EA031435B1 - Способ получения и очистки коллагеназы из vibrio alginolyticus и применение коллагеназы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения и очистки микробной коллагеназы (микробной коллагеназы ЕС 3.4.24.3), продуцируемой непатогенной аэробной бактерией Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (номер NCIMB: 11038, синоним LMG 3418, далее называется Vibrio alginolyticus), причем указанный способ обеспечивает высокие уровни продуцирования коллагеназы с помощью стабильного, воспроизводимого, дешевого способа ферментации. Коллагеназа, продуцируемая Vibrio alginolyticus, в соответствии со способом, описанным в настоящем описании, также демонстрирует удельную активность, превосходную по сравнению с другими микробными коллагеназами, является стабильной в водном растворе и может быть заморожена без значительных повреждений. Другими объектами настоящего изобретения являются препарат и фармацевтические композиции, содержащие коллагеназу, полученную в соответствии с описанным способом получения и очистки, для цели терапевтического лечения расстройств, отличающихся аккумуляцией коллагена или для лечения повреждений/дефектов кожи, которые могут быть улучшены при уменьшении локальной аккумуляции коллагена, а также применение коллагеназы.

Description

Изобретение относится к способу получения и очистки микробной коллагеназы (микробной коллагеназы ЕС 3.4.24.3), продуцируемой непатогенной аэробной бактерией Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (номер NCIMB: 11038, синоним LMG 3418, далее называется Vibrio alginolyticus), причем указанный способ обеспечивает высокие уровни продуцирования коллагеназы с помощью стабильного, воспроизводимого, дешевого способа ферментации. Коллагеназа, продуцируемая Vibrio alginolyticus, в соответствии со способом, описанным в настоящем описании, также демонстрирует удельную активность, превосходную по сравнению с другими микробными коллагеназами, является стабильной в водном растворе и может быть заморожена без значительных повреждений. Другими объектами настоящего изобретения являются препарат и фармацевтические композиции, содержащие коллагеназу, полученную в соответствии с описанным способом получения и очистки, для цели терапевтического лечения расстройств, отличающихся аккумуляцией коллагена или для лечения повреждений/дефектов кожи, которые могут быть улучшены при уменьшении локальной аккумуляции коллагена, а также применение коллагеназы.

Область техники, к которой относится изобретение

Коллагеназы представляют собой металлоферменты с протеолитической активностью, которые требуют иона цинка в активном сайте для осуществления их специфичной функции разрушения нативного коллагена. В отличие от других протеаз, они могут гидролизовать коллаген при физиологических условиях рН и температуры. Ряд коллагеназ, продуцируемых бактериями, известен из литературы (Vibrio, Clostridium, Streptomyces, Pseudomonas); ферменты, продуцируемые Clostridium (Santyl®, Noruxol®), широко используют в фармацевтических композициях для лечения кожных язв различной природы, пролежней, ожогов различных степеней и гипертрофических рубцов, поскольку они разрушают коллаген, присутствующий в некротической ткани. Это облегчает удаление клеточных остатков, которые часто составляют препятствие для миграции эпителиальных клеток во время заживления ран и процесса реэпителизации (Rao, D.B. et al., 1975). Коллагеназа из Vibrio также используется в последнее время для сходных целей (ЕР 1901755); этот патент описывает исключительно липофильные композиции (липогели), содержащие каррагенан в качестве стабилизирующего агента. Однако воспалительная роль, как правило, которую играет это вещество, известна специалистам в данной области. В любом случае, независимо от ее происхождения, коллагеназа имеет исключительно низкую стабильность в водном носителе, и по этой причине, ее всегда составляют в полностью липофильных носителях; Santyl®, Noruxol® и Bionect Start® представляют собой мази с полностью липофильной основой, в которой фермент никогда не распределяется однородно и подвергается воздействию значительных потерь активности со временем.

Липофильный носитель обеспечивает стабильность фермента и стабильность при хранении фармацевтического продукта, в то же время, подрывая его терапевтическую активность; коллагеназа высвобождается из липофильного носителя очень медленно, с тем результатом, что его биологическая доступность является сильно ограниченной. Коллагеназу можно также использовать для системного лечения, в частности, посредством инъекции, таких расстройств, как адгезивный капсулит (плечелопаточный периартрит), синдром Дюпюитрена, болезнь Пейрони, целлюлит и послеоперационные спайки. Стабильность в водном носителе является критичной для этих применений. Продукт для лечения синдрома Дюпюитрена с помощью инъекций имеется в настоящее время на рынке (лиофильное вещество, разбавляемое во время использования), он содержит смесь двух коллагеназ при точном массовом отношении, которые экстрагируются и очищаются с помощью ферментации бактерии Clostridium histolyticum.

Как уже сказано, последняя является одним из наиболее распространенных источников коллагеназы; однако это патогенный микроорганизм, который требует анаэробной ферментации (Mandl I. et al., 1958, Arch Biochem Biophys, 74: 465-475).

Коллагенолитическая активность некоторых штаммов

Achromobacter идентифицирована в первый раз в 1972 году (Thomson J.A., Woods D.R. and Welton R.L. 1972), и первые исследования осуществлялись впоследствии на штамме Achromobacter iophagus (впоследствии переквалифицированном как Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, Emod I. et al. 1983), которые демонстрируют присутствие коллагеназы с высоко специфичной активностью (Welton and Woods 1973). Относительно выбора микроорганизма, который должен использоваться для продуцирования коллагеназы посредством ферментации, использование Vibrio alginolyticus является более преимущественным, чем Clostridium histolyticum, поскольку они не патогенны и делают возможным осуществление ферментации в аэробной окружающей среде, со значительными промышленными преимуществами. Патогенность микробного штамма является важным аспектом, поскольку любые примеси (микробные или белковые остатки) в готовом продукте могут вызывать серьезные побочные воздействия. Работа с патогенными штаммами, очевидно, требует особенной осторожности на стадиях очистки, и как следствие этого, более сложного, дорогостоящего промышленного процесса.

Микробная коллагеназа ЕС 3.4.24.3, продуцируемая Vibrio alginolyticus, представляет собой Zn²⁺ металлопротеазу, которая также отличается от коллагеназ, продуцируемых Clostridium histolyticum, по ряду причин:

она действует специфично на синтетический пептид Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg (где PZ=4фенилазобензилоксикарбонил), который представляет собой синтетический субстрат, выбираемый для оценки коллагенолитический активности. Коллагеназа от V. alginolyticus продуцируемая в соответствии с настоящим изобретением, является единственной коллагеназой, которая способна разрушать коллаген на связи Leu-Gly (Keil В., Gilles А.-М., Lecroisey A., Hurion N. and Tong N.-T. 1975; Keil B. Matrix Suppl. 1992; 1:127-33);

она имеет гораздо большую протеолитическую активность, чем аналог, получаемый из Clostridium histolyticum;

она имеет специфичность относительно сайта расщепления нативного коллагена; она расщепляет спиральную цепь нативного коллагена на 2 сайтах, предпочтительно, на 3/4 от края с N-окончанием на связи Y-Gly последовательности Pro-Y-Gly-Pro, где Y представляет собой нейтральную аминокислоту. Наоборот, коллагеназа от Clostridium histolyticum дает разнообразные сайты расщепления в цепи нативного коллагена (Lecroisey A., Keil, В. 1979);

Штамм Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus продуцирует только одну коллагеназу, хотя анализ

- 1 031435 продуктов очистки с помощью SDS-PAGE демонстрирует присутствие нескольких полос с различными молекулярными массами, где поддерживается коллагенолитическая активность. Эти низкомолекулярные частицы приписываются процессу аутопротеолиза фермента, который ингибируется конкретно приготовленными буферами (Keil-Dlouha, V. 1976).

В 1992 г. Takeuchi et al. Клонировали полную последовательность, кодирующую коллагеназу из Vibrio alginolyticus. Последовательность аминокислоты, следующая из последовательности нуклеотидов, показывает, что зрелая коллагеназа образуется с помощью 739 аминокислот с молекулярной массой 81875 Да. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности коллагеназы из Vibrio alginolyticus не демонстрируют никакого значительного сходства с последовательностями других коллагеназ (Takeuchi H., 1992). К настоящему времени, способы получения фермента из рассматриваемого штамма дают скорее самые умеренные выходы и продукты с неудовлетворительным уровнем чистоты, особенно для использования при инъекциях. Патент ЕР 0115974 описывает способ получения и очистки коллагеназы из V. alginolyticus; конечный продукт представляет собой смесь ферментов (коллагеназу, нейтральные протеазы и эндонуклеазу), которая является стабильной только после добавления фрагментов коллагена бычьей кожи (ASF).

Полученный материал имеет очень низкий уровень чистоты. Кроме того, присутствие ASF может создавать проблемы во время приготовления идентифицированных фармацевтических форм, в частности, поскольку он представляет собой материал животного происхождения, когда выбранные фармацевтические композиции вводятся посредством инъекции.

Кроме того, как уже сказано, фармацевтические композиции, известные в настоящее время, имеют форму мази, в то время как для местных применений и, прежде всего, для системных применений, главное, чтобы фермент коллагеназа находился в исключительно чистой форме и был стабильным в водном носителе (для улучшения распределения фермента в композиции); водный носитель является абсолютно предпочтительным для лечения с помощью инъекции.

