FI87934C - Framstaellningsfoerfarande foer ny vaermebestaendig transglukosidas - Google Patents

Description

/ .

1 87934

Uuden lämmönkestävän transglukosidaasin valmistusmenetelmä

Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää 5 transglukosidaasin valmistamiseksi Talaromyces dupontin avulla. Transglukosidaasi, joka on erittäin lämmönkestä-vä, on käyttökelpoinen muutettaessa maltoosia panoosiksi ja isomaltoosiksi.

Transglukosidaasi (tunnettu myös 1,4-alfa-D-glu-10 kaani-6-alfa-D-glukosyylitransferaasina sekä transgluko- sylaasina) on saatu erilaisista mikro-organismeista. Se on entsyymi, joka saa aikaan panoosi-trisakkaridin sekä isomaltoosi-trisakkaridin muodostumisen maltoosista sidosten pilkkomisen ja uusien muodostumisen avulla. Nämä 15 oligosakkaridit eivät ole käymiskelpoisia, ja täten niillä on käyttöä elintarvike-, virvoitusjuoma- sekä riisi-viinateollisuudessa sekä uusien ruokatuotteiden valmistuksessa. Katso esimerkiksi, Nunokawa et ai., JP-patentti nro Sho 56(1981)-27236. Julkaisussa on kuvattu transglu-20 kosidaasin ja glukoamylaasin valmistusmenetelmä viljele mällä Aspergillus saitoin tai A. usamin kantaa. Viljely-suodoksen annetaan kulkea hartsia sisältävän pylvään lä-pi, joka pidättää transglukosidaasin, kun taas glukoamy-·. laasi kulkee pylvään läpi effluentissa. Transglukosidaasi .1 ‘ 25 poistetaan hartsista asetaattipuskuriliuoksella pHrssa 5,5. Artikkelissa "The isolation and Mode of Action of * ·' Fungal Transglukosylase", julkaisussa "Archives of Bio chemistry and Biophysics", osassa 93, sivuilla 43-49 (1961), Pazur et ai., the Department of Biochemistry and 30 Nutrition, University of Nebraska, Lincoln, Nebraska, ku-: ·.: vaavat myös menetelmän Aspergillus nigerin transglukosi- daasin saamiseksi, johon menetelmään sisältyy tämän entsyymin erottaminen muista samanaikaisesti valmistetuista karbohydraaseista DEAE-selluloosalla (dietyyliaminoetyy-’···’ 35 liselluloosa), tärkkelyksellä ja karboksimetyyliselluloo-salla suoritetun kromatografiän ja adsorption avulla.

2 87934

Toisaalta Tamura et ai. US-patentissa 4 247 637 kuvaavat menetelmän lämmönkestävän glukoamylaasin valmistamiseksi Talaromyces dupontin kannasta, johon menetelmään sisältyy kannan kasvatus ravintoelatusaineessa sekä 5 entsyymin eristäminen. Kannan kasvatuksen sekä huovaston poistamisen jälkeen, joka suoritetaan suodattamalla, suo-doksen annetaan kulkea aktiivisaven läpi, jolloin gluko-amylaasi saadaan effluentista. Tamura et ai. eivät mainitse mitään siitä, että Talaromyces duponti erittää myös 10 transglukosidaasia, puhumattakaan hyvin lämmönkestävästä transglukosidaasista.

Kyseessä olevan keksinnön tekijät ovat havainneet, että lämmönkestävä transglukosidaasi voidaan valmistaa kasvattamalla Talaromyces dupontia sopivassa ravintoela-15 tusaineessa.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä lämmönkestävän 1,4-a-D-glukaani-6-a-glukosyylitransferaasin (transglukosidaasin) valmistamiseksi, jonka transglukosi-daasin aktiivisuuden optimi-pH on 4,5 - 5,0 ja jäännösak-20 tiivisuus on yli 40 % 60 minuutin kuumennuksen jälkeen 70°C:ssa pH:ssa 4,5. Menetelmässä Talaromyces dupontin kantaa kasvatetaan sopivassa ravintoelatusaineessa ja transglukosidaasi eristetään siitä. Keksintö koskee myös - lämmönkestävää transglukosidaasia, jolle on tunnusomais- 25 ta, että sitä valmistetaan T. duponti -lajiin kuuluvan sienen avulla, sen aktiivisuuden optimi-pH on 4,5 - 5,0, : ·' ja sen jäännösaktiivisuus on yli 40 % 60 minuutin kuumen- nuksen jälkeen 70°C:ssa pH:ssa 4,5.

