JPH06506347A

JPH06506347A - カタラーゼ、その製法および使用

Info

Publication number: JPH06506347A
Application number: JP4507627A
Authority: JP
Inventors: クリステンセン，ビョルン　エゲル; ランゲ，ニールス　クレブス; ダイモン　コウサク
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: WO1992017571A1; EP0580662A1; FI934240A0; EP0580662B1; FI106803B; DE69225888D1; JP3070768B2; US5571719A; ATE167229T1; DE69225888T2; ES2119812T3; FI934240A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】カタラーゼ、その製法および使用技術分野本発明は、新規なカタラーゼ調製品、その製造方法および過酸化水素の除去におけるその使用に関する。

背景技術カタラーゼ（ＥＣＬ、　１１．１　、　６　）は、過酸化水素の水および酸素分子への分解を触媒する。該カタラーゼは、例えばパスツール殺菌法又は漂白に対し、過酸化水素が添加される場合の通用に於て残留過酸化水素を除去するために使用できる。

かくして、染色前にアルカリ性過酸化水素処理により漂白される布帛から過酸化水素を除去するため繊維産業においてカタラーゼを用いることが示唆された（英国特許２．２１６．１４９、特開平２−１０４７８１）。

ペルオキシド漂白は、通常高ｐＨおよび高温で、例えば８０〜１００°ＣおよびｐＨｌ０又はそれ以上で行なわれ、そして従って中和および冷却に対する要求を避けるため又は最少化するため高ｐ［Ｉおよび高温度で良好な安定性を有するカタラーゼを用いることが望ましい。

カタラーゼは、動物ａ（例えば牛の肝臓）および多くの異なる微生物の双方から公知である。特開平２−７６５７９は、ｐＨ３〜８でアスペルギルスニガー株ＮＦＡＧ　−２由来のカタラーゼを開示する。英国特許２．２１６．１４９はペニシリウム由来のカタラーゼは高ｐＨで良好な安定性を有することを述べている。

本発明の目的は、このようなプロセスに於いて使用するための改良されたカタラーゼを提供することを目的とする。

発明の開示本発明者等は、予期に反し次の内容を見出した。すなわち、新規カタラーゼを、カタラーゼを産生することがこれまで報告されていない２つの属、シタリジウム（Ｓｃｙ　ｔａ　１　ｉｄ　ｉ　ｕｌｌ）およびフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）から得ることができる。更に、本発明者等は、驚くべきことにこの新規カタラーゼが公知のカタラーゼよりも高ｐ１１および高温度でより良い安定性を存していることを見出した。

従って、本発明は、約６〜８の至適ｐＨ並びにシタリジウムのカタラーゼ産生株によって産生されるカタラーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有することを特徴とするカタラーゼを提供する。もう一つの面に於て、本発明は、シタリジウムの株がら由来しそして４０９ｐ■のポリビニルピロリドンの存在下、７０″Ｃ３ｐＨ９〜１０．５で２０分後少なくとも７５％の残留活性を有することを特徴とするカタラーゼ調製品を提供する。

本発明は更にカタラーゼの製造方法を提供するものであり、この方法はフミコラ属又はシタリジウム属の株から由来するカタラーゼをコードしそして発現する遺伝子を含有する微生物を適当な栄養培地中で培養し、好ましくは引き続き培養培地からカタラーゼを回収することを含んでなる。最後に、本発明は過酸化水素の除去における該カタラーゼの使用を提供する。

発明の詳細な説明童生立フミコラ−シタリジウム複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は、Ｄ、Ｈ，エリスにより、Ｔｒａｎｓ、　Ｂｒ、　Ｍｙｃｏｌ、　Ｓｏｃ、　７８　（１）、　１２９〜１３９　（１９８２）に記載されている。この複合体に属する全ての単離物は２つの明確な種に位置づけできる：フミコラインソレンス（クーニーアンドエマージン）およびシタリジウムサーモフィラム（クーニーアンドエマージン）アウストヴインク。