Настоящее изобретение позволяет преодолевать эти проблемы путем раскрытия инновационного способа получения и очистки фермента коллагеназы из V. alginolyticus, отличающегося высокими выходами, воспроизводимостью результатов, стабильностью и высоким уровнем чистоты готового продукта. Готовый продукт также является стабильным в водном растворе и может, следовательно, храниться в течение длительных периодов даже при температурах, находящихся в пределах между -20 и -80°С, не подвергаясь значительным повреждениям.

Благодаря высокому уровню чистоты и специфичности расщепления на коллагеновой цепи, коллагеназа, предлагаемая в настоящем документе, может также использоваться для диссоциации тканей и изоляции клеточных кластеров или отдельных клеток для всех экспериментальных и терапевтических процедур, требующих изолированных клеток.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении заявлен новый способ получения и очистки микробной коллагеназы (Microbial Collagenase EC 3.4.24.3), продуцируемой непатогенной аэробной бактерией Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (номер NCIMB: 11038, синоним LMG 3418, ниже называется Vibrio alginolyticus); указанный способ обеспечивает высокие уровни продуцирования коллагеназы с помощью стабильного, воспроизводимого, дешевого способа ферментации. Последовательность коллагеназы, продуцируемой Vibrio alginolyticus, в соответствии со способом получения и очистки, описанным в настоящем описании (SEQ ID NO:1), отличается делецией аминокислот 1-75 по сравнению с последовательностью из 814 аминокислот, кодируемой геном коллагеназы V. alginolyticus (в настоящем документе упоминается как SEQ ID NO:2, соответствующая Microbial Collagenase EC 3.4.24.3). С помощью способа по настоящему изобретению, получают зрелый белок, то есть активную сердцевину, состоящую из 739 аа, более конкретно из 76-814 аа:

TACDLEALVTESSNQLISEILSQGATCVNQLFSAESRIQESVFSSDH

MYNIAKHTTTLAKGYTGGGSDELETLFLYLRAGYYAEFYNDNISFIEWV TPAVKESVDAFVNTASFYENSDRHGKVLSEVIITMDSAGLQHAYLPQVT QWLTRWNDQYAQHWYMRNAVNGVFTILFGGQWNEQFVQIIGNQTDL AKALGD FALRAS SIGAE DE FMAANAGRE LGRL TKYT GNAS S WKS QL S RIFEQYEMYGRGDAVWLAAADTASYYADCSEFGICNFETELKGLVLSQ TYTCSPTIRILSQNMTQEQHAAACSKMGYEEGYFHQSLETGEQPVKDD HNTQLQVNIFDSSTDYGKYAGPIFDISTDNGGMYLEGDPSQPGNIPNFIA YEASYANADHFVWNLEHEYVHYLDGRFDLYGGFSHPTEKIVWWSEGI AEYVAQENDNQAALETILDGSTYTLSEIFETTYDGFDVDRIYRWGYLAV

- 2 031435

RFMFENHKDDVNQMLVETRQGNWINYKATITQWANLYQSEFEQWQQT

LVSNGAPNAVITANSKGKVGESITFSSENSTDPNGKIVSVLWDFGDGSTS

TQTKPTHQYGSEGEYSVSLSVTDSEGLTATATHTWISALGGNDTLPQD

CAVQSKVSGGRLTAGEPVCLANQQTIWLSVPAVNESSNLAITTGNGTG NLKLEYSNSGWPDDTNLHGWSDNIGNGECITLSNQSNYWGYVKVSGD FENAAIWDFDAQKCRQ (SEQ ID N0:1)

Кроме того, коллагеназа, продуцируемая Vibrio alginolyticus, в соответствии со способом по настоящему изобретению также демонстрирует удельную активность, превосходную по сравнению с другими микробными коллагеназами, является более чистой и стабильной в водном растворе и может замораживаться без значительного повреждения.

По этой причине, другим объектом настоящего изобретения является коллагеназа, полученная в соответствии с описанным способом получения и очистки, для использования в терапевтическом лечении патологий, отличающихся аккумуляцией коллагена, или для лечения повреждений/дефектов кожи, которые улучшаются благодаря уменьшению локальной аккумуляции коллагена; так, например, разумно рассмотреть кожные язвы различной природы, пролежни, ожоги различной степени, ошпаривания и гипертрофические рубцы, целлюлит, послеоперационные спайки и, по-прежнему, плечелопаточный периартрит или адгезивный капсулит, синдром Дюпюитрена, болезнь Пейрони.

Другим объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие коллагеназу, полученную в соответствии с описываемым способом получения и очистки, для использования в терапевтическом лечении расстройств, отличающихся аккумуляцией коллагена, или для лечения повреждений/дефектов кожи, которые улучшаются при уменьшении локальной аккумуляции коллагена; примеры представляют собой кожные язвы различной природы, пролежни, ожоги различной степени, ошпаривания и гипертрофические рубцы, целлюлит, послеоперационные спайки, адгезивный капсулит (плечелопаточный периартрит), синдром Дюпюитрена и болезнь Пейрони.

Коллагеназа, полученная с помощью способа, описанного ниже, отличается: молекулярной массой 82 кДа;

удельной активностью в пределах от 1000 до 1800 нкатал/мг;

чистотой в пределах от 98,0 до 100%;

отсутствием микробных и белковых загрязнений;

стабильностью при рН в пределах от 5,5 до 11;

стабильностью в водном растворе при 4°С в течение 30 дней;

стабильностью в водном растворе при температуре в пределах от -20 до -80°С в течение 24-48 месяцев;

лиофилизируемостью с получением стабильного лиофильного порошка.

Способ получения и очистки коллагеназы в соответствии с настоящим изобретением включает следующие стадии:

Стадия А: Инокуляция Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus в колбу Эрленмейера и ферментация в культуральном бульоне на основе пептона небычьего животного происхождения или на основе смеси пептонов небычьего животного происхождения и растительного происхождения;

Стадия В: Осветление ферментированного бульона, полученного на стадии А, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассеты с номинальным отсечением по молекулярной массе (MWCO) 100-500 кДа;

Стадия С: Диализ и концентрирование осветленного бульона/раствора, полученного на Стадии В, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 5-3 0 кДа;

Стадия D1: Очистка раствора, полученного на стадии С, с помощью анионообменной смолы, несущей слабо основные группы, при рН в пределах от 6,9 до 7,4;

Стадия D2: Оценка коллагенолитической активности в собранных на стадии D1 фракциях с помощью стандартного хроматофорного субстрата коллагеназы;

Стадия Е: Диализ и концентрирование собранных на стадии D1 фракций, которые имеют коллагенолитическую активность, определенную на стадии D2, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа;

Стадия F1: Очистка раствора, полученного на стадии Е, с помощью анионообменной смолы, несущей сильно основные группы, при рН в пределах от 6,9 до 7,4;

Стадия F2: Оценка коллагенолитической активности в собранных на стадии F1 фракциях с помощью стандартного хроматофорного субстрата коллагеназы;

Стадия G: Диализ и концентрирование собранных на стадии F1 фракций, которые имеют коллагенолитическую активность >95%, определенную на стадии F2, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа;

Стадия Н: Фильтрование раствора, содержащего коллагеназу, полученную на стадии G, через 0,2 мкм абсолютный фильтр и хранение при температуре в пределах от -20° до -80°С.

- 3 031435

Исследование с помощью материалов и методов, описанных в разделе Методы исследования, ниже, осуществляют в конце каждой стадии.

Стадия А: представляет собой загрузочный способ ферментации; инокулум приготавливают в колбе Эрленмейера, содержащей культурный бульон, сформированный с помощью пептона не-бычьего животного происхождения, например, свиного происхождения, или смеси пептонов не-бычьего животного и растительного происхождения, NaCl, CaCl₂ и TRIS (трис-гидроксиметиламинометан), при рН в пределах между 6,9 и 7,4, предпочтительно, при рН 7,1. Когда оптическая плотность, измеряемая при 600 нм (OD_600nm), достигает значения в пределах между 1 и 4, инокулум является готовым для переноса в ферментер.

Среда, используемая для ферментации, является такой же, как используют для приготовления инокулума, с добавлением малого количества противовспенивателя для предотвращения образования пены из-за аэрации и перемешивания.

Одна ферментация длится в течение 14-20 ч, обычно 16 ч. В течение ферментации отбирают образцы с помощью стерильной процедуры для проверки чистоты, OD_600nm, ферментативной активности и рН.

Когда ферментативная активность составляет >25000 нкатал/л, ферментацию прекращают и добавляют CaCl₂ для стабилизации фермента. Температуру понижают приблизительно до 8°С и смесь оставляют при перемешивании.

Осуществляют следующие контрольные исследования на растворе, полученном на стадии A: OD_600nm; pH; ферментативная активность; концентрация белка; SDS-PAGE.

Ферментативный бульон, получаемый со стадии А, содержит, в дополнение к коллагеназе, представляющей интерес, другие протеазы, продуцируемые бактериями во время ферментации (в основном серинпротеазу), белковые агрегаты с высокой молекулярной массой и остатки среды.

Стадия В: ферментативный бульон, получаемый со стадии А, осветляют с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке (TFF 1) с помощью кассет с MWCO 100-500 кДа, предпочтительно, 300 кДа; это устраняет микробные клетки и белковые агрегаты с высокой молекулярной массой.

Осуществляют следующие контрольные исследования на растворе, полученном на стадии В: рН; ферментативная активность; концентрация белка; SDS-PAGE; анализ с использованием казеиназы.

