JPH0423983A - アミラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なアミラーゼとその製造法及びアミラーゼ
生産性微生物に関する。

［従来の技術］ アミラーゼは、でんぷんまたはその部分分解物に作用し
てα−１，４−グリコシド結合を分解する加水分解酵素
である。工業的には、でんぷん加工、食品加工、繊維加
工、醸造、医薬、臨床検査などに広く利用されており、
その起源も微生物、植物、動物と多岐にわたる。

アミラーゼの別の用途として、洗剤への配合の有用性が
示されている。具体的には、洗濯用洗剤、自動食器洗い
機用洗剤などへの配合があげられるが、使用時の条件を
考えると、アルカリに至適ｐＨを持ち、熱に対する安定
性が優れていることが望まれる。しかしながら、現在工
業的に使用されている酵素は−　すべで中性アミラーゼ
であり。

洗剤への配合という目的にかなった酵素はまだ無い。し
たがって、すでに市販されている洗剤配合酵素もすべて
中性アミラーゼであり、耐熱性という点では問題無いが
、十分に機能しているとは言い難い。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、至適ｐＨがアルカリ側にあり、高温、界面活
性剤存在下でも十分に活性を保持するアミラーゼを提供
しようとするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は上記のような性質を有するアミラーゼを得
るべく、多数の微生物を分離・培養して検索した結果、
熊本県下の土壌を１％炭酸ナトリウム、１％ポテトスタ
ーチと混合し、６５℃に２週〜６週放置した後に分離し
たバチルス属に属するバクテリアバチルスｓｐ、Ｓ　Ｄ
　７７１株が洗剤用酵素として優れた性質を有する新規
アミラーゼを生産することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。

即ち、本発明は１）可溶性でんぷんを基質とした場合の
至適ｐＨが９〜１１、至適温度が約７０℃で、２）安定
ｐＨ領領域５０℃、３０分処理したときｐＨ６−１２で
あり、３）３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム存在下（ｐ　Ｈ９，０）で３０℃、２
時間処理しても９０％以上の残存活性を有するなど、界
面活性剤に対しても極めて安定であり、４）分子量はＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た場合４５，０００であり、そして５）等電点はポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により測定した場合４．２
５である新規なアミラーゼ；バチルス属の上記アミラー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目
的のアミラーゼを採取することを特徴とする上記アミラ
ーゼの製造法；及び上記アミラーゼ生産能を有するバチ
ルス属の新規な菌株を提供せんとするものである。

以下に本発明のアミラーゼとその製造法およびこれに用
いる新規な菌株についてさらに詳しく説明する。

１及１ 本発明のアミラーゼの製造のために使用する微生物は、
前記の性質を有するアミラーゼを生産することが出来る
バチルス属に属するバクテリアであり次のような性質を
有する。

（ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ　　桿菌、０．３〜０．７　Ｘ　
３〜６μｍ、培養条件により 多連銀を生じる。

■運動性の有無　　　　　有り ■胞子　　　　　　　　　細胞の先端に円形で膨出した
胞子のうを形成 する。

■ダラム染色　　　　　　陽性 （ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　　コロニーは淡黄色、半透明。

円形、偏平状で 周縁は波状。

■肉汁寒天斜面培養 ■肉汁液体培養 ■ゼラチン液化 （ｃ）生理学的性質 の硝酸塩の還元 ■■Ｐテスト ■デンプンの加水分解 ■クエン酸塩の利用 ■カタラーゼ ■生育の範囲（ｐＨ） （温度） ■酸素に対する態度 生育するがあまり良く ない。