Entsyymi muodostuu kyseisen mikro-organismin käy-30 misen avulla ravintoelatusaineessa. Käymisen (jona aikana entsyymi erittyy) päätyttyä biomassa voidaan poistaa : käymisliemestä jollakin nesteen ja kiinteän aineen ero- tustekniikalla, kuten esimerkiksi suodattamalla tai sen-; trifugoinnin avulla dekantoiden, jolloin saadaan entsyy- '···' 35 miä sisältävä liuos.

3 87934

Tyypillisesti, elatusaineita, joita käytetään tavallisten homeiden kasvattamiseen, käytetään T. dupontin käymisen ravintolähteenä. Erilaiset hiilenlähteet ovat hyvin tunnettuja, ja ne voidaan valita tärkkelyksen, me-5 lassin sekä maissijauhon yms. joukosta. Typenlähteet ovat myös yleisesti tunnettuja, ja tyypillisiä esimerkkejä ovat soija, puuvillansiemenjauho, peptoni, maissin lio-tusneste, hiivauute yms. Käymiselatusaineissa käytetään myös sulfaatti- tai kloridisuoloja, kuten esimerkiksi 10 magnesiumsulfaattia, kalsiumkloridia, natriumkloridia ja kaliumkloridia. Usein käytetään myös fosfaattisuoloja, koska ne toimivat myös puskuroivina tekijöinä. Lisäksi voidaan käymiselatusaineen pH säätää, edullisesti alueelle, joka on lähellä neutraalia, emästen, kuten esimerkik-15 si natriumhydroksidin tai kaliumhydroksidin ja/tai happojen avulla, kuten esimerkiksi kloorivety- tai etikkaha-polla.

Homeiden kasvatuksessa olosuhteet, kuten pH, aika ja lämpötila ovat hyvin tunnettuja. pH:n täytyy olla 20 alueella, joka on noin 3-9, ja edullisesti sen tulee olla alueella noin 5-8. Erittäin edullinen elatusaineen pH on lähellä neutraalia. Käymisen annetaan tapahtua aina noin 2-10 päivän ajan, edullisesti noin 4-8 päivän ajan. Läm-* pötilan tulisi olla noin 25°C:n ja noin 50°C:n välillä ja .1 25 edullisesti noin 30°C-45°C. Optimi kasvatuslämpötila on . 40°C:n läheisyydessä.

* ;* Esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa Talaromyces duponti-lajiin kuuluvaa sientä. Erit-täin edullisessa suoritusmuodossa käytetään T. dupontin 30 kantaa, joka on tallennettu laitokseen the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City, Japani, numerolla ATCC 20805 (FRI 4566). Yllättäen on havaittu, että transglukosidaasi, jota tämä tietty sienikanta tuottaa, on erityisen termofii-35 linen, kuten havainnollistetaan alla esitetyissä esimer- 4 87934 keissä. Voidaan käyttää myös ATCC 20805:n (FRI 4566:n) mutanttikantoja. Talaromyces dupontin identifiointia kuvaavat edelleen Cooney ja Emerson julkaisussa "Thermophilic Fungi" sekä Awao ja Mitsugi julkaisussa "Trans. My-5 col. Soc.", Japani, osa 14. Tämän kannan muita yksityiskohtia sekä sen lisääntymistä kuvataan US-patentissa 4 247 637.