Стадия С: осветленную среду, полученную со стадии В, концентрируют и диализируют посредством ультрафильтрации с помощью кассет с MWCO 5-30 кДа, предпочтительно с MWCO 10 кДа, приблизительно 15-25 раз. Раствор, полученный на стадии С, как правило, демонстрирует ферментативную активность 500-700 нкатал/мл и является стабильным в течение 12 месяцев при -20°С. Целью фильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 5-30 кДа является значительное уменьшение объема и замена культурной среды на буфер из 25 мМ TRIS-HCl, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1, который стабилизирует коллагеназу и является пригодным для следующего далее способа очистки.

Осуществляют следующие контрольные исследования на растворе, полученном на стадии С: рН; ферментативная активность; концентрация белка; SDS-PAGE.

Стадия D: раствор, содержащий коллагеназу, полученную со стадии С, подвергается первой хроматографической очистке с помощью анионообменной смолы, несущей диэтиламиноалкильные группы, предпочтительно, диэтиламиноэтильные, такой как DE-52 (диэтиламиноэтил целлюлоза DEAE, Whatman). Эти смолы несут слабо основные группы и по этой причине имеют степень ионизации, зависимую от рН, в узком диапазоне рН между 6,9 и 7,4, предпочтительно при рН 7,1.

Затем раствор, содержащий коллагеназу, полученную со стадии С, загружают в колонку (Pall Chromatography Column Resolute Mod. 400-V-EP7040), набитую смолой DE-52.

Осуществление хроматографии отслеживают с помощью детектора УФ-видимого света на 280 нм.

Перед загрузкой колонки ее уравновешивают с помощью такого же буфера, называемого ниже уравновешивающий буфер (25 мМ TRIS-HCl, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1), в котором коллагеназа диализируется в течение стадии С.

После загрузки смолу со связанной коллагеназой элюируют с помощью указанного выше уравновешивающего буфера для удаления белков, не связанных со смолой. Вторую промывку с помощью буфера с более высокой электропроводностью, называемого ниже промывочный буфер (300 мМ TRISHCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1), осуществляют для удаления примесей с низкой молекулярной массой. Коллагеназу, связанную со смолой, элюируют с помощью дальнейшего увеличения электропроводности с помощью третьего буфера, называющегося элюирующий буфер (300 мМ TRIS-HCl, 700 мМ NaCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1).

Стадия Е: фракции, собранные во время элюирования, которые демонстрируют коллагенолитическую активность и демонстрируют хорошую чистоту при SDS-PAGE, объединяют и переносят в систему ультрафильтрации с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа, предпочтительно, 30 кДа, для концентрирования и диализа в буфере, который стабилизирует коллагеназу и является пригодным для следующего далее способа очистки.

Осуществляют следующие контрольные исследования на растворе, полученном на стадии Е: рН; ферментативная активность; концентрация белка; SDS-PAGE; анализ с использованием казеиназы.

Стадия F: раствор, получаемый со стадии Е, проходит на вторую стадию очистки с помощью анио

- 4 031435 нообменной хроматографии с использованием смолы, несущей сильно основные обменные группы, образованные с помощью четвертичного аммония, такой как Source™15Q (GE Healthcare). Осуществление хроматографии отслеживают с помощью детектора УФ-видимого света на 280 нм.

Перед загрузкой, колонку (Millipore GS 70-550), набитую смолой Source™15Q, уравновешивают с помощью такого же буфера, в котором диализируют коллагеназу в течение стадии Е (уравновешивающий буфер).

Раствор, содержащий коллагеназу, полученную со стадии Е, загружают в колонку, и смолу со связанной коллагеназой элюируют с помощью уравновешивающего буфера для удаления несвязанных белков. Коллагеназу, связанную со смолой, элюируют посредством дальнейшего увеличения электропроводности с помощью второго буфера (элюирующий буфер 2-300 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1).

Стадия G: фракции, собранные во время элюирования, которые демонстрируют коллагенолитическую активность и демонстрируют чистоту >95% при SDS-PAGE, объединяют и переносят в систему ультрафильтрации с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа, предпочтительно 30 кДа, для концентрирования и диализа в буфере, который стабилизирует коллагеназу.

Осуществляют следующие контрольные исследования на растворе, полученном на Стадии G: рН; ферментативная активность; концентрация белка; SDS-PAGE.

Стадия Н: раствор коллагеназы, получаемый со стадии G, разбавляют в стабилизирующем буфере и фильтруют через 0,2 мкм абсолютный фильтр. Стерильный раствор, полученный таким образом, представляет собой готовый продукт способа очистки, и его анализируют на следующие характеристики:

концентрация белка, ферментативная активность, рН, анализ с использованием казеиназы, чистота согласно SDS, анализ димеров и высокомолекулярных соединений с помощью UPLC (сверхэффективной жидкостной хроматографии) SEC (эксклюзионной хроматографии), эндотоксины, исследования стерильности.

Методы анализа

Спектрофотометрическое определение ферментативной активности коллагеназы (Wunsch, E., & Heidrich, H. G., модифицированный метод)

Настоящий способ позволяет определить активность коллагеназы, присутствующей в водных растворах. Активность выражается в каталах, определяемых как количество фермента, который катализирует преобразование 1 моль субстрата за 1 с при условиях, указанных для метода. Количество фермента, который катализирует преобразование субстрата за заданное время при 37°С и рН 7,1, по отношению к количеству анализируемого раствора, выражается в нкатал/мл. Принцип способа основан на реакции между коллагеназой и синтетическим субстратом PZ-L-пролил-L-лейцил-глицил-L-пролил-D-аргинином (где PZ=4-фенилазобензилоксикарбонил), специфичным по отношению к коллагеназе. После взаимодействия с коллагеназой синтетический субстрат расщепляется на 2 фрагмента, PZ-L-пролил-L-лейцил и глицил^-пролил^-аргинин. Второй фрагмент является бесцветным, в то время как первый представляет собой хромофор и может определяться спектрофотометрически после экстракции с помощью органического раствора этилацетата, подкисленного лимонной кислотой. Коэффициент поглощения фрагмента на 320 нм пропорционален ферментативной активности.

Для осуществления ферментативного анализа необходимо приготовить последовательные разбавления образца, с тем, чтобы получить концентрацию фермента, которая попадает в диапазон линейности метода.

Образец, который должен анализироваться, разбавляют в буфере 25 мМ Tris, 10 мМ CaCl2, рН 7,1; 0,5 мл этого буферного раствора взаимодействуют при 37°С в течение 15 мин с 2 мл 1,23 мМ раствора синтетического субстрата. По окончании ферментативной реакции 0,5 мл реакционной смеси экстрагируют с помощью органической фазы со смесью, 5:1, этилацетата и 0,5% лимонной кислоты, рН 3,5. Органическую фазу удаляют и дегидратируют посредством добавления 300 мг безводного сульфата натрия. Дегидрированную органическую фазу анализируют спектрофотометрически на 320 нм в сравнении с этилацетатом. Результаты ферментативной активности, выраженные в нкатал/мл, вычисляют с помощью следующей формулы:

Активность, нкатал/мл= [ (Abs₃₂o образца-АЬэзго контроля) хСт . конц . (мкмоль/мл) / (Abs₃₂o

CT.-Abs₃₂o контроля) ] х (50 χ1000/900) xfd

1000=коэффициент преобразования из мкмоль в нмоль

900=с в 15 мин

Fd=коэффициент преобразования для начального разбавления раствора коллагеназы

- 5 031435

50=коэффициент преобразования для разбавления образца (0,5 мл и разбавляют до 2,5 мл, 0,5 мл и разбавляют до 5 мл)

Ст.конц. (мкмоль/мл)=0,02=0,4 мл 250-мкМ раствора, разбавленного до 5 мл.

Контроль получают с помощью такой же ферментативной реакции как для коллагеназа, где раствор, содержащий фермент, заменен эталонным буфером (25 мМ Tris, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1).

Стандарт представляет собой 0,2504-мМ раствора реакционного фрагмента PZ-L-пролил-Е-лейцина в этилацетате;

0,4 мл этого раствора добавляют в раствор, состоящий из 4.6 мл этилацетата и 1 мл 0,5% лимонной кислоты, рН 3,5. Органическую фазу удаляют и дегидратируют посредством добавления 300 мг безводного сульфата натрия. Дегидрированную органическую фазу анализируют спектрофотометрически при 320 нм в сравнении с этилацетатом.

Определение концентрации белка с помощью метода Лоури

Концентрацию белка для растворов, содержащих коллагеназу, определяют с помощью метода Лоури в соответствии со следующими ссылками:

1) European Pharmacopoeia 5,0, Total Protein, Chapter 2.5.33;

2) Lowry, O.H. et al., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent , J. Biol. Chem., 193, 265-275.

Эксклюзионная хроматография на колонке для UPLC

Анализ с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке для UPLC используют для определения димеров и молекул с высокой молекулярной массой (определенных как примеси) и/или продуктов деградации коллагеназы. Используемый инструмент представляет собой Acquity UPLC H-Class с детектором PDA eX, снабженный колонкой Acquity UPLC ВЕН 200 SEC. Анализ осуществляют в изократическом режиме с использованием фосфатного буфера, рН 6,4-6,7, приготовленного следующим образом: Na₂PO₄, 8,9 г/л, NaH₂PO₄, 6,9 г/л, и NaCl, 8,76 г/л. Буфер фильтруют через 0,2 мкм абсолютные фильтры перед использованием. 1,5-4 мкг белка инжектируют в объем 5 мкл для каждого исследования.

Электрофорез SDS-PAGE

Электрофоретический анализ на 10% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) осуществляют в соответствии с методом Леммли (Laemmli U. K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of head of the bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685).