底部に菌体の沈澱を形 成する。培地は濁らず、 着色もしない。

陰性。

還元しない。

陰性 陽性 陰性 陽性 ７．５で生育するが、６．８ で生育しない。

１０．３で生育する。

５０℃で生育するが、４０ ℃で生育しない。７０℃ で生育するが、７１℃で 生育しない。

好気的 ■糖類の酸化とガスの生成 （１）Ｌ−アラビノース （２）Ｄ−キシロース （３）Ｄ−グルコース （４）Ｄ−マンノース （５）Ｄ−フラクトース （６）Ｄ−ガラクトース （７）麦芽糖 （８）シ　ヨ　糖 （９）乳　　糖 （１０）　　）レバロース （１１）叶ソルビット （１２）　Ｄ−マンニット （１３）イノジット （１４）グリセリン （１５）デンプン ■５％食塩存在下での生育 ［相］菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 陰性 ４８％（モル％） 以上の苗字的性質から、本菌はバチルス属に属する細菌
と同定された。しかし、本菌は高温かつアルカリ側のみ
生育を示す菌であり、これらの特徴を示す菌種について
の記載はバーシーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジ（Ｂｅｒｚｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
−ｇｙ）、およびザ・ジーナス・バチルス（丁ｈｅ　Ｇ
ｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ　　ＬＩＳＤＡ　Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　Ｎｏ、４２７）にはなく、新規な菌株であるこ
とが認められた。そこで、バチルスｓｐ、Ｓ　Ｄ　７７
１と命名され、微工研菌寄第１１４５５号として寄託さ
れた。　なお、総置に記載のある類似菌と、本菌との主
な性状の相違を以下に示す。

（１）アルカリ側でのみ生育を示す菌。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ本菌 胞子の形　　　　　　　　　楕円形　　　円形４０℃で
の生育　　　　　　　　十 ５０℃での生育　　　　　　　　　　　　　　生菌体内
ＤＮＡのＧＣ含ｊｉ　　　　　　　３７　　　　４８高
温側でのみ生育を示す菌。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ 楕円形 ＋ ＋ 本　　菌 胞子の形 嫌気下での生育 Ｐ）１６．８での生育 ６５℃での生育 円形 ＰＦ１６．８での生育 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ ＋ ６４〜６５ 胞子の形 ゼラチン液化 ｐＨ６，８での生育 ４０℃での生育 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ楕円形 ＋ 十 ＋ 本　　菌 円形 培」【１Ｌ法 本発明のアミラーゼを製造するにあたって、上記の微生
物の培養のための培地は格別である必要はなく、栄養源
としては通常培養に用いられているものが広く利用でき
る。炭素源としては同化できる炭素化合物またはこれを
含有するものであれば良く、たとえばグルコース、マル
トース、でんぷんなどが用いられる。窒素源としても同
化可能な窒素化合物、またはこれを含有するものであれ
ば良く、例えばペプトン、大豆粉、Ｃ８Ｌなどが用いら
れる。また、無機塩類としては燐酸塩、マグネシウム塩
などの塩類が使用される。その他、菌の生育及び酵素生
産に必要な各種の有機物、無機物、またはこれらを含有
するもの、例えば酵母エキス、ビタミン類などを培地に
添加することが出来る。培養は、液体培養が好ましく、
培養条件は培地組成により異なる。生産の目的物である
アミラーゼの生産に最も有利な条件は、好気的な条件下
培養温度が約６０℃であり、培養時間は１２時間から３
日程度であり、アミラーゼの生産量が最高に達したとき
に培養を終了すれば良い。培地のｐＨは８以上が良＜、
　　９．　５〜１０がアミラーゼ生産に好適である。本
発明のアミラーゼは主として培養液中に分泌され、蓄積
される。

亀１ｉ１１ 得られた培養液からのアミラーゼの採取は、酵素を取得
するための常法にしたがって分離、精製することができ
る。ろ過、遠心分離など適当な方法により、培地中の菌
体など固形物を分離して上清液を得ることが出来る。こ
の分離液を濃縮し、噴霧乾燥する方法、凍結乾燥する方
法、塩析法、親水性有機溶媒での沈澱法などによりアミ
ラーゼを得ることが出来る。さらに、酵素を精製するに
は、イオン交換樹脂、ゲルろ過払などの精製手段を単独
または複数組み合わせる方法がある。