Sen jälkeen kun T. dupontin viljelmä on saavuttanut solumassan toivotun asteen, biomassa poistetaan jol-10 lakin nesteen/kiinteän aineen erotusmenetelmällä, kuten esimerkiksi suodattamalla tai sentrifugoimalla, jota seuraa dekantointi. Entsyymin sisältävä liuos, esimerkiksi suodos tai supernatantti sitten konsentroidaan, seostetaan tai sitä käsitellään niiden yhdistelmällä. Esimer-15 kiksi liuos voidaan väkevöidä tavallisin menetelmin, kuten esimerkiksi ultrasuodatuksen ja/tai haihdutuksen avulla. Sitten entsyymi voidaan saostaa konsentraatista (tai liuoksesta siinä tapauksessa, ettei konsentrointia ole suoritettu) kakun tai lietteen muodossa lisäämällä 20 epäorgaanisia suoloja, kuten esimerkiksi ammoniumsulfaat-tia tai natriumsulfaattia tai lisäämällä orgaanisia liuottimia, kuten esimerkiksi metanolia, etanolia tai asetonia. Sen jälkeen kun entsyymiä sisältävä kakku on ·.*. saostettu, se voidaan liettää liuokseen, kuten esimerkik- ..25 si veteen tai puskuroituun veteen, entsyymin liuottamiseksi tai uuttamiseksi siitä, jolloin saadaan entsyymiä sisältävä uute. pH-selektiivisen eluution vuoksi, jota kuvataan tässä yhteydessä alla myöhemmin, on edullista käyttää uuttoaineena sitraatti-fosfaattipuskuria (pH 8,0) 30 entsyymin liuottamiseksi, ja sitten on toivottavaa dialy-’ ‘: soida entsyymiä sisältävä puskuroitu uute, edullisesti yli yön.

Transglukosidaasia sisältävä liuos, joka on saatu joko konsentrointimenetelmällä, seostamalla tai niiden 35 yhdistelmällä, kuten yllä on kuvattu, puhdistetaan sitten 5 87934 käsittelemällä esimerkiksi savella, kromatografiän avulla tai jollakin näiden käsittelymenetelmien yhdistelmällä.

Esimerkiksi kromatografia voidaan suorittaa antamalla transglukosidaasia sisältävän liuoksen kulkea di-5 etyyliaminoetyleeniselluloosa (DEAE-selluloosa) -pylvään läpi sopivassa pH:ssa. Transglukosidaasia sisältävä liuos tulisi puskuroida noin pH 7-9:ään, edullisesti 8:aan, ja/tai pylväs tulisi tasapainottaa noin pH 7-9:ään, edullisesti 8:aan. Tasapainotus suoritetaan edullisesti nat-10 riumsitraattifosfaattipuskurilla (pH noin 8,0). pH:ssa, joka on noin 7-9, edullisesti 8, transglukosidaasi tulee olemaan effluenttijakeissa, kun taas muut epäpuhtaudet, kuten esimerkiksi glukoamylaasi jäävät pylvääseen. Lisää transglukosidaasia saadaan talteen pesemällä pylvästä 15 suuremmalla määrällä puskuriliuosta, tilavuudella, joka on vähintään DEAE-selluloosapylvään tilavuus. Tämän tuloksena saadaan transglukosidaasiliuos, jossa ei oleellisesti ole glukoamylaasia ja muita epäpuhtauksia.

Vaihtoehtoisesti, sen jälkeen kun biomassa on 20 poistettu ravintoelatusaineesta jollakin kiinteän aineen ja nestemäisen aineen erotustekniikalla, kuten esimerkiksi niillä menetelmillä, jotka yllä on mainittu transglu-kosidaasiliuoksen saamiseksi, transglukosidaasi voidaan sitten eristää tästä liuoksesta lisäämällä savea, edulli-25 sesti hienojakoista bentoniittiä, sopivassa pH:ssa, edul-lisesti pH-alueella 3-5. Savikäsittely transglukosidaasin : ’·· poistamiseksi liuoksesta, joka sisältää sekä transgluko- : V sidaasin että glukoamylaasin, jotka ovat peräisin Asper- • : : gilluksesta tai Rhizopuksesta, on kuvattu US-patentissa 30 nro 3 042 584.

Transglukosidaasi muodostaa saven kanssa reaktio-.: tuotteen, joka koaguloituu ja saostuu liuoksen pohjalle -- jättäen glukoamylaasin liuokseen. Tämä reaktiotuote voi daan sitten erottaa liuoksesta jollakin normaalilla kiin-35 teän aineen ja nestemäisen aineen erotustekniikalla, min-:kä jälkeen transglukosidaasi eluoidaan savesta eluointi- 6 87934 liuoksella, jonka pH on sen pH-alueen ulkopuolella, jossa savi ja transglukosidaasi muodostavat saostuman, edullisesti neutraalissa tai alkalisessa pHtssa.