Определение казеиназы

Определение казеиназы используют в качестве метода анализа неспецифичных протеаз, присутствующих в качестве примесей в растворе коллагеназы. Метод анализа осуществляют в соответствии с Anson M.L. (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89 и Folin O. и Ciocalteu V. (1927) J. Biol. Chem. 73, 627-650. Казеиназу определяют с использованием казеина в качестве субстрата. Реакция может схематически иллюстрироваться следующим образом:

Казеин + Н₂О —> Аминокислоты

Количество тирозина, образующегося в реакции, определяют колориметрически посредством реакции с реагентом Фолина-Чокальтеу, который имеет свойство окисления тирозина в щелочной окружающей среде таким образом, что он проявляет голубой цвет. Вкратце, 1 мл раствора, который должен анализироваться, добавляют к 5 мл 0,65% (мас./об.) раствора казеина и оставляют взаимодействовать в течение 30 мин при 37°С. По окончании инкубирования добавляют 0,5 мл трихлоруксусной кислоты (ТСА) и образец фильтруют через 0,45-мкм фильтры 2 мин. Фильтрат собирают; добавляют 5 мл 0,5 М Na₂CO₃ и 1 мл 0,5 н реагента Фолина-Чокальтеу и смесь оставляют для взаимодействия в течение 30 мин при 37°С. По окончании реакции образец еще раз фильтруют через 0,45 мкм фильтры, и фильтрат анализируют с помощью спектрофотометра, измеряя коэффициент поглощения на длине волны 660 нм. В это же время контроль и калибровочную линию получают с помощью раствора 1,1 мМ L-тирозина в качестве стандарта.

Результаты вычисляют с помощью следующей формулы:

ЕДИНИЦа. /МЛ [ [ ( О · D . образца ^- О · Г . _КОНТр_ОЛЯ ) ^— С ] /ГП ] ^х

10x6,5x8xfd/(1χ2) с = известный член

М = угловой коэффициент = коэффициент преобразования из 30 мин в 5 ч

6,5 = общий объем в мл стоп-раствора = общий объем колориметрического раствора = мл образца коллагеназы = мл образца, используемого для проявления цвета fd = коэффициент разбавления

Измерение оптической плотности OD_600nm

Этот метод делает возможным оценку роста клеток в течение различных стадий способа получения, от 5-литровой колбы Эрленмейера до 1000-литрового биореактора. Для измерения OD_600nm отбирают 1 мл суспензии клеток и центрифугируют при относительном центробежном ускорении 12000 g в течение 5 мин, супернатант удаляют и клетки суспендируют повторно в 1 мл дистиллированной Н2О, после чего

- 6 031435 регистрируют коэффициент поглощения на 600 нм.

Анализ эндотоксинов

Анализ эндотоксинов готового раствора коллагеназы осуществляют, как описано в European Pharmacopoeia, Endotoxin Test, Chapter 2.6.14.

Определение ферментативной активности коллагеназы с помощью UPLC

Настоящий метод делает возможным количественное определение активности коллагеназы, посредством анализа с помощью UPLC. Метод основан на количественном определении фрагмента, образующегося при ферментативной реакции (в соответствии с методом Вюнша), по сравнению с внешним стандартом.

Количество фермента, который катализирует преобразование субстрата за заданное время при 37°С и рН 7,1, по отношению к количеству анализируемого раствора, выражают в нкатал/мл. Активность выражается в каталах, определяется как количество фермента, которое катализирует преобразование 1 моль субстрата за 1 сек при условиях, указанных в методе.

Диапазон использования метода в линейных условиях простирается приблизительно до 1,2 нкатал/мл, как максимальная активность коллагеназы в растворе, который может анализироваться в соответствии с описанной методологией, без необходимости в осуществлении разбавлений.

Водный раствор коллагеназы взаимодействует с синтетическим субстратом PZ-L-пролил-L-лейцилглицилФ-пролил^-аргинином (где PZ=4-фенилазобензилоксикарбонил). Два фрагмента высвобождаются при контролируемых условиях (рН, температура, время): PZ-L-пролил-L-лейцин; глицилЖ-пролил^аргинин. Второй фрагмент определяют с помощью UPLC.

Рабочие параметры системы UPLC представляют собой скорость потока: 0,919 мл/мин продолжительность анализа: 3 мин длина волны: 320 нм инжектируемый объем: 1,4 мкл температура колонки: 25°С ___________________________________________________

Время (минуты)	Лимонная кислота 0,5% масс/объем pH 3,5	Ацетонитрил
0	50	50
1,17	50	50
0,34	10	90
1,13	10	90

При этих условиях субстрат элюируется приблизительно через 0,25 мин, а фрагмент приблизительно через 0,44 мин.

Определение ферментативной активности состоит из следующих стадий:

I. Приготовление буферного раствора из 25 мМ TRIS-HCl, 10 мМ CaCl2, рН 7,1 (Реагент А).

II. Приготовление 0,5% раствора лимонной кислоты (Реагент В).

III. Приготовление 1,23 мМ раствора субстрата (Реагент С).

IV. Приготовление раствора PZ-L-пролил-L-лейцина, 200 мкМ в ацетонитриле (реагент Е).

V. Приготовление раствора коллагеназы, который должен анализироваться (раствор D).

Ферментативный раствор разбавляют в мерной колбе буферным раствором (Реагент А), с получением раствора с активностью меньше чем 1,2 нкатал/мл.

VI. Ферментативная реакция. 2 мл реагента С и 0,5 мл раствора D вводят из пипетки в пробирку для исследований с крышкой на резьбе с использованием стеклянной пипетки. Смесь оставляют взаимодействовать в течение 15 мин при 37°С на термостатической бане. По окончании реакции это называют раствором Y. Контроль W приготавливают параллельно следующим образом: 2 мл реагента С и 0,5 мл буферного раствора (реагент А). Смесь оставляют для взаимодействия в течение 15 мин при 37°С на термостатической бане.

VII. Образцы приготавливают посредством отбора 0,5 мл раствора Y и введения их в 10 мл колбу, содержащую 2,0 мл 0,5% лимонной кислоты и дополняют до объема колбы ацетонитрилом.

VIII. Эталонный раствор приготавливают посредством введения 0,5 мл контроля W, 2,0 мл лимонной кислоты и 1,5 мл реагента Е в 10 мл колбу и дополнения до объема колбы ацетонитрилом.

IX. Инжектируют 1,4 мкл эталонного раствора, а затем 1,4 мкл раствора, который должен анализироваться.

Результаты для ферментативной активности, выраженные как в нкатал/мл, вычисляют с помощью следующей формулы:

Активность, нкатал/мл=[(площадь образцахстандартная конц.

(мкмоль/мл))/стандартная площадь]χ(1000χ100/ 900) χ fd

Вычисление ферментативной активности=наномоли в секунду на мл раствора (нкатал/мл), где

1000 = коэффициент преобразования из микромоль в нмоль;

- 7 031435

100 = коэффициент преобразования для разбавления образца (0,5 до 2,5 мл, 0,5 до 10 мл);

900 = с в 15 мин;

Стандарт конц. (мкмоль/мл) = 0,03 (1,5 мл 200 мкМ раствора до 10 мл);

fd = коэффициент разбавления раствора коллагеназы, используемый для приготовления раствора D.

Характеризация белка Определение N-конечной последовательности

N-конечную последовательность аминокислот коллагеназы, полученной от Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, определяют с помощью метода деградации Эдмана с использованием жидкофазного автоматического секвенсора белков (ABI-Perkin Elmer mod. 477°). Полученную последовательность проверяют с помощью биоинформатического анализа, запуская поиск BLAST (Basic Logical Alignment Search Tool) последовательности по всей базе данных GenBank.

Анализ пептидного картирования

Для анализа карты пептидов, коллагеназу сначала восстанавливают с помощью DTT, алкилируют йодацетамидом, а затем обессоливают с использованием колонки PD10, элюируя 1% уксусной кислотой. Элюат подвергают воздействию триптического гидролиза, и фрагменты анализируют с помощью MALDI-MS. Глобальный спектр показан на (фиг. 1: анализ триптического переваривания); это позволяет авторам установить, что более 90% аминокислотной последовательности идентичны последовательности, помещенной в базу данных, соответствующей коллагеназе, продуцируемой Vibrio alginolyticus chemovar Iophagus.

Круговой дихроизм

Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области (FUV-CD) регистрируют на спектрополяриметре Jasco, модель J-810, соединенном с баней, термостатируемой при 25°С. Спектры регистрируют с использованием 0,1-см кюветы при скорости 20 нм/мин, с откликом каждые 8 с, для среднего из двух наборов данных. Каждый образец исследуют дважды.

Сигнал CD выражают как эллиптичность на средний остаток, вычисленную по формуле [0]=©_obsxMRW/ (10x1xc), где ©_obs представляет собой наблюдаемую эллиптичность в миллиградусах, MRW представляет собой среднюю молекулярную массу на остаток, I представляет собой оптический путь в см, и с представляет собой концентрацию в мг/мл. Образцы анализируют при концентрации 0,2 мг/мл.

Пример 1. Получение и очистка коллагеназы из Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus при 800-л ферментации.