１１坐立１ 本発明のアミラーゼについて、その詳細な性質を記載す
る。

１、酵素力価の測定方法。

可溶性でんぷんの１％水溶液を基質として用い測定する
。具体的には、緩衝液０．５ｍｌに基質０．５ｍｌを加
え、所定温度で数分インキュベートした後酵素液を０．
０５＋ｎｌ加え反応を開始する。１０分後、ＩＮ塩酸を
１■１加えることで反応を停止する。反応を停止した液
から０．４ｍｌを分取し、５ｍｌの水で希釈する。

これに０．５％沃素−沃化カリウム溶液０．１２５ｍ１
を加え発色させた後、波長７００ｎｍで比色定量する。

酵素力価は、上記の条件で１分間に未反応状態のでんぷ
んと沃素の発色による吸光度の１０％相当を減少させる
酵素量を０．１単位とした。

２、酵素の性質 （１）作用 本酵素は、でんぷんあるいはその部分分解物に作用して
、α−１，４−グリコシド結合を加水分解し、主として
デキストリン、及びマルトオリゴ糖を生成する。また、
その分解は、エンド型である。

（２）至適ｐＨ ブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域緩衝液（ｐＨ６〜１２）を用い、可溶性で
んぷんを基質として３０℃で活性測定した場合、９〜１
１である。反応ｐＨと活性との関係を第１図に示す。

（３）安定ｐＨ範囲 ブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域緩衝液（ｐＨ３〜１２）を用い、各ｐＨで
５０℃、３０分間放置した後、３０℃、ｐＨ１０での活
性を測定した。安定ｐＨは６〜１２である。処理ｐＨと
残存活性との関係を１１２図に示す。

（４）至適温度 ５０ｍＭ　　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９）を用いて測定し
た場合、至適温度は約７０℃である。反応温度と活性と
の関係を第３図に示す。

（５）熱安定性 ５０ｍＭ　　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９）の下で、各温度
（３０℃〜８０℃）で１０分間熱処理し、水冷後３０℃
での残存活性を測定した。２　ｍ　Ｍ　エチレンジアミ
ンテトラ酢酸存在下では、５０℃まで安定でそれ以上の
温度では急激に失活したのに対し、２　ｍ　Ｍ　Ｃａ　
Ｃｌ　２存在化では８０℃処理後もまだ５０％以上の活
性を残存している。熱処理温度と残存活性の関係を第４
図に示す。

（６）界面活性剤の影響。

直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム３０００ｐ
ｐｍ存在下（ｐＨ９）で３０’Ｃ１２時間処理してもほ
とんど失活しない。処理時間と残存活性の関係を第５図
に示す。

（７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得ら
れた分子量は、約４５，０００である。

（８）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した結果、４．２５である。

本酵素は、バチルス属に属する菌株バチルスｓｐ、Ｓ　
Ｄ　７７１株によって生産され、アルカリ領域に最適ｐ
Ｈを有するものであり、特開平２−４９５８４に記載さ
れている耐熱アルカリアミラーゼと比較した場合は、本
酵素の分子量が４５，０００であるのに対し、上記アミ
ラーゼの分子量は７ｓ、ｏｏｏであること、並びに等電
点が４．２５に対して５．３であることより明らかに別
の酵素である。

［発明の効果］ 本酵素は、高温、アルカリ領域で高い活性を示す酵素で
ある。現在、高温で作用するアミラーゼはすべて中性酵
素であるし、アルカリ酵素は熱に弱いといった欠点があ
り、両方を満足する酵素はまだ市販されていない。本酵
素を用いることにより、高温アルカリ領域でのでんぷん
分解を大幅に改善することが出来る。例えば、繊維工業
においては、精練漂白工程中アルカリ条件下での糊抜き
工程に使用することができ、従来とは違った風合いを出
すことが可能になる。また洗剤成分である陰イオン性界
面活性剤に対する安定性が高いため、洗剤用酵素として
使用でき、洗浄力の増強を図ることが出来る。更に、自
動食器洗い機用洗剤に配合することにより、飯粒などの
でんぷん性の汚れに対する洗浄効果を向上させることが
可能である。