シタリジウム属の定義および分類は、ベサンテにより、１９５７゜Ａｎｎａｌｉ　５ｐｅｒ、　Ａｇｒ、　Ｎ、　Ｓ、、　１１．５ｕｐｐ１．　：　ＣＣＬＸＩ −ＣＣＬＸＶに、およびＭ、Ｂ、エリスにより（１９７１）、　Ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ　Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ＋　ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、にｅｗ、　５ｕｒｒｅｙ＋英国、２８真に記載されている。

Ｓ、サーモフィラムのカタラーゼ産生株の例は、株ＡＴＣＣ２８０８５゜ＡＴＣＣ４８４０９およびＣＢ５６７１．８８であり、更にＨ，インソレンスのカタラーゼ産生株は株ｔｌＡ？Ｉ［１２９２５，Ｉ門１１５８７４７およびＡＴＣＣ３４６２７であり、アメリカンタイプ　カルチエア　コレクション、セントラルビュロー　ヴオール　ジーメル　カルチュレン、ユニバーシティ　オブアルバータ　ミクロファンガス　コレクションおよびハルバリアおよびＣＡＢインタナシッナル　マイコロジカル　インステイチュートからそれぞれ公に入手可能である。

フミコラ−シタリジウム複合体は、フミコラ　グリゼ−νａｒ、サーモイデア　クーニーアンドエマージン、Ｈ，インソレンス　クーニーアンドエマージンおよびトルラ　サーモフイラ　り一二一アンドエマージンとしてすでに分類された好熱性ヒボミセテスを含み、クーニー、Ｄ、Ｇ、アンドエマージン、Ｒに於て記載されている：好熱性菌１ｇ！、それらの生物学上の説明、活性および分類、サンフランシスコニフリーマン（１９６４）　。

株ＡＴＣＣ２８８０５は、トルラサーモフイラとして既に分類された。トルラサーモフイラはアウスヴイノクによりシタリジウムサーモフィラムとして今や再分類されている、Ｐ、ＣＪ、、　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　１９．２５　３３　（１９７６）　。

左ｆヨム艶１生本発明のカタラーゼは、適当な炭素および窒素源を含有する栄養培地（このような培地は業界公知である）上で前記微生物株の好気性培養によって産生できる。

４０〜６０℃の範囲内の温度が増殖およびカタラーゼ産生に対して適当である。

別に、本発明のカタラーゼは前記菌株からの適当な遺伝情報を含有する形質転換された宿主生物を好気性培養することにより産生できる。このような形質転換体は、業界公知の方法により得ることができそして培養できる。

カタラーゼは、（例えば濾過により）発酵培地から細胞を除去し次いで（例えば限界濾過により）ブロスを濃縮することにより回収できる。所望により、カタラーゼは公知方法により更に精製できる。

左叉ｉ二九■１益プロテアーゼを含まないカタラーゼ調製品は、より良き安定性のために一般に好ましい０本発明で用いられる幾つかの菌株は、プロテアーゼを産生できるがしかし、プロテアーゼを含まないカタラーゼ産生株は、突然変異により又は公知の方法によりカタラーゼをコードする遺伝子をプロテアーゼを含まない形質転換体に移入することによって得ることができる。

カタラーゼ調製品は、固体又は液体の形態であってよい、貯蔵安定性の液体調製品は、中性に近いｐＨで公知の安定剤、例えばプロピレングリコールを用いることによって生産できる。

免孜」にす慣１！Ｓサーモフィラム株ＡＴＣＣ２８０８５由来のカタラーゼの免疫化学的性質と同 −又は部分的同一を有し更に上記の熱安定性を有するカタラーゼは又、本発明の範囲内である。

免疫化学的性質を交差反応同一性試験によって免疫学的に測定できる。同一性試験は、周知のオフテルロニー二重免疫拡散法又はアレクセン、　Ｎ、Ｈ，（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎ−ＧｅｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉ　フラノクウエルサイエンテイフイソクノ＜フリケーション（１９８３）　、５章および１４章）に従った双頭交差免疫電気泳動によって行うことができる０語句「抗原の同一性」および「部分的抗原の同一性」は同書中、５章、１９章および２０章に記載されている。