(фиг. 2: Блок-схема способа получения и очистки)

Ферментация

Ферментация разделяется на 2 стадии:

Стадия 1: Приготовление инокулума

Стадия 2: Ферментация

Стадия 1: культурная среда представляет собой жидкость и состоит из раствора 1,21 г/л TRIS, 23,4 г/л NaCl, 0,29 г/л CaCl₂ и 15 г/л пептона не-бычьего животного происхождения (свиного, или смеси с пептонами свиного и растительного происхождения), растворенного в дистиллированной воде (Millipore milliQ). рН среды доводят до 7,1 с помощью HCl и стерилизуют ее в автоклаве при температуре >122°С в течение 30 мин. 1,5-мл ампулу Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (WCB-Working Cell Bank) инокулируют в 5-л колбе Эрленмейера, содержащей 2 л культурной среды, и инкубируют при 30°С при перемешивании приблизительно при 150 об/мин, в течение времени, находящегося в пределах между 8 и 16 часов. Когда OD_600nm достигает значения в пределах между 1 и 4, инокулум становится готовым для переноса в ферментер.

Стадия 2: культурная среда является такой же, как используют на стадии 1, с добавлением 0,25 г/л противовспенивателя Sigma 204, стерилизованной при >122°С в течение 30 мин в ферментере. 2 л инокулума переносят с помощью стерильной процедуры в ферментер, содержащий 800 л ферментационного бульона, и параметры ферментации устанавливаются следующим образом:

температура 30°С±1°С, перемешивание 50-150 об/мин, воздух 10-80 м³/ч, н.у.

растворенный кислород >50%, рН 7,1±0,1, давление 0-0,4 бар.

Типичная ферментация длится в течение 14-20 ч, как правило 16 ч, что соответствует наивысшему уровню ферментативной активности коллагеназы в течение всего процесса ферментации. Во время ферментации образцы отбирают с помощью стерильной процедуры для проверки чистоты культуры, OD600nm и ферментативной активности. Активность коллагеназы определяют спектрофотометрически с помощью модифицированного метода Wunsch-Heidrich (Wunsch, E. & Heidrich, H.G. 1963).

Когда ферментативная активность составляет >25000 нкатал/литр, ферментацию прекращают и добавляют CaCl₂ до конечной концентрации 1,47 г/л для стабилизации фермента. Температуру понижают

- 8 031435 приблизительно до 8°С и смесь оставляют при перемешивании в течение приблизительно 10-30 мин. Как правило, ферментированный бульон имеет следующие характеристики:

1) Ферментативная активность в пределах между 25000 и 50000 нкатал/л

2) OD_600nm в пределах между 5 и 8

3) Отсутствие микробных загрязнений

Осветление: ультрафильтрация TFF1 с помощью кассет с MWCO 300 кДа (номинальное отсечение по молекулярной массе)

Ферментационный бульон, приблизительно 800 л, переносят в систему ультрафильтрации, содержащую Holder Sartocon II (Sartorius), внутри которого находятся пять кассет с MWCO 300 кДа (Code 3021467907E-SG), каждая - с площадью фильтрации 0,5 м². Фильтрационная мембрана изготовлена из модифицированного полиэфирсульфона (PES), главная характеристика которого представляет собой низкое сродство к белкам, делая возможным >80% извлечения и осветления среды при малой потере коллагеназы.

Целью ультрафильтрации с помощью кассет для 300 кДа является удаление микробной массы из ферментационного бульона и удаление белковых агрегатов приблизительно до 320 кДа.

Диализ и концентрирование: ультрафильтрация TFF2 с помощью кассет с MWCO 10 кДа

После осветления среду концентрируют и диализируют в системе ультрафильтрации PALL Mod UF-A-P0971, внутри которой находятся шесть кассет с MWCO 10 кДа (Code 34293012R), каждая - с площадью фильтрации 0,5 м². Фильтрационная мембрана изготовлена из модифицированного полиэфирсульфона (PES), главная характеристика которого представляет собой низкое сродство к белкам, что делает возможным >80% извлечение. Ультрафильтрация с помощью кассет 10 кДа делает возможным уменьшение объема в 15-25 раз, удаление низкомолекулярных загрязнений и замену культурной среды буфером из 25 мМ TRIS, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1, который является пригодным для следующего далее процесса очистки. После ультрафильтрации осуществляют следующие анализы:

1) Ферментативная активность

2) Анализ белков

3) SDS-PAGE (фиг. 3: SDS-PAGE на стадиях ультрафильтрации с 300 кДа и 10 кДа)

Пояснение к фиг. 3

Полоса 1 - широкодиапазонный SigmaMarker™

Полоса 2 - 10-мкл ферментационный бульон

Полоса 3 - 20-мкл ферментационный бульон

Полоса 4 - фильтрат, 10 мкл, TFF, 300 кДа

Полоса 5 - фильтрат, 20 мкл, TFF, 300 кДа

Полоса 6 - 2-мкл ретентат TFF 10 кДа

Полоса 7 - 5-мкл ретентат TFF 10 кДа

Полоса 8 - 16-мкл ретентат TFF 10 кДа

Полоса 9 - 2 мкг коллагеназа FIDIA

Слабая анионная хроматография (Whatman DE-52)

Раствор, содержащий коллагеназу, полученный от процесса ультрафильтрации, представляет собой исходные материалы для первой очистки с помощью слабой анионообменной хроматографии с использованием смолы DE-52 (Whatman DEAE: диэтиламиноэтил целлюлоза).

Хроматографические анализы отслеживают с помощью детектора УФ-видимого света на 280 нм. Как правило, 10-25 л раствора, содержащего коллагеназу при концентрации белка 0,8-1,2 г/л, загружают в колонку (Pall Chromatography Column Resolute Mod. 400-V-EP7040), набитую 10 кг смолы DE-52. Количество белков в целом, загружаемых в колонку, составляет 0,8-3 г/кг смолы. Смолу уравновешивают 10 объемами колонки (BV) 25 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1, это называется ниже уравновешивающим буфером.

После загрузки смолу со связанной коллагеназой элюируют 2-4 BV, как правило 2 BV уравновешивающего буфера для удаления белков, не связанных со смолой, и восстановления значений электропроводности до значений до загрузки образца.

Для удаления низкомолекулярных примесей осуществляют дополнительное элюирование с помощью 3-5 BV, как правило 4 BV буфера, приготовленного следующим образом: 300 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1 (промывочный буфер). Коллагеназу, связанную со смолой, элюируют посредством увеличения электропроводности с помощью 3-5 BV, как правило 4 BV, третьего буфера со следующей композицией: 300 мМ TRIS-HCl, 700 мМ NC1 и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1 (элюирующий буфер).

Фракцию, собранную во время элюирования с помощью элюирующего буфера, подвергают анализу ферментативной активности и анализируют с помощью SDS-PAGE.

Типичный хроматографический профиль представляет три различных пика, как показано на фиг. 4 (типичная хроматограмма DE-52):

первый (I) (пик, элюируемый с помощью уравновешивающего буфера) соответствует несвязанным белкам, он не демонстрирует ферментативной активности;

- 9 031435 второй пик (II) соответствует элюированию с помощью промывочного буфера, он представляет коллагенолитическую активность, но не используется, поскольку присутствуют также многочисленные примеси;

третий пик (III) соответствует элюированию с помощью элюирующего буфера и представляет собой пик с самой высокой активностью фермента и с самой высокой чистотой.

Как правило, пик, содержащий коллагеназу, имеет объем 18-22 л и анализируется относительно следующих характеристик:

1) Ферментативная активность

2) Анализ белков

3) SDS-PAGE (фиг. 5)

Пояснение к фиг. 5

Полоса 1 - 5 мкл образца после TFF2

Полоса 2 - 20 мкл несвязанного белка

Полоса 3 - 10 мкл фракции 1 пика I

Полоса 4 - 10 мкл фракции 2 пика I

Полоса 5 - 10 мкл фракции 1 пика II

Полоса 6 - 10 мкл фракции 2 пика II

Полоса 7 - 10 мкл пика III

Диализ и концентрирование: ультрафильтрация TFF3 с помощью кассет с MWCO 30 кДа

Фракцию, соответствующую третьему хроматографическому пику, концентрируют и диализируют в системе ультрафильтрации Cogent™ (Millipore), внутри которой находятся две кассеты с MWCO 30 k (Code 31158044R), каждая - с площадью фильтрации 0,1 м². Фильтрационная мембрана изготовлена из полиэфирсульфона (PES), главной характеристикой которого является низкое сродство к белкам, делающее возможным извлечение >95%. Ультрафильтрация с помощью кассет 3 0 кДа делает возможным уменьшение объема в 3-6 раз и замену элюирующего буфера DE-52 на буфер из 25 мМ TRIS, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1, который является пригодным для следующего далее процесса очистки. На ультрафильтрате осуществляют следующие виды контроля:

1) Ферментативная активность

2) Анализ белков

Сильно анионная хроматография (Source™ 15Q GE Healthcare)

Раствор коллагеназы, получаемый от TFF3, представляет собой исходные материалы для второй очистки с помощью сильной анионообменной хроматографии с использованием смолы Source™ 15Q (GE Healthcare). Хроматографические анализы отслеживают с помощью детектора УФ-видимого света на 280 нм. Как правило, 3-6 л раствора, содержащего коллагеназу при концентрации белка 0,8-1,2 мг/мл, загружают в колонку (Millipore GBP 70-550), набитую 100-200 мл смолы Source™15Q; количество белков в целом, загруженное в колонку, соответствует количеству 24-36 мг/мл смолы. Перед загрузкой, смолу уравновешивают 2 объемами колонки (BV) 10 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1, это называется уравновешивающий буфер.