Transglukosidaasi, joka saadaan Talaromyces dupon-5 tista, on hyvin lämmönkestävä. Esimerkiksi 60°C:ssa aktiivisuuden pH-optimi on noin 4,5 - 5,0. Puhdistetun transglukosidaasin optimilämpötila on 70°C.

T. dupontista kyseessä olevan keksinnön mukaisesti saadun transglukosidaasin lämpöinaktivointia on ver-10 rattu Aspergillus nigeristä saadun transglukosidaasin lämpöinaktivointiin 70°C:ssa. Tarkemmin sanottuna, A. nigeristä saatu transglukosidaasi inaktivoituu 70°C:ssa jo 60 minuutin kuluttua, kun taas T. dupontista peräisin olevan transglukosidaasin aktiivisuudesta säilyy vielä 15 yli 40 %. Näitä termofiilisiä ominaisuuksia kuvataan edelleen yksityiskohtaisemmin alla esitettyjen esimerkkien taulukoissa A, B ja C.

Kyseessä olevan keksinnön mukaista transglukosi-daasia voidaan käyttää muuttamaan maltoosi trisakkaridi 20 panoosiksi sekä isomaltoosi-disakkaridiksi, jotka eivät ole käymiskykyisiä sokereita. Nämä oligosakkaridit, joita ei voida käyttää hyväksi käymisessä, voidaan muodostaa inkuboimalla maltoosia sisältävää sokeria transglukosidaasin kanssa. Käymiskykyistä sokeria, glukoosia, jota 25 myös muodostuu järjestelmässä, on normaalisti reaktio-tuotteissa. Inkuboidaan 1-6 päivän ajan 50-70°C:ssa, säilyttäen pH happamella alueella. Erittäin edullisessa ‘ suoritusmuodossa inkuboidaan 72 tunnin ajan 60°C:ssa ja : pH 4,5 :ssä (0,1 M natriumasetaattipuskuri).

30 Seuraava esimerkki valaisee kyseessä olevan kek sinnön edullista suoritusmuotoa, eikä patenttivaatimuksia ole tarkoitus rajoittaa tässä esimerkissä esitettyyn suoritusmuotoon .

Esimerkki 35 Käymisastiaan lisättiin 10 litraa nestemäistä käy- miselatusainetta, joka koostui 5 %:sta liukoista Lintner- 7 87934 tärkkelystä, 2 %:sta maissin liotusvettä, 0,5 %:sta Phar-mamediaa®, (puuvillansiemenjauho, toimittanut Trader Protein Co.), 0,5 %:sta hiivauutetta (toimittanut Difco Laboratories, Detroit, Michigan), 0,1 %:sta dikaliumfos-5 faattia, 0,05 %:sta magnesiumsulfaattia sekä 0,01 %:sta kalsiumkloridia, pH säädettynä 7,0:ksi IN NaOH:lla.

Valmistettiin viisi ymppiviljelmää siten, että käymissäiliöstä poistettiin viisi 100 ml:n suuruista erää elatusainetta, ja kukin erä sijoitettiin 500 ml:n vetoi-10 seen erlenmeyerpulloon, minkä jälkeen kaikkia viittä erää autoklavoitiin 20 minuutin ajan 121°C:ssa elatusaineen steriloimiseksi. Sitten kukin steriloitu näyte ympättiin Talaromyces dupontin kannalla ATCC 20805 (FRI 4566) ja ravisteltiin pyörivässä ravistelijassa 6 tunnin ajan 15 40°C:ssa. Viisi näytettä yhdistettiin sitten, jotta saa tiin noin 500 ml. Jäljelle jäänyttä elatusainetta kuumennettiin sitten käymisastiassa, 12l°C:ssa, 20 minuutin ajan, ja se ympättiin 500 ml:11a T. dupontin kantaa ATCC 20805 (FRI 4566) ja sitä ravisteltiin 40°C:ssa seitsemän 20 päivän ajan. Käymisen lopussa huovasto poistettiin suodattamalla koko käymisliemi, jotta saatiin käyttöön solu-ton suodos.

