） この上う：て本発明によるときは、半固形培地上に半透
膜を付着し、その半透膜上に、家畜Ｃ都の病原性細菌を
塗布し、本培養を行うようにしたので、半透膜上に、産
生した蛋白質抗原は、培地中の高分子物質、色素などの
不純物との混合なしに得ることができ、本培養後は、半
透膜を半固形培地から剥離し、その半透膜上の産生した
蛋白質抗原を洗浄により回収し、菌体と分離し、濃縮、
精製するようにしたので、従来法に比し培地からの産生
蛋白質抗原の分離回収作東が容易となり、短時間に且つ
高収率に而も良質の蛋白質性抗原を製造することかでざ
る等の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

図面に、不法並に従来法により得られた蛋白質性抗原製
品の紫外可視吸収特性曲線を示すグラフである。 手続補正Ｍ　６１．５．２２ 昭（４１年　　月　　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　半固形培地上に半透膜を付着し、その半透膜上に家
   畜（禽）の病原性細菌を塗布し、本培養を行い、蛋白質
   抗原を産生させた後、その半透膜をその産生した蛋白質
   抗原と共に半固形培地上から分離し、洗浄等によつて該
   抗原を回収、濃縮、精製することを特徴とする家畜（禽
   ）の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法。 ２　半透膜の分画分子量は、３，５００〜５０，０００
   である特許請求の範囲１に記載の製法。 ３　病原性細菌は、アクチノマイセス属、ボルデテラ属
   、パスツレラ属、スタフイロコツカス属、ストレプトコ
   ッカス属、フソバクテリウム属、アクチノバチラス属お
   よびヘモフイルス属に属するものである特許請求の範囲
   １に記載の製法。