После загрузки, смолу со связанной коллагеназой элюируют с помощью 5-7 BV уравновешивающего буфера для удаления несвязанных белков и восстановления электропроводности до начальных значений. Коллагеназа, связанная со смолой, элюируется с помощью 5-10 BV 300 мМ Tris-HCl и 10 мМ CaCl₂ при рН 7,1 (элюирующий буфер). Фракцию, содержащую коллагеназу, элюируют в виде одного пика, как правило, 1-2 литра, что можно увидеть на хроматограмме, показанной на фиг. 6 (типичная хроматограмма для Source™15Q).

Фракцию, содержащую коллагеназу, собранную во время элюирования, подвергают следующим видам контроля:

1) Ферментативная активность

2) Анализ белков

3) SDS-PAGE (фиг. 7: SDS-PAGE фракций от Source™ 15Q)

Пояснение к фиг. 7

Полоса 1 - концентрация несвязанного белка 20 мкл, 20Х

Полоса 2 - Фракция 1 10 мкл

Полоса 3 - Фракция 2 10 мкл

Полоса 4 - LMW

Диализ и концентрирование: ультрафильтрация TFF4 с помощью кассет с MWCO 30 кДа

Фракцию, содержащую коллагеназу, переносят в систему ультрафильтрации Cogent™ (Millipore), внутри которой находятся две кассеты с MWCO 3 0 кДа с мембраной из полиэфирсульфона (PES), каждая - с площадью фильтрации 0,1 м². Эта стадия ультрафильтрации дает возможность для диализа и концентрирования образца по отношению к буферу из 25 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl₂, рН 7,1.

Фильтрование и хранение

Раствор, полученный после TFF4, фильтруют через 0,2-мкм абсолютные фильтры из полиэфир

- 10 031435 сульфона (PES) для конечной стерилизации продукта. Конечный продукт хранят в специальных контейнерах при -20°С.

Полученный таким образом раствор коллагеназы анализируют на следующие характеристики: концентрация белков;

ферментативная активность;

рН;

анализ неспецифичных протеаз;

чистота согласно SDS-PAGE (фиг. 8: SDS-PAGE готового продукта);

чистота согласно UPLC SEC (анализ димеров и высокомолекулярных частиц);

исследование LAL для определения эндотоксинов (в соответствии с European Pharmacopoeia, продукт должен содержать не более 5 МЕ/кг/час).

Пояснение к фиг. 8

Полоса 1 - HMW

Полоса 2 - Коллагеназа fidia 0,5 мкг/полоса

Полоса 3 - Коллагеназа fidia 1 мкг/полоса

Полоса 4 - Коллагеназа fidia 2 мкг/полоса

Конкретные характеристики приведены в таблице ниже.

Таблица

Исследование	Описания
Идентификация: эксклюзионная хроматография на колонке для UPLC	- положительная
Внешний вид	Прозрачный, бесцветный раствор в 25 мМ TRIS-HCl, 10 мМ СаС12, pH 7,1
pH раствора	7,1±0,2
Концентрация белков	<1,0 мг/мл раствора
Удельная активность	1000-1800 нкатал/мг
Активность казеиназы	<1,0 Ед/мл
Чистота согласно UPLC	98,0-100%
Идентификация	Молекулярная масса 82 кДа
Чистота согласно SDS-PAGE	98,0-100%
Эндотоксины	Отсутствуют или соответствуют European Pharmacopoeia

Коллагеназа, полученная и очищенная в соответствии с настоящим изобретением, исследуется автором для проверки следующих характеристик, с результатами, приведенными ниже:

чистота: имеет чистоту в пределах между 98 и 100%;

не содержит микробных и белковых загрязнений (эндотоксинов, ДНК);

стабильна при рН в пределах между 5,5 и 11 (установлено с помощью ферментативного исследования);

стабильна в водном растворе, например, в содержащем 25 мМ TRIS-HCl, 10 мМ CaCl₂, рН 7,1, при Т в пределах между 4 и 40°С, в частности стабильна при 37°С;

стабильна в водном растворе при 4°С в течение 30 дней;

стабильна в водном растворе при Т в пределах между -20°С и -80°С в течение 24-48 месяцев;

может быть высушена вымораживанием вместе с соответствующими наполнителями (описанными ниже) с получением стабильного лиофильного порошка.

Лиофилизат коллагеназы, который представляет собой другой предмет настоящего изобретения, приготавливают вместе с наполнителями, особенно пригодными для поддержания его стабильности, и предпочтительно может содержать мальтозу: 95-96%, предпочтительно 95,75%;

соли (такие как TRIS-HCl + CaCl₂): 1,0-1,5%, предпочтительно 1,3%;

коллагеназу: 2,5-3,5%, предпочтительно 2,95%, с получением порошка, полученного сушкой вымораживанием, с активностью фермента в пределах между 7-20 нкатал/мг порошка.

Количества, указанные выше, для лиофилизата коллагеназы представляют собой проценты массовые по отношению к общей массе лиофилизата.

Коллагеназа, полученная в соответствии со способом получения и очистки, является, следовательно, пригодной для получения фармацевтических композиций различных типов и разработана, как сказано, для использования при лечении расстройств, отличающихся аккумуляцией коллагена или для лечебно-косметического лечения повреждений/дефектов кожи, которые улучшаются при уменьшении локальной аккумуляции коллагенов. Наиболее частые применения относятся к наружному и/или местному ле

- 11 031435 чению ожогов различной степени, ошпаривания, пролежней, сосудистых язв и диабетических язв; в этих случаях, коллагеназа эффективно устраняет ожоговый струп, делая, таким образом, возможным активирование лежащих под ними клеток для целей процессов восстановления. Другие терапевтические применения относятся к целлюлиту, послеоперационным спайкам, гипертрофическим рубцам и келоидам; в этих ситуациях, аномальное продуцирование коллагена отрицательно влияет на обычный процесс восстановления, и они могут улучшаться при лизировании нерегулярно аккумулируемого коллагена.

Другие расстройства, которые могут лечиться с помощью коллагеназы, представляют собой адгезивный капсулит (плечелопаточный периартрит), синдром Дюпюитрена и болезнь Пейрони.

Может потребоваться местное или системное применение, в частности применение с помощью инъекций, в зависимости от расстройства.

Относительно местных применений, неожиданная стабильность в водном растворе фермента, описываемого в настоящем документе, делает возможным его приготовление в гидрофильных носителях; в частности, обнаружено, что коллагеназа может быть приготовлена вместе с конкретными полимерами, которые гидратируются при контакте с эксудатом из повреждения, на которое их помещают, с возникновением геля. В этой ситуации фермент высвобождается постепенно и в более высоких количествах, чем получается с помощью обычных липофильных носителей, используемых в настоящее время, с получением лучшего терапевтического воздействия;

количество ежедневных нанесений также может быть уменьшено, улучшая, таким образом, податливость пациента. Фармацевтическая форма для местного применения, предпочтительная в рамках настоящего изобретения, представляет собой пылевидный порошок, промышленное приготовление которого не требует никаких специальных процессов и который может легко измеряться в форме фармацевтического препарата, правильно осаждаться в пределах повреждения и храниться в течение длительных периодов времени. Используемый гидрофильный полимер должен быть способным поглощать текучую среду, внезапно выделяемую из раны, с образованием прилипающего материала геля. Указанный гель, очевидно, должен иметь характеристики вязкости, которые делают возможным его пребывание на поверхности раны; избыточно твердый гель имеет тенденцию к витрификации, в то время как избыточно жидкий гель соскальзывает с поверхности раны, унося при этом активный ингредиент. Кроме того, поскольку препарат должен быть стерильным, главное для выбранного полимера - поддерживать его реологические свойства после гидратирования, даже когда он предварительно стерилизуется с помощью обычных средств (обычно, гамма излучения). Для идентификации наиболее пригодного для использования полимера автор осуществил ряд исследований многочисленных полимеров (крахмала и его производных, альгинатов, производных целлюлозы, поливиниловых спиртов и их производных, смол и пектинов), как кратко описано в настоящем документе. В стеклянной чашке Петри диаметром 5 см создают сплошную пленку солевого раствора толщиной 2,5 мм, на которую порошкообразный полимер, который должен исследоваться (приблизительно 1 г), распыляют из стального сита с отверстиями фиксированного размера. Дополнительную жидкость добавляют постольку, поскольку полимер, преобразованный в гель, способен ее поглощать, поддерживая такую вязкость, что он не стекает с чашки, когда ее удерживают вертикально. После оценки доли поглощения жидкости и прозрачности и консистентности полученного геля, принимается решение, что полимер, наиболее пригодный для целей настоящего изобретения, представляет собой гликолят кукурузного крахмала.

Гликолят кукурузного крахмала представляет собой мелкодисперсный белый, сыпучий, очень гигроскопичный порошок, используемый при производстве таблеток и капсул, благодаря его разрыхляющим свойствам, но никогда не используемый путем непосредственного нанесения. Гликолят кукурузного крахмала имеет рН в пределах между 5,5 и 7,5, то есть сходный с рН ткани, на которую его наносят, и набухает в воде с увеличением его объема вплоть до 300-кратного.