抗原の同一性を明らかにするため、精製シタリジウムサーモフィラムカタラーゼに対し上昇した家兎の抗血清並びにＳ、サーモフィラムＡＴＣＣ４８４０９およびＣＢ５６７１．８８並びにＨ，インソレンスＤＡＭ）１２９２５゜−ゼ調製品を用い、オフテルロ二−二重免疫拡散法を行った。

得られたパターンは、シタリジウムおよびフミコラ株によって産生されるカタラーゼの完全な同一性を示し、そしてシタリジウムカタラーゼとＡ、ニガーカタラーゼ間には、アクセルセンの本１５章に記載される如く、同一性は示されなかった。

然皮定二本発明のカタラーゼの熱安定性は、従来技術の酵素よりもより良いものであり、そして少な（ともｐＨ１０，５までは、ｐＨに殆ど独立している０本発明のカタラーゼは、高ｐＨにより更に不安定となるＡ、ニガー由来の従来技術のカタラーゼよりも１０°Ｃより高い温度（少なくとも７０°Ｃ）に耐えることができる。

下記の表は、２つの酵素の熱安定性を比較する。各々の酵素を０．０５Ｍのホスフェート緩衝液又は０．１８％の珪酸ナトリウム＋０．０５％のＮａ２ＣＯ３（後者は゛によって示される）中、措示された温度、ｐＨおよび時間でインキュベートし、次いで残存活性をＣｌ０（後述する）で測定した。　４ｏｐｐｍのポリビニルピロリドンが全ての場合に存在した。

Ｈ２０！は存在しなかった。

かくして、本発明のカタラーゼは、ｐ１１９〜１０．５に於て、６０°Ｃで６０分後少なくとも９０％の活性を保持しそして７０°Ｃで２０分後少なくとも７５％、４０分後少なくとも６０％および６０分後少なくとも５０％を保持する。

好］Ｌｌ工本発明のカタラーゼの水性溶液は、３７℃で、ｐｎｓ、ｓ〜７．０で４ｉ！１間の貯蔵後検知できる活性の損失を示さなかった。Ａ、ニガー由来の従来のカタラーゼを用いた類似の実験は９０％未満の残留活性を示した。

ＩＬｔｌ斐憤１！図１は本発明のカタラーゼ（例２の培養物の濾液）に対する活性対ｐＨを示し、Ａ、ニガー由来の従来技術のカタラーゼ（特開平２−７６５７９）と比較した。

本発明のカタラーゼは、約９８７に活性の至適ｐＨ（一方、従来技術の酵素は５．５）を有しそしてｐＨ４〜９の範囲内に最分子量Ｍ−−約９２，０００　（ファラマファスト　（Ｐｈａｒａ＋＊ａｐｈａｓｔ）　ＳＤＳによる）等電点ｐｌ＝約４．５（ファラマファストｒＥＦによる）純粋な酵素蛋白質の特異点カタラーゼ活性＝約１６，３００　Ｃ１０７ｍｇ蛋白質（ＣＩＬＩについては下記参照、ビュレント法によって測定される蛋白質）。

過菫止水粟■μｓ人本発明のカタラーゼは、パスツール殺菌法、漂白、悪臭除去又は他の目的に対して過酸化水素が添加される全ての適用に於て、残留の過酸化水素を除去するために用いることができる。このような使用の例は繊維加工、コンタクトレンズの洗浄および（特開平２−７６５７９に記載の如く）にしんの卵の処理である。