Liete sekoitettiin lisäämällä suodokseen kiinteää ... amoniumsulfaattia 70-%:iseen kyllästykseen saakka. Saos- ' · 25 tuma poistettiin sentrifugoiden, jonka jälkeen superna-

tanttineste dekantoitiin. Entsyymi liuotettiin saostumas-" ta 200 mlrssa 0,05 M sitraatti-fosfaattipuskuria (pH

: .- 8,0), ja sitä dialysoitiin yön yli samaa puskuria vas- " taan. Dialysoidun näytteen annettiin kulkea DEAE-sellu- * 30 loosapylvään läpi, joka oli tasapainotettu 0,1 M natrium- sitraattifosfaattipuskurilla (pH 8,0). Pylvästä pestiin lisäksi tulevalla puskurilla (pH 8,0), tilavuudella, joka oli kaksi kertaa DEAE-selluloosapylvään tilavuus. Trans-glukosidaasi oli effluenttijakeissa, kun taas glukoamy-’ ‘ 35 laasi ja muut epäpuhtaudet pysyivät DEAE-selluloosan kanssa pylväässä. Transglukosidaasia sisältävät jakeet 8 87934 koottiin yhteen, ja niitä dialysoitiin yön yli deionoitua vettä vastaan. Polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin lasiputkessa (0,5 x 7 cm), joka sisälsi 7,5 %:ista geeliä, käyttäen 2mA:n (milliampeeri) virtaa put-5 kea kohti 1,5 tunnin ajan, huoneenlämpötilassa, Tris-gly-siinipuskurissa (pH 8,3), menetelmän mukaisesti, jota on kuvannut B. J. Davis julkaisussa "Annals New York Acad. Sei.", osassa 121, sivulla 404, 1964). Eristetty trans-glukosidaasinäyte oli erittäin puhdas.

10 Puhdistettua transglukosidaasia käytettiin osit taiseen karakterisointiin ja panoosin muodostamiseen. Transglukosidaasiaktiivisuus määritettiin mittaamalla kvantitatiivisesti, nestekromatografian perusteella transglukosyylituote, esimerkiksi panoosi entsyymin inku-15 baatioseoksessa ja maltoosi pH 4,5:ssä ja 60°C:ssa, mikä on Pazur et ai.:n kuvaaman menetelmän muunnos, joka menetelmä on esitetty julkaisussa "Archives of Biochemistry and Biophysics", osassa 93, sivuilla 43-49 (1961). Trans-glukosidaasiaktiivisuuden yksikkö määritellään sinä mää-20 ränä entsyymiä, joka tuottaa yhden mikromoolin panoosia tunnissa 20-%:isesta (paino/tilavuus) maltoosi-liuoksesta pH 4,5:ssä ja 60°C:ssa. Transglukosidaasiaktiivisuuden suodoksessa havaittiin olevan 20 yksikköä millilitraa kohti. Ei-käymiskykyisten oligosakkaridien muodostus mal-; ·' 25 toosista suoritettiin seuraavasti: 4,0 ml 25-%:ista mal- toosiliuosta (pH 4,5) inkuboitiin 1,0 ml:n kanssa entsyy-miliuosta (2,6 yksikköä/ml), 72 tunnin ajan 60°C:ssa ja pH 4,5 :ssä (puskuroitu 0,1 M natriumasetaatilla). Hiili-hydraattikoostumus kaasukromatografialla määritettynä oli 30 seuraava: 22,6 % glukoosia, 46,4 % maltoosia, 6,5 % iso-maltoosia sekä 24,6 % panoosia.

.·. ; Tätä transglukosidaasia verrattiin sitten trans- λ. glukosidaasiin, joka oli peräisin Aspergillus nigeristä.

A. nigeriä koskevat tiedot otettiin Pazur et ai.:n yllä 35 mainitusta julkaisusta. Kuten taulukossa A esitetään, op-timi pH tämän entsyymin aktiivisuudelle on noin 4,5 - 5,0 9 87934 60°C:ssa, kun taas A. nigeristä saadulle transglukosidaa-sille se on 3,5 30°C:ssa. Taulukko B ilmaisee lämpötilan vaikutuksen transglukosidaasin aktiivisuuteen. Tämän puhdistetun entsyymin optimilämpötila on 70°C. Taulukko C 5 vertaa T. dupontista ja A. nigeristä saatujen transgluko-sidaasien termisen inaktivoitumisen käyriä, jotka on määritetty 70°C:ssa. Kuten tässä taulukossa esitetään, kyseessä oleva entsyymi kestää lämpöä paljon paremmin kuin transglukosidaasi, joka on peräisin A. nigeristä.

10 87934 λ -μ 01 >ι -H M ·· 4-> <#>

01 I

I -H O

+1 g CM

m 0)

Λ Xi C

3 O d) tn O :id •H -p (0 (0 4->

•H

tn m-ι :id O O Λ o -P tn id i—i <1) tn O TJ« I Id >01

^ TT g -H

r- xi o — υ o »MO df> > ro O t- r- nj =

- ΙΟ ΓΜ ,H G

Ό -H - -H

ω -p iö -h

\ 4J -P

CD o tn 4-» Φ m *? i C 3d)

d> D v °o -H oi -P

-P m <d -H -H

0 ω cm <d p 3 — a: :rd 01 H -H H :(d H o oo *— rö -M 3 £ > > v σι m -p-p-H-r-i •nm tn (d -P oi < -H H -H (d -P C 3 -P ·· -p <d o 3 O a: h λ> ai td Ό tn

Ai id mo ίο i tn -P G -h

Ai -h H ·* o m o <d d) <> G οι *3* *— m g tn -h h rd m 3 (d o -h 3 <d C -H i Ai 4-1 id t) <d o T- ro d) p tn -ha!

Eh -h *· r·^ r·^ Md -p ·η ^ td · tn "«j* +i id M (d aj 0 -p C H Ό id c

M 2 >i id oi -H

3 :rd S S En oi -p

r-H M m oo o Ai 0-P

tn «. m o T- r- id -ro id tn 2 ro <— id «· *· ·γο id C tn o o * p

id h oi c <- -P

p o τι* ······ -h vo tn

-P D * I 00 O O O M σι D

ro O » - 3 *— 3 01 j o m r- n tn - - 3 m id ·» P W i i Λ σ> id 3 m oo G tj* -h

Ai W * i i -h mo ·ιοι

•H in -H *· *· CM ro O

;-· id En -Proto ttO

> -P · -P

K d) « K D - -H

C o| «- -P CM CM ro d

•.: ·· D ·* li m -h 3 oi E

K <N| P +J

a· in :id -p - — :id a; - tn ·· g -P tn 3 K 0 0 3

Pu tn tn -h > : 3 o G tn id

* * 3 3 O >i *H

•H I -H I -H 01 -H Xi -H

P3U1P301 -HldrH -P CM -P

G r-l Id 0) *H Id >g-h 00\

Otnidt^tnid ·η ·ηρ Ό-Η0

CM 01 Ό -H 01 Ό -H 4-13 d)CQC

3 C -H G C -H -P 4-1 Ai -H -H

Ό id tn idtn Ai id tn E-t Ό id

·ΡΟ·ΡΟ < td 3 * G CM

En-PAi<-PAi*PCM * 3 — n 87934

Taulukko B

Lämpötilan vaikutus T. dupontin transglukosidaasin aktiivisuuteen, määritetty käyttämällä 20-%:ista (paino/tilav.) 5 maltoosia, joka on puskuroitu pH 4,5reen 0,1 M:n natriumase-taattipuskurin avulla Lämpötila (°C) Suhteellinen aktiviisuus (%) 40 12,6 10 50 24,4 60 48,9 70 100,0 80 64,9 90 0,0

15 Taulukko C

Transglukosidaasin lämmönkestävyys

Transglukosidaasin jäännösaktiivisuus tietyn ajan 20 mittaisen inkuboinnin jälkeen 70°C:ssa

Min. 15 30 45 60 120 T. (Itiponl i ‘r transgluko- 25 sidaasi (pH 4,5:ssä) 78,5 % 68,8 % 62,4 % 41,9 % 32,3 % -- - A. niger transgluko- sidaasi 30 (pH 4,0:ssa) 17,2% 6,3% 4,7% 3,1% 0%

★ Q

Trasglukosidaasin lämmönkestävyyskokeet suoritettiin 70 Crssa 0,1 M asetaattipuskurissa (vastaavasti pH 4,5 ja pH 4,0), substraatin poissaollessa.

Claims (13)

12 87934

1. Menetelmä lämmönkestävän 1,4-a-D-glukaani-6-a-glukosyylitransferaasin (transglukosidaasin) valmistami- 5 seksi, jonka transglukosidaasin aktiivisuuden optimi-pH on 4,5 - 5,0 ja jäännösaktiivisuus on yli 40 % 60 minuutin kuumennuksen jälkeen 70°C:ssa pH:ssa 4,5, tunnettu siitä, että viljellään Talaromyces dupontin kantaa sopivassa ravintoelatusaineessa ja transglukosi-10 daasi eristetään siitä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään T. dupontin kantaa ATCC 20805 (FRI 4566).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että transglukosidaasi eristetään ravintoelatusaineesta: a) poistamalla biomassa ravintoelatusaineesta, jolloin saadaan transglukosidaasia sisältävä liuos, b) käsittelemällä liuosta seostamalla siitä trans- 20 glukosidaasia sisältävä kakku, jonka jälkeen transgluko sidaasi uutetaan siitä, jolloin saadaan transglukosidaasia sisältävä uute, c) puhdistamalla transglukosidaasia sisältävä uute; ja 25 d) ottamalla puhdistettu transglukosidaasi talteen olennaisesti puhtaana glukoamylaasin ja muiden epäpuh-tauksien suhteen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, "... tunnettu siitä, että vaihetta (b) edeltää tai 30 seuraa väkevöinti.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, '··' tunnettu siitä, että puhdistus vaiheessa (c) suo ritetaan johtamalla vaiheesta (b) saatu, käsitelty trans-- glukosidaasia sisältävä uute DEAE-pylvään läpi sopivassa : : 35 pHtssa ja vaihe (d) suoritetaan ottamalla talteen trans glukosidaasia sisältävä effluentti pylväästä. * · · 13 87934

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) biomassa poistetaan ra-vintoelatusaineesta, jolloin saadaan transglukosidaasia sisältävä liuos, (b) transglukosidaasi eristetään trans- 5 glukosidaasia sisältävästä liuoksesta lisäämällä siihen hienojakoista savea sopivalla pH-alueella, jolloin transglukosidaasi muodostaa reaktiotuotteen saven kanssa, ja (c) saven ja transglukosidaasin reaktiotuote otetaan talteen liuoksesta jollakin kiinteän aineen ja nestemäisen 10 aineen erotustekniikalla.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen (d) transglukosidaasin eluoinnin reaktiotuotteesta eluentil-la, jonka pH-alue on sen pH-alueen ulkopuolella, joka saa 15 aikaan saven ja transglukosidaasin välisen reaktiotuot teen muodostumisen vaiheessa (b).

8. Lämmönkestävä transglukosidaasi, tunnet-t u siitä, että sitä valmistetaan T. duponti -lajiin kuuluvan sienen avulla, sen aktiivisuuden optimi-pH on 20 4,5 - 5,0, ja sen jäännösaktiivisuus on yli 40 % 60 mi nuutin kuumennuksen jälkeen 70°C:ssa pH:ssa 4,5.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen transglukosidaasi, tunnettu siitä, että sitä valmistetaan T. duponti -kannan ATCC 20805 (FRI 4566) avulla.

10. Menetelmä maltoosin muuttamiseksi ei-käymis- :·.·. kelpoisiksi ja käymiskelpoisiksi sokereiksi, tunnet- t u siitä, että maltoosi saatetaan kosketukseen transglu-" kosidaasin kanssa, joka on valmistettu patenttivaatimuk- . sen 1 menetelmän mukaisesti. ; 30 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kosketus maltoosin kanssa käsittää olennaisesti maltoosin inkuboinnin transglukosidaasin kanssa 1-6 päivän ajan, 50-70°C:ssa happamassa pH:ssa, sekä glukoosin, maltoosin, isomaltoosin sekä pa-• ; . 35 noosin talteenoton. 14 87934

12. Patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä valmistetun transglukosidaasin käyttö maltoosin muuttamiseksi ei-käymiskelpoisiksi ja käymiskelpoisiksi sokereiksi.

13. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen, T. duponti -kannan ATCC 20805 (FRI 4566) tuottaman, lämmönkestävän 1,4-a-D-glukaani-6-a-glukosyylitransferaasin (transglukosidaasin) käyttö maltoosin muuttamiseen ei-käymiskelpoisiksi ja käymiskelpoisiksi sokereiksi. 10 is 87934