В дополнение к ферменту коллагеназе, пылевидный порошок может также содержать другой активный ингредиент, который стимулирует миграцию клеток, чтобы сделать возможной более быструю реэпителизацию поверхности раны, и по этой причине, более быстрое затягивание раны. Из разнообразных возможных агентов гиалуроновая кислота является особенно пригодной для этих целей; она представляет собой гетерополисахарид, состоящий из чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и NацетилЮ-глюкозамина. Она представляет собой прямоцепной полимер с молекулярной массой, находящейся в пределах между 50000 и 13х10⁶ Да, в зависимости от источника, из которого ее получают, и от используемых методов приготовления. НА, используемая в настоящем изобретении, может быть получена из любого источника, такого как экстракт из морских петушков (ЕР 138572 В1), ферментация (из Streptococcus) или биосинтез (из Bacillus), и имеет среднюю молекулярную массу в пределах между 400 и 3х10⁶ Да, в частности в пределах между 1х105 Да и 1х10⁶ Да, и еще более конкретно в пределах между 200000 и 750000 Да. Предпочтительно НА, используемая в настоящем документе для местного нанесения, имеет среднюю молекулярную массу (MW) в пределах между 130 и 230 кДа, предпочтительно между 145 и 210 кДа и еще более предпочтительно между 160 и 200 кДа; последняя будет ниже называться НА со средним MW 200 кДа. НА со средней молекулярной массой в пределах между 200 и 1800 кДа, предпочтительно в пределах между 500 и 1300 кДа, а еще более предпочтительно в пределах между 750

- 12 031435 и 1200 кДа, используется для применений для инъекций. Упоминания средней молекулярной массы относятся к средневзвешенной MW, вычисленной с помощью метода собственной вязкости (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377).

НА встречается в природе в перицеллюлярных гелях, в базовом веществе соединительной ткани позвоночных животных (у которых она является одним из главных компонентов), в синовиальной жидкости суставов, в жидкой части стекловидного тела и пупочном канатике.

Продемонстрировано, что НА играет критическую роль в процессе восстановления тканей, как с точки зрения структур (при организации внеклеточного матрикса и регулировки его гидратирования), так и в качестве вещества, которое стимулирует широкий диапазон процессов, в которых она непосредственно и опосредованно вовлечена (образование сгустков крови, фагоцитарная активность, пролиферация фибробластов, неоваскуляризация, реэпителизация, и тому подобное). (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536566). Роль НА в препаратах, описанных в настоящем документе, заключается не только в ускорении заживления ран, но прежде всего, в предотвращении повреждения коллагеназой, которая собирается на краях раны, живых здоровых клеток, которые находятся там, предотвращая их миграцию в направлении областей, которым необходима регенерация. Кроме того, присутствие НА, которое также представляет собой полимер-поглотитель, способствует образованию геля на поверхности раны и улучшает высвобождение, а, следовательно, ферментативную активность коллагеназы, как уже продемонстрирована и как будет иллюстрироваться ниже.

Описанные препараты могут также включать агент, который облегчает проскальзывание порошков на стадии смешивания; вещества, которые используют чаще всего, включают коллоидный диоксид кремния, который необязательно может включаться в количествах, находящихся в пределах между 0,1 и 3%, предпочтительно в пределах между 0,2 и 1%, как известно специалистам в данной области.

В рамках настоящего изобретения автор последовательно намерен предложить фармацевтические композиции для местного применения в форме пылевидного порошка, содержащие коллагеназу, полученную с помощью способа, описанного выше, в количестве, эквивалентном активности в пределах между 2 и 8 нкатал/г готового продукта, предпочтительно 5 нкатал/г готового продукта;

необязательно, НА со средневзвешенной молекулярной массой, находящейся в пределах между 130 и 230 кДа, предпочтительно в пределах между 145 и 210 кДа, а еще более предпочтительно в пределах между 160 и 200 кДа, в количестве, находящемся в пределах между 0,1 и 5%, предпочтительно между 0,2 и 2%;

необязательно, коллоидный диоксид кремния в количестве в пределах между 0,1 и 3%, предпочтительно между 0,2 и 1%;

гликолят кукурузного крахмала, в количестве, необходимом для завершения процентной композиции.

Количества, показанные выше для пылевидного порошка, представляют собой проценты массовые по отношению к общей массе композиции.

Некоторые примеры приготовления фармацевтических композиций, описанных выше, будут теперь описываться в качестве примера, но не ограничения.

Пример 2. Приготовление пылевидного порошка, содержащего коллагеназу, гиалуроновую кислоту (НА) и гликолят кукурузного крахмала (Препарат 1).

Коллагеназу, в лиофильной форме, отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

НА со средним MW 200 кДа 0,2 г гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Примерно половину от количества гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер; коллагеназу и НА, предварительно микронизированные и просеянные на 50 мкм сите, взвешивают и вводят в контейнер. Наконец, оставшееся количество гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер. Приготовление осуществляют с помощью непосредственного смешивания порошков в полиэтиленовом флаконе в форме параллелепипеда, закрытом полиэтиленовой промежуточной крышкой и полипропиленовым колпачком на резьбе, с емкостью, достаточной для того, чтобы оставалось по меньшей мере 40-50% пустого пространства над смесью. Флакон, закрепленный на консоли V-образного смесителя в наклонном положении (под углом 45°), вращается с наклоном вокруг своей малой оси при скорости 50 об/мин. Перемешивание осуществляют до тех пор, пока смесь не станет гомогенной.

- 13 031435

Пример 3. Приготовление пылевидного порошка, содержащего коллагеназу, гиалуроновую кислоту (НА), гликолят кукурузного крахмала и глидант (Препарат 2).

Коллагеназу, в лиофильной форме, отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

НА со средним MW 200 кДа 0,2 г

Коллоидный диоксид кремния 0,2 г

Гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Примерно половину от количества гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер; коллагеназу и НА, предварительно микронизированные и просеянные на 50 мкм сите, взвешивают и вводят в контейнер. Наконец, оставшееся количество гелеобразующего полимера и глидант взвешивают и вводят в контейнер. Приготовление осуществляют с помощью непосредственного смешивания порошков в полиэтиленовом флаконе в форме параллелепипеда, закрытого полиэтиленовой промежуточной крышкой и полипропиленовым колпачком на резьбе, с емкостью, достаточной для того, чтобы оставалось по меньшей мере 40-50% пустого пространства над смесью. Флакон, закрепленный на консоли V-образного смесителя в наклонном положении (под углом 45°), вращается с наклоном вокруг его малой оси при скорости 50 об/мин. Перемешивание осуществляют до тех пор, пока смесь не станет гомогенной.

Пример 4. Приготовление пылевидного порошка содержащего коллагеназу, гиалуроновую кислоту (НА), гликолят кукурузного крахмала и глидант (Препарат 3).

Коллагеназу в лиофильной форме отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

НА со средним MW 200 кДа 0,2 г

Коллоидный диоксид кремния 1 г гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Относительно приготовления, см. Пример 2.

Пример 5. Приготовление пылевидного порошка, содержащего коллагеназу и гликолят кукурузного крахмала (Препарат 4).

Коллагеназу в лиофильной форме отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

Гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Приблизительно половину от количества гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер; коллагеназу взвешивают и вводят в контейнер. Наконец, оставшееся количество гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер. Приготовление осуществляют с помощью непосредственного смешивания порошков в полиэтиленовом флаконе в форме параллелепипеда, закрытом полиэтиленовой промежуточной крышкой и полипропиленовым колпачком на резьбе, с емкостью, достаточной для того, чтобы оставалось по меньшей мере 40-50% пустого пространства над смесью. Флакон, закрепленный на консоли V-образного смесителя в наклонном положении (под углом 45°), вращается наклонно вокруг его малой оси при скорости 50 об/мин. Перемешивание осуществляют до тех пор, пока смесь не станет гомогенной.

Пример 6. Приготовление пылевидного порошка, содержащего коллагеназу, гликолят кукурузного крахмала и глидант (Препарат 5).

Коллагеназу, в лиофильной форме, отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

Коллоидный диоксид кремния 0,2 г гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Примерно половину от количества гелеобразующего полимера взвешивают и вводят в контейнер; коллагеназу взвешивают и вводят в контейнер. Наконец, оставшееся количество гелеобразующего полимера и глидант взвешивают и вводят в контейнер. Приготовление осуществляют с помощью непосредственного смешивания порошков в полиэтиленовом флаконе в форме параллелепипеда, закрытом полиэтиленовой промежуточной крышкой и полипропиленовым колпачком на резьбе, с емкостью, достаточной для того, чтобы оставалось по меньшей мере 40-50% пустого пространства над смесью. Флакон, закрепленный на консоли V-образного смесителя в наклонном положении (под углом 45°), вращается наклонно вокруг его малой оси при скорости 50 об/мин. Перемешивание осуществляют до тех пор, пока смесь не станет гомогенной.

- 14 031435

Пример 7. Приготовление пылевидного порошка, содержащего коллагеназу, гликолят кукурузного крахмала и глидант (Препарат 6).

Коллагеназу в лиофильной форме отмеривают таким образом, что она соответствует активности 5 нкатал/г готового продукта.

Коллагеназа эквивалент 5 нкатал/г

Коллоидный диоксид кремния 1 г

Гликолят кукурузного крахмала по потребности до 100 г

Относительно приготовления, см. Пример 5.

Как сказано, реология указанных пылевидных порошков до и после стерилизации, и их рабочие характеристики с точки зрения высвобождения коллагеназы, оценивают после гидратирования. Последнее исследование осуществляют посредством сравнения со стандартным продуктом (Bionect Start®), содержащим коллагеназу в липофильном носителе.

Реологическая оценка до и после стерилизации

Образцы для исследований приготавливают в соответствии с примерами 1 и 3, которые представляют собой наиболее сложные препараты из тех, которые описаны.