この他にも、アルカリ性領域でてんぽんを加工する工程
など極めて広範囲の分野に使用され得る。

次に、本発明について代表的な実施例を挙げて更に具体
的に説明する。

次１Ｌ例」２ ペプトン２％、でんぷん（溶性）２％、酵母エキス０．
１％、リン酸水素二カリウム０，１％、硫酸マグネシウ
ム０．０２％、炭酸ナトリウム１％からなる液体培地を
常法により滅菌し、無菌的に試験管に分注した。これに
５Ｄ７７１株を接種し、６０’Ｃで　４８時間振盪培養
した。培養液を遠心分離し、その上滑のアミラーゼ活性
を測定したところ０．４５Ｕ　／　ｍ　ｌであった。

炎１豊ユ ペプトン２．５％、カザミノｅ２．５％、でんぷん（溶
性）２．５％、ＤＥ−５０２，５％、酵母エキス０．５
％、リン酸水素二カリウム０．５％、硫酸マグネシウム
０．０５％、炭酸カルシウム０．０５％、炭酸ナトリウ
ム０．８％からなる液体培地を常法により滅菌し、５Ｌ
培養槽に入れた。これにあらかじめ培養しておいた５Ｄ
７７１株を接種し、６０℃で５０時間通気攪拌培養を行
なった。この培養液を遠心分離し、上滑を得た。この上
清のアミラーゼ活性は０．６５Ｕ　／　ｍ　ｌであった
。この上清２．２Ｌを限外ろ過膜により濃縮し、４．７
５Ｕ　／　ｍ　１の試料液３００　ｍ　ｌを得た。

支に■１ 実施例２で得られた試料液から本発明のアミラーゼを精
製した。

まず、試料液から硫酸アンモニウム沈澱法により５０−
７０％画分の沈澱を得た。この沈澱を２０　ｍ　Ｍ　　
酢酸緩衝液（ｐＨ６）に溶かし、透析により脱塩後、同
じ緩衝液で平衡化したＣＭ　（カルボキシメチル）陽イ
オン交換樹脂カラムにより不純物除去を行なった。同操
作で得られた活性画分を、２０　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液に透析し、緩衝液を置換した後、同緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）陰イオン交
換樹脂カラム（２０ｍｍφ、３０ｃｌｌｌ）に吸着させ
、塩化ナトリウムの濃度勾配（０−ＬＭ）で溶出させた
。得られた活性画分５０ｍ１を限外ろ過により２ｍｌに
濃縮し、セファデックスＧ　−７５（２５ｍｍφ、９０
ｃｍ）によるゲルろ過を行なった。活性は、２つのピー
クとして検出され、後方のピークが電気泳動的にほぼ均
一の標品であることが確認された。この精製標品を用い
て、至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度、熱安定性、界面
活性剤に対する安定性を検討した結果は第１図〜第５図
に示した通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、反応ｐＨと活性との関係を示すグラフである
。 第２図は、処理ｐＨと残存活性を示すグラフである。 第３図は、反応温度と活性の関係を示すグラフである。 第４図は、熱処理温度と残存活性の関係を示すグラフで
ある。 第５図は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
　３０００ｐｐｍの存在下での安定性を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有するアミラーゼ （１）至適ｐＨ、至適温度 可溶性でんぷんを基質とした場合の至適ｐＨが９〜１１
   、至適温度が約７０℃である。 （２）安定ｐＨ ５０℃で３０分処理したときｐＨ６〜１２まで安定であ
   る。 （３）界面活性剤の影響 ３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト
   リウム存在下（ｐＨ９．０）で３０℃、２時間処理して
   も９０％以上の残存活性を有する。 （４）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
   した分子量が約４５，０００である。 （５）等電点 等電点電気泳動によって測定した等電点が約４．２５で
   ある。 ２、バチルス属に属し請求項１に記載のアミラーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目的とす
   るアミラーゼを採取することを特徴とする請求項１に記
   載のアミラーゼの製造方法。