繊維産業に於て、漂白剤としてその使用後残留ペルオキシドを除去することにより均一な染色を確保するために使用できる。プロセスは、英国特許２，２１６．１４９および特開平２−１０４７８１に記載されている。典型的には、カタラーゼ処理は、６０〜ｉｏｏ°Ｃ，ｐＨ９〜１１で１０〜３０分間、特に６０〜７０ °Ｃ，Ｐ）１９〜１０．５で１０〜６０分間起こる。典型的には、初期過酸化水素濃度は２００〜２０００ｒｐｍであり、そしてカタラーゼ用量は３，０００〜３０．０００　ＣＩＯ／ｌ（単位は以下ニ記載）テアル。

コンタクトレンズの日常の注意に於て、過酸化水素により消毒されそしてほり中性のｐＨの生理食塩溶液中カタラーゼで処理される。

良好な貯蔵安定性の故に、本発明のカタラーゼはこの目的に十分適合し得る。

左ｄ定１力タラーゼ単位ＣＩＯは、ｐＨ７，０，２５°Ｃで毎分■８島のｌ　μｍｏｌｅを分解するであろう、一方Ｈｔｏｚ濃度は１４の反応混合勘当たり１０．３μ ｍｏ１ｅｓから９．２μｍｏ１ｅｓに減少する。過酸化水素の分解は、２４０ｎ園で分光光度的に追跡される。

例ＩＳ　サーモフィームの３０　ｇ　／　ｆｆｉのデキストリン、５０　ｇ　／　ｌのファルマメディア（ｐｈａｒｓ＋ａｍｅｄｉａ）、０．２ｇ／ｊ！のＭｇＳＯ４−７１１２０，８ｇ／ｆｆｉのＮａｚＨＰＯ，・１２［１，Ｏ，３ｇ＃！のＫ［１ｉＰＯ，，０，１ａｆ＃！ブルロニツタを含有する培地１００Ｉ１１を、２個のじゃま板を備えた５００ｍのエルレンマイヤーフラスコに入れた。１２０℃で２０分間行なわれる殺Ｉ（オートクレーブ処理）前にｐＨを７．０に調節した。殺菌した培地に、シタリジウムサーモフィラム、ＡＴＣＣ２８０８５の胞子形成増殖物を含有するバクトボテトデキストロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。この培養株を軌道振とう器上で２５Ｏｒｐｍで６日間まで４０℃で増殖せしめる。

例２Ｓ　サーモフィームのシタリジウムサーモフィラム、ＡＴＣＣ２８０８５を、例１に於けると同様に４〜６日間培養し、次いでこの培養物の５−を例１に於けると同様にＬｏｏｌｌｌの培地に接種し、次いでこの新たな培養株を例１に於けると類似の条件下で７５時間増殖せしめた。７５時間後のｐＨは８．６であった。この培養物の濾液は１０，７００ＣＩ［Ｉ／ａｄのカタラーゼカ価を有していた。

例３Ｈインソレンスの例１で用いた培地１０（ｌｄに、フミコラインソレンスＩＭｒ１５８７４７の十分な増殖物を含有するバクトボテトデキストロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。この培養株を軌道振とう器上で２５Ｏｒｐｍで３日間まで３０゛Ｃで増殖せしめた。この培養物５ｉを例１に於ける如くＴＯＯｄの培地に接種し、次いでこの新たな培養株を軌道振とう器上で２５０ｒｐ−で３０℃で１６５時間増殖せしめた。１６５時間後のｐＨは８．５であった。この培養物の濾液は３８２０ＣＩＵ／ｍｌ！のカタラーゼカ価を有していた。

例４本発明のカタラーゼを、６０℃、　ｐＨ１０で過酸化水素の除去に於て２種の従来技術の酵素と比較した。

例２の培養物の濾液を、特開平２−７６５７９に従って得られたＡ。

ニガー由来のカタラーゼおよび商業上のカタラーゼ製品Ａｓｘ”２５（＝菱ガス化学社製品）と共に試験した。

反応条件は６０°Ｃ，ｐＨ１０（ｌ　Ｉ！当たり０．４ｇのＮａＨＣＯ３＋　０．６ｇのＮａｘＣＯｘ）＋　２５〜１５００ｒｐｍのｏｚｏｚ　（以下に示す如し）および酵素濃度２０００〜３００００ＣＩυ／ｊ２（以下に示す如し）であった。

残留Ｈ２０□をメルクペルオキシド試験紙により検出した。これは、ＨｔｏｚｆＡ度に酵素添加後１０分、１５分および２０分に行った。

結果を以下の表に示すが、表中次の記号を用いる：◎　過酸化水素は１０分以内に除去Ｏ過酸化水素は１５分以内に除去へ　過酸化水素は２０分以内に除去 −過酸化水素は２０分以内に除去されずＡ　カタラーゼ用量（ＣＩＯ／１）Ｂ　ｔｈａｔ　Ｃ９９ｍ）Ｈのカ　−−ゼＢ　３００００２２５００２００００１５０００１００００７５００　６０００３７５０　３０００２０００１５００　・　・　００．−−−−−−１０００　・　・　・　・　−−−−−−７５０・　・　・　・　０−−−−−−５００　・　・　・　・　・　Δ　−−−−２５０・　・　・　・　・　・　０　Δ　− −１００・　Ｏ・　・　・　・　・　０−−７５　・　・　・　・　・　・　・　０　−　−５０　・　・　・　・　・　・　・　ＯΔ　−２５・　・　・　・　・　・　・　・　〇　−Ａ、ニガー　のカ　−−ゼ　・ＡＢ　３００００２２５００２００００　１５０００１００００７５００　６０００　３７５０　３０００　２０００１５００　・　・　−−−−−−−一１０００　・　・　０−−−−−−− ７５０　・　・　・　Δ　−−−−〜　−５００・　・　・　・　−−一−−− ２５０・　・　・　・　Δ　Δ　−−−−１００Ｏ・　・　・　Δ　Δ　−−− −７５・　・　・　・　・　Δ　−−〜　−５０・　・　・　・　・　ｏ−−− − ２５・　・　・　・　・　・　０　−　−　−ハ１ユＬΩ月監ＬＢ　３００００２２５００２００００１５０００１００００７５００　６０００３７５０　３０００２０００結果は、明らかに本発明のカタラーゼが高温度および高ｐＨでの過酸化水素の除去に対し従来技術の酵素よりも秀れている。かくして、本発明のカタラーゼ（７）　６０００ＣＩＵ／　ｌは１０分以内ニ２５〜１００ｐｐｓ（７）過酸化水素を除去できた。

例５６０℃で゛　の１１０００ｐｐ　ノＨｔＯ，を含有する（以下に示す如き）ｐＨ９又はｔｏ（７）０．０５Ｍのホスフェート緩衝液中、６０℃で実験を行った０本発明のカタラーゼＬＯＣＩＵ／ｗｌ　（例２の培養物の濾液）を加え、次いでＨ８０８の量を、２０分、４０分および６０分後に測定した。結果（ｐｐｍ　Ｈ，（ｂ）　：皿ｉ　皿２０分　８１１４０分　５７６０分　５６ブランク　（酵素なし）：６０分　＞　９００　８５０これらの結果は、これらの条件でＨ２０，の極めて低レベルへの減少を示し、− 吉例４はｐＨ１ｏで２０分以内で不完全な除去を示した。

例６ＬＬ辷士■１１４２％ｗ　／　ｗエタノールを例１に於けると同様に得られた培養物の濾液に添加しカタラーゼを沈殿せしめた。遠心分離後、沈殿物を元の容量までイオン交換された水に再溶解した。

ｐＨを４．５に調節し次いで再溶解したカタラーゼを３％ｗ　／　ｗのヘントナイト（Ｃ１ａｒｉｔｅＩＶ）および３％ｗ　／　ｗの活性炭（Ｐｒｉｃａｔｉｆ　ＦＧＶ）で処理した（室温、１時間撹拌）。ベントナイトおよび活性炭を遠心分離により除去し、次いで滅菌濾過した。