г каждого из нестерильных Препарата 1 и Препарата 3 гидратируют с помощью 7 мл солевого раствора; такую же процедуру осуществляют на 1 г этих же препаратов, предварительно стерилизованных с помощью гамма излучения (доза 25 кГрэй). Гели, полученные таким образом, анализируют для оценки вязких модулей G' и G с помощью вискозиметра HAAKE модели Mars II, снабженного приспособлением для измерения с конусом и пластинкой с диаметром 60 мм, под углом 1°; измерение осуществляют при 20±0,5°С при контроле вращения с постепенным увеличением скорости от 0 до 5 с^-1 за 8 мин; интерполяцию осуществляют при 1,0 с^-1. Результаты показаны на графике фиг. 11 (реологическая оценка до и после стерилизации): каждый препарат четко сохраняет практически неизменными свои реологические свойства, даже после стерилизации. Препарат 1, без глиданта, имеет несколько более высокие модули G' и G, но не до статистически значимой степени. Это означает, что глидант не оказывает воздействия на реологию, и используется ли он или нет, зависит, следовательно, от рабочих условий. Однако необходимо подчеркнуть, что выбранный полимер сохраняет характеристики прилипания и вязкости, идентифицированные в предыдущих исследованиях, которые необходимы для оптимального высвобождения фермента, содержащегося в препарате.

Оценка коллагенолитической активности

Эти исследования исследуют поведение препаратов с гиалуроновой кислотой и без нее, по сравнению с коммерческим эталонным продуктом (Bionect Start®), содержащим коллагеназу в липофильном носителе (мази) и гиалуроновую кислоту.

Поскольку глидант не оказывает воздействия на ферментативную активность коллагеназы, решено исследовать Препараты 1 (с НА) и 4 (без НА). Деградирующая ферментативная активность определяется с помощью количественного анализа на стандартном коммерческом субстрате (Collagenase Chromophor substrate kit - Fluka 27669). Способ модифицируют соответствующим образом, чтобы сделать возможным исследование порошкообразных препаратов исследуемых образцов и моделирование условий, для которых указанные препараты будут экспонироваться после нанесения in vivo. Анализ основан на гидролизе конкретного субстрата коллагеназы: 4-фенилазобензилоксикарбонил-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH (компонент А). Указанный субстрат деградирует до Pz-Pro-Leu-OH (желто-оранжевый фрагмент) и H-Gly-ProD-Arg-OH в присутствии фермента коллагеназы. Пептид Pz-Pro-Leu-OH растворим в органических растворителях, и экстрагируется с помощью этилацетата из смеси, подкисленной лимонной кислотой. Избыток недеградированного субстрата остается в подкисленной водной фазе. Pz-Pro-Leu-OH в этилацетате определяется количественно спектрофотометрически с помощью регистрации на 320 нм.

Материалы и методы

Collagenase Chromophor substrate kit - Fluka 27669

Препарат 1

Препарат 4

Bionect Start®

Солевой раствор

TRIS Буфер мМ лимонной кислоты

Этилацетат

Безводный Na₂SO₄.

Осуществляют 3 исследования для каждого препарата.

Стадия 1.

1,1 мл раствора субстрата при концентрация 2,6 мМ помещают в 1,5-мл пробирку Corning Costar SpinX (Sigma, фиг. 9A), как описано в коммерческом методе анализа Fluka. 100 мг каждого порошкообразного препарата коллагеназы (Препараты 1 и 4), которые гидратируют с помощью солевого раствора с массой, равной 4 массам порошка, вставляют в контейнер, несущий мембрану с пористостью 0,22 мкм

- 15 031435 (фиг. 9В). Контейнер герметично закрывают с помощью соответствующей крышки, чтобы предотвратить набухание порошка из-за дальнейшего поглощения жидкости во время эксперимента. Контейнер помещают в пробирку с раствором субстрата (фиг. 9С). Пробирку герметично закрывают и переворачивают, чтобы сделать возможным контакт между раствором субстрата и мембраной контейнера. Коллагеназа и субстрат могут проходить через мембрану свободно, в то время как порошки остаются в контейнере. Препарат в целом инкубируют при 32°С. Контейнеры заменяют, как указано в протоколе, для моделирования ежедневного нанесения, нанесения каждые два дня и однократного нанесения.

Для Bionect Start®, который представляет собой мазь, Стадию 1 модифицируют, как описано ниже:

0,6 мл раствора субстрата при концентрации 1,3 мМ помещают в 1,5-мл пробирки Эппендорф (фиг. 10: пробирка Эппендорф для модифицированной стадии 1), как описано в коммерческом методе анализа Fluka. Колпачки пробирок Эппендорф заполняют приблизительно 250 мг Bionect Start®, который приводят в контакт с раствором субстрата и инкубируют при 32°С. Колпачки заменяют, как указано в протоколе, чтобы моделировать ежедневное нанесение, нанесение каждые два дня и однократное нанесение.

Стадия 2:

Когда заканчивается заданный период контакта, 125 мкл смеси субстрата, обработанной, как описано на Стадии 1, отбирают в каждый фиксированный момент времени и помещают в 1,5-мл пробирку Эппендорф. К этому раствору добавляют 250 мкл лимонной кислоты (25 мМ) и 1,25 мл этилацетата. Раствор перемешивают в течение 15 с и центрифугируют. Этилацетат, который содержит гидролизованный субстрат, переносят в пробирку Эппендорф, содержащую безводный Na₂SO₄. После перемешивания и центрифугирования пробирки Эппендорф органическую фазу переносят в новую пробирку Эппендорф. Гидролизованный субстрат, содержащийся в органической фазе, определяют спектрофотометрически на 320 нм.

Данные анализа приводятся на графиках фиг. 12-14.

Сразу видно, что порошкообразные препараты действуют гораздо лучше, чем эталонный продукт при каждой из исследуемых частот нанесения и для каждого рассмотренного момента времени.

В частности, значения для Препаратов 1 и 4 всегда являются в высшей степени значимыми по сравнению с эталонным продуктом, демонстрируя их лучшую эффективность, что означает меньше нанесений для пациента. В любом случае, очевидно, что порошкообразные препараты действуют гораздо лучше, чем препараты, содержащие коллагеназу в липофильном носителе. Это означает не только, что коллагеназа, присутствующая в порошкообразных препаратах, действует в водной окружающей среде, образующейся, когда эксудат поглощается гликолятом кукурузного крахмала, демонстрируя ранее упомянутую стабильность в водном растворе, но также и то, что неожиданно она действует лучше, чем ожидалось.

Относительно препаратов для инъекций, как ранее сказано, они существенно используют чистоту фермента, полученного с помощью способа, описанного выше, и его неожиданную стабильность в водном носителе, и то и другое, при Т окружающей среды и при температурах, находящихся в пределах между -20 и -80°С. Композиции для инъекций предпочтительно состоят из коллагеназы в форме, полученной сушкой вымораживанием, разбавленной в водном растворе, предпочтительно во время использования, и содержат на единичную дозу:

коллагеназу, полученную в соответствии с описанным способом, в количестве, эквивалентном активности, находящейся в пределах между 120 и 450 нкатал;

стерильный солевой раствор (0,9% NaCl);

необязательно, НА со средневзвешенной молекулярной массой в пределах между 750 и 1200 кДа, при концентрации, находящейся в пределах между 1 и 30 мг/мл солевого раствора, предпочтительно в пределах между 8 и 20 мг/мл, а еще более предпочтительно в пределах между 10 и 15 мг/мл.

Некоторые примеры приготовления растворов коллагеназы для инъекций будут теперь описываться в качестве примера, но не ограничения.

Пример 8. Приготовление раствора коллагеназы для инъекций в стерильном солевом растворе (0,9% NaCl).

Коллагеназа эквивалент 196 нкатал

Стерильный солевой раствор 1 мл

Фермент в лиофильной форме, содержащийся в соответствующей стерильной ампуле, разбавляют с помощью 0,35 мл стерильного солевого раствора, отбирают с помощью градуированного шприца. После осторожного перемешивания получают стабильный раствор.

Пример 9. Приготовление раствора коллагеназы для инъекций в стерильном солевом растворе (NaCl 0,9%).

Коллагеназа эквивалент 392 нкатал

Стерильный солевой раствор 1 мл

Фермент в лиофильной форме, содержащийся в соответствующей стерильной ампуле, разбавляют с помощью 0,7 мл стерильного солевого раствора, отмеривают с помощью градуированного шприца. После острожного перемешивания получают стабильный раствор.

- 16 031435

Пример 10. Приготовление раствора коллагеназы для инъекций, приготовленного в НА с MW 750 кДа.

Коллагеназа эквивалент 196 нкатал

Раствор НА 1 мл

Раствор НА предварительно разбавляют посредством растворения 10 мг предварительно микронизированной НА, содержащейся в соответствующей стерильной ампуле в 1 мл стерильного солевого раствора. Фермент в лиофильной форме разбавляют с помощью 0,35 мл раствора НА, отмеривают с помощью градуированного шприца. После осторожного перемешивания до растворения порошка коллагеназы получают стабильный раствор.

Пример 11. Приготовление раствора коллагеназы для инъекций, приготовленного с НА с MW 1200 кДа кДа.

Коллагеназа эквивалент 392 нкатал

Раствор НА 1 мл

Раствор НА предварительно разбавляют посредством растворения 15 мг предварительно микронизированной НА, содержащейся в соответствующей стерильной ампуле в 1 мл стерильного солевого раствора. Фермент в лиофильной форме разбавляют с помощью 0,7 мл раствора НА, отмеривают с помощью градуированного шприца. После осторожного перемешивания до растворