JPH02211868A - 細菌アルカリプロテアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、洗剤用添加酵素として有用である至適ＰＨが
アルカリ側にあるアルカリプロテアーゼを効率よく製造
する方法に関し、更に詳しくはバチルス属に属するアル
カリプロテアーゼ生産菌の突然変異株でスペクチノマイ
シン耐性を有する株を用いて効率よくアルカリプロテア
ーゼを製造する方法に関する。

（従来の技術） 洗剤用アルカリプロテアーゼの生産菌に関しては、従来
より多くの菌株が報告されており、その一部は工業的に
生産されている。例えば、特公昭５１−８４０１、特公
昭５３−１３７０８、特公昭４７−５０３９２などには
、洗剤用アルカリプロテアーゼを生産する方法が記載さ
れている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、これらの菌株によるアルカリ土類金属−ゼの生
産性は産業上の利用に対し、必ずしも満足されるべきも
のではなく、これらアルカリプロテアーゼを一層効率よ
く製造する方法の確立が強く求められている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、長年バチルス属のアルカリプロテアーゼ
生産菌について研究を行った結果、バチルス属のアルカ
リプロテアーゼ生産菌の人工あるいは自然突然変異株で
スペクチノマイシン耐性を有する菌株がアルカリプロテ
アーゼを培地中に著量生産することを見いだした。尚１
本発明におけるスペクチノマイシン耐性とは普通のバク
テリアでは本来生育できないような濃度のスペクチノマ
イシン存在下でも生育が可能な性質である。この場合の
耐性の程度は菌株の種類により異なるが一般には数ＰＰ
ｍ程度である。バチルス属のアルカリプロテアーゼはそ
のｐＨ依存性により一般に３種のタイプ、即ち、ｐＨ９
以上に至適ｐＨを有しＰＨ１２前後の高アルカリ性条件
下でも活性低下が余りないタイプ（Ａ）、アルカリ側に
至適ＰＨを有しｐＨ１２前後の高アルカリ性条件下では
活性が至適ｐＨでの活性に比べて半分近く低下するタイ
プ（Ｂ）、アルカリ側に至適ｐＨが有るが高アルカリ性
条件下では活性の低下が著しいタイプ（Ｃ）に分けられ
ることもあるが１本発明者らがこれら３種のタイプ（Ａ
、　　Ｅ、　　Ｃ）の各種のアルカリプロテアーゼの生
産菌について検討した結果。

全てのタイプのアルカリプロテアーゼ生産菌について上
記の効果が認められた。

これらスペクチノマイシン耐性菌は例えば１次のように
して得られる。すなわち耐性を付与したいアルカリプロ
テアーゼ生産菌（親株）を適当な培地に生育させ、その
菌体を紫外線、Ｘ線などの照射、あるいはＮ−メチル−
Ｎ’　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
アクリジンオレンジ、Ｐ−ジメチルアミノベンゼンスル
ホン酸などの既知の突然変異誘発物質で処理し、適当に
洗浄希釈して１ｗＬ株の生育できない濃度、例えば、数
ｐｐｍ程度のスペクチノマイシンを含む寒天培地に広げ
、生育してくるスペクチノマイシン耐性株のコロニーを
得る。このようにして得られたスペクチノマイシン耐性
株の大部分は、Ｒ株に較べ多量のアルカリプロテアーゼ
を生産するので、これらの耐性株の中から、高アルカリ
プロテアーゼ生産性菌株を得ることができる。本発明で
用いられるアルカリプロテアーゼ生産菌の代表的な例と
して具体的に例示すれば、例えば、バチルスＳＤ５０１
より得られたバチルスＳＤ５１１（？ｓ工研菌寄第１０
４２２号）、バチルスＳＤ５０４より得られたバチルス
ＳＤ５１２（ｌｆｉ工研菌寄第１０４２３号）、バチル
スＳＤ５０５より得られたバチルスＳＤ５１３（微工研
菌寄第１０４２４号）、バチルスＳＤ５０７より得られ
たバチルスＳＤ５１４（１１１工研菌寄第１０４２５号
）、バチルスＳＤ５０８より得られたバチルスＳＤ５１
５（微工事研菌寄第１０４２６号）、バチルスＳＤ５０
９より得られたバチルスＳＤ５１６（微工研菌寄第１０
４２７号）、およびＮＣｌＢ１０２９７より得られたバ
チルスＳＤ５１７（＊１研菌寄第１０４２８号）等が挙
げられる。

バチルスＳＤ５０１．　　同ＳＤ５０４、同ＳＤ５０５
、同ＳＤ５０７については、特願昭６２−３２１５５７
に記載されている。ＮＣｌＢ１０２９７はイギリス国Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄＭａｒｉｎｅ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉａ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、５ｃｏｔｌａｎｃｌ
より取り寄せたタイプカルチャーである。バチルスＳＤ
５０８及び同５０９は、本発明者らが土壌より分離した
新菌株である。これら菌株のスペクチノマイシン耐性株
、バチルスＳＤ５１１、同ＳＤ５１２．同ＳＤ５１３、
同ＳＤ５１４、同ＳＤ５１５、同ＳＤ５１６及び同ＳＤ
５１７の菌学的性質はスペクチノマイシンに対する耐性
波及びアルカリプロテアーゼの生産性以外の検討項目に
ついては各々の親株と実質的に同一である。これらスペ
クチノマイシン耐性株の性質を３１１表に示す。

次にこれらのスペクチノマイシン耐性株の取得について
、実験例で示すがこれは単なる例示であり１本発明で用
いられるスペクチノマイシン耐性株は他の方法によって
得られたものでも良い。

１腋旌１ バチルスＳＤ５０１．同５０４．同５０５．同５０７、
同５０８．同５０９．ＮＣｌＢ１０２９７を各々培地組
成１の斜面培地を用い３５℃で１６時間培養し、その１
白金耳量を、寒天を含まぬ培地組成１の液体培地をモル
トン栓付き１８ＩＩＩ１口径の試験管に５ａ＋１入れた
ものに接種した。これを６時間培養し、遠心分離を行い
、得られた菌体を生理食塩水に懸濁し、終濃度１１００
ＰＰになるようにＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液を加え、１０分間３５℃
に放置した０次に、遠心分離により菌体を集め、生理食
塩水で洗浄し、寒天を除いた培地組成１の液体培地で３
５℃１６時間振盪培養した。この培養液をスペクチノマ
イシンをｌｏｐｐｍ含有する培地組成ｌの平板培地に１
枚のシャーレあたり生菌が約１０６になるように希釈し
て撒いた。３５℃で１〜７日間程度培養し生育してきた
菌の集落はその大部分がスペクチノマイシン耐性株であ
った。この集落から、１種類の親株につき５０株ずつ釣
菌し。

全ての株及び各親株を培地組成２の液体培地で３５℃、
２０時間振盪培養し、生成したアルカリプロテアーゼ活
性を測定した。その結果、得られたスペクチノマイシン
耐性株の約９５％でアルカリプロテアーゼの生産性が親
株を上回っており、最も高い活性の見られたバチルスＳ
Ｄ５１１．　同ＳＤ５１２．同ＳＤ５１３．同ＳＤ５１
４．同ＳＤ５１５、同ＳＤ５１６．同ＳＤ５１７のアル
カリプロテアーゼ生産性は各親株の１．５〜３倍であっ
た。

培地組成１　ペプトン　　　　　　１　％酵母エキス　
　　　　０．５％ 塩化ナトリウム　　　０．５％ 炭酸ナトリウム　　　０．３％ 寒天　　　　　　　　２　％ 本発明で利用される培地は、用いる菌株が増殖し得るも
のならば任意のものでよく、例えば、炭素源としてはグ
ルコース、マルトース、シュークロース、＊酸、エタノ
ール、グリセリンなど、窒素源としては大豆粕、ふすま
粕、胡麻粕、コーンスチープリカーなどの有機窒素源、
硫酸アンモニュームなどの無機窒素源が用いられる。ま
たこの他にリン酸塩、カリ塩、カルシウム塩、炭酸ナト
リウム、鉄塩、マンガン塩などの無機塩類が添加される
。

本発明おける培養は好気条件下に、例えば１通気攪拌法
や振盪培養法によって行う。

培養温度は２０〜４０℃のいずれでも良いが生育の最も
良好な３０〜３７℃が好ましい、培養時のｐＨについて
は、培養全期を通してｐＨ６〜１１で良いが、初発ｐＨ
は８〜１０．５が好ましい。

培養時間は２０〜６０時間程度で実施する。培地組成、
培養電性によりスペクチノマイシン耐性株のアルカリプ
ロテアーゼの生産性は大きく変動すｉるが、いかなる培
養条件においても各々の親株の１．５〜３倍のアルカリ
プロテアーゼを生産する。

培養後得られた培養液を公知の方法で処理することによ
り目的とするアルカリプロテアーゼが得られる０例えば
遠心分離により菌体を除いた培養液に終濃度８０％のエ
タノールを加え、沈澱したアルカリプロテアーゼを遠心
分離によって得、これを蟻酸アンモニウム溶液などの適
当な溶液に透析し真空凍結乾燥して粗アルカリプロテア
ーゼ粉末を得る。更に粗アルカリプロテアーゼ粉末を水
溶液としセファデックスＧ−７５等によるゲル濾過、Ｄ
ＥＡＥ−セブアデンクス、ＣＭ−セファデックス等によ
るイオン交換クロマトグラフィーにより分画して精製プ
ロテアーゼを得ることができる。

本発明で得られるアルカリプロテアーゼの活性は公知の
方法により測定する。すなわち検液を０゜１Ｍ炭酸ナト
リウム−ホウ酸−塩化カリウムａｍ液（ｐＨ１ｏ）で適
当に希釈し、その０．　５ｍｌにｐＨ１ＯＮＯ２％ミル
クカゼイン溶液０．　５＋ａｌを加えて、３０℃で１０
分間酵素反応させる１反応の停止は０．１Ｍ）リクロル
＃酸を含む０．２Ｍ＃酸−０，２Ｍ＃酸ナトナトリウム
溶液２１を加えて行う、３０℃、２０分間以上放置後ろ
紙を用いてろ過し、ろ液に０．４Ｍ＃ＪｉｌＭ＃リウム
５ｍｌ、および５倍希釈のフェノール試薬１ｍｌを添加
し、３０℃２０分間放置して発色させ６６０ｎｍにおけ
る吸光度を測定する。

酵素単位は国際委員会のエンザイムノーメンクレイチャ
ーに従い、３０℃でｐＨ１０で基質であるカゼインから
１秒間にチロシン１モル相当量の６６Ｏｒ＋ｍに於ける
発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離するアルカ
リプロテアーゼ量を１カタール（Ｉ　Ｋａｔａｌ）とす
る。

本発明においてバチルスＳＤ５０１．　　同ＳＤ５０４
、同ＳＤ５０５ｉ　同ＳＤ５０７およびＮＣｌＢ１０２
９７のスペクチノマイシン耐性株により、前記タイプＣ
のアルカリプロテアーゼが生産される。これらのアルカ
リプロテアーゼは分子量はゲル渡過て約２万強のセリン
プロテアーゼで、ｐＨ１０付近に高い安定性と活性を有
する。また、４０℃で１０分間の加熱では失活しない。

さらに、ヘモグロビンに対し高い基質特異性を示す。

バチルスＳＤ５０８のスペクチノマイシン耐性株により
前記タイプＣのアルカリプロテアーゼが生産される。こ
れは分子量はゲル渡過で約２．４万のセリンプロテアー
ゼでｐＨ１０〜１２の特に高アルカリ域において高い安
定性と活性を示す点に特徴がある。

バチルスＳＤ５０９のスペクチノマイシン耐性株により
前記タイプＢのアルカリプロテアーゼが生産される。こ
れは分子量約３万のセリンプロテアーゼで、ｐＨ９〜１
０で高い安定性と活性を有する。

次に本発明の実施例を示すが、当然の事ながら本発明の
範囲がこれらに限定されるものではない。

実１１例」− バチルス属ＳＤ５１１〜ＳＤ５１７、及びこれらの菌株
の親株であるバチルス属ＳＤ５０１，ＳＤ５０４．ＳＤ
５０５，ＳＤ５０７，ＳＤ５０８゜ＳＤ５０９及びＮＣ
ｌＢ１０２９７を前記培地組成１の斜面培地で３５℃、
１６時間培養し、その−白金耳を寒天を含まぬ培地組成
１の液体培地をモルトン栓付き１８ｍｍ口径試験管に５
ｍｌ入れたものに接種した。これを３５℃で６時間培養
し、対数増殖期後期に達した培養液をＯ，１ｍｌ採取し
て培地組成２の液体培地を同寸試験管に５　ｍ　ｌ入れ
たものに植え継いだ。

３５℃で振盪培養し、２１，２３．２５時間で培養液の
各々０．２川１を採取し、０℃、８，０ＯＯＧで１０分
間遠心分離して、その上清について前記の方法によりプ
ロテアーゼ活性を測定した。各時間におけるプロテアー
ゼ活性は次の第２表のようであった。

培地組成２　大豆粕　　　　　　　２　％マルトース　
　　　　２　％ 燐酸水素２カリウム　０．５％ 硫酸マグネシウム　　０．０５％ 炭酸ナトリウム　　　１　％ （各々の培地はオートクレーブにより１２０℃、２０分
のＩＩｉ菌を行った。） 実１１１２ バチルス属ＳＤ５１１〜５１７菌株を培地組成１の斜面
培地で３５℃、１６時間培養し、その１白金耳量を、寒
天を含まぬ培地組成１の液体培地を綿栓付き５００ｍ１
容エルレンマイヤーフラスコに１００ｍ１入れたものに
接種した。これを３５℃で１６時間培養し、対数増殖後
期に達した培養液を全量、５リットル容ジャーファーメ
ンタ−に培地組成３の培地を２リツトル入れたものに植
え継ぎ、温度３５℃、初発ｐＨ１０，３、通気量１リツ
トル／ｍｉｎで６０時間通気攪拌培養した。

培地組成３　　大豆粕　　　　　　６％マルトース　　
　　６％ リン酸二カリウム　０．５％ 硫酸マグネシウム　０．０５％ 炭酸ナトリウム　　１％ （オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した）培養
開始後、２４．３６．４２．４８．６０の各時間で培養
液ヲ５ｍｌずツ採取り、、０℃、１００００Ｇ、１０分
間ノ遠心分離の後上清のプロテアーゼ活性を測定した。

各時間におけるプロテアーゼ活性は、第３表のようであ
った。

〔比較例〕

バチルス属ＳＤ５０１，ＳＤ５０４−、ＳＤ５０５．Ｓ
Ｄ５０７，ＳＤ５０８．ＮＣｌＢ１０２９７を実施例２
と同じ方法で培養し、活性を測定した。各時間における
プロテアーゼ活性は次の第４表のようであった。

第２表 活性の単位はｎＫＡＴＡＬ／＠ｌ培養液区多摩用２−２
４−２５ 昭和電工株式会社生化学 研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌
   の人工あるいは自然突然変異株でスペクチノマイシンに
   対する耐性を有する菌株を培養し、培養物からアルカリ
   プロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロ
   テアーゼの製造法。
2. （２）スペクチノマイシンに対する耐性を有するバチル
   ス属に属する新規アルカリプロテアーゼ生産菌株　バチ
   ルスＳＤ５１１、バチルスＳＤ５１２、バチルスＳＤ５
   １３、バチルスＳＤ５１４、バチルスＳＤ５１５、バチ
   ルスＳＤ５１６又はバチルスＳＤ５１７。
3. （３）菌株としてバチルスＳＤ５１１、バチルスＳＤ５
   １２、バチルスＳＤ５１３、バチルスＳＤ５１４、バチ
   ルスＳＤ５１５、バチルスＳＤ５１６又はバチルスＳＤ
   ５１７のうち少なくとも１株を用いることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。