ｐＨを５．０にｔｌＭ節し次いで濾液をバッチプロセスに於てＣＭ−セファロース　（ファルマシア）を用い４°Ｃで一夜処理した（２００，０ＯＯＣＩＵ当たり１ｄのＣ門−セファロース）、イオン交換樹脂を、ｐＨ５，０で０．０２５Ｍのホスフェート緩衝液および０．０９ＭのＮａＣ１の１０容量を用いて洗浄した。

最終精製工程は、ファルマシア製のクママトフォーカシング樹脂ＰＢＥ９４を用いて行った：緩衝液を、透析によりｐＨ５，５で０．０２５ピペラジン／ＨＣＩ緩衝液に交換し、次いでカタラーゼをＰＢＥ９４カラムに吸着させ、更にｐＨ４，０でポリバッフｙ　−（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）　７４で溶出し、引き続きＬＭのＮａＣ１溶液で溶出した。カタラーゼはＩＭのＮａＣ１溶液中に見出された。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年９月２７日

Claims

【特許請求の範囲】１．約６〜８の至適ｐＨおよびシタリジウムのカタラーゼ産生株によって産生されるカタラーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有することを特徴とする、カタラーゼ。２．カタラーゼ産生株が、Ｓ．サーモフィラム、好ましくは株４ＴＣＣ２８０８５，ＡＴＣＣ４８４０９又はＣＢＳ６７１．８８に属する、請求の範囲第１項記載のカタラーゼ。３．分子量約９２，０００および株ＡＴＣＣ２８０８５によって産生されるカタラーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有する、請求の範囲第２項記載のカタラーゼ。４．シタリジウムの株から由来し、更に４０ｐｐｍのポリビニルピロリドンの存在下、７０℃、ｐＨ９〜１０．５で２０分後に少なくとも７５％の残留活性を有することを特徴とする、カタラーゼ調製品。５．Ｓ．サーモフィラムの株から、好ましくは株ＡＴＣＣ２８０８５，ＡＴＣＣ４８４０９又はＣＢＳ．６７１．８８から由来する、請求の範囲第４項記載のカタラーゼ調製品。６．カタラーゼの製造方法であって、フミコラ属又はシタリジウム属の株から由来するカタラーゼをコードしそして発現する遺伝子を含有する微生物を適当な栄養培地中で培養し、好ましくは引き続き培養培地からカタラーゼを回収することを含んでなる、前記製造方法。７．遺伝子が、フミコラーシタリジウム複合体の株から、好ましくはＳ．サーモフィラムＡＴＣＣ２８０８５，ＡＴＣＣ４８４０９もしくはＣＢＳ６７１．８８又はＨ．インソレンスＵＡＭＨ２９２５，ＡＴＣＣ４８４０９もしくはＣＢＳ６７１．８８から由来する、請求の範囲第６項記載の方法。８．フミコラ属又はシタリジウム属のカタラーゼ産生株を培養することを含んでなる、請求の範囲第６項記載の方法。９．株が、フミコラーシタリジウム複合体に属し、そして、好ましくはＳ．サーモフィラムＡＴＣＣ２８０８５，ＡＴＣＣ４８４０９もしくはＣＢＳ６７１，８８、又はＨ．インソレンスＵＡＭＨ２９２５，ＡＴＣＣ４８４０９もしくはＣＢＳ６７１．８８又はそれらのいずれか任意の突然変異体もしくは変異体である、請求の範囲第８項記載の方法。１０．培養を４０〜６０℃の範囲内の温度で行う、請求の範囲第８又は９項記載の方法。１１．過酸化水素の除去に於ける、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のカタラーゼ調製品の使用。１２．ベルオキシ漂白後、布帛から残留過酸化水素の除去のための請求の範囲第１１項記載の使用。１３．５０〜７５℃、ｐＨ７〜１０．５での請求の範囲第１１又は１２項記載の使用。１４．過酸化水素による消毒後、コンタクトレンズの処理のための請求の範囲第１１項記載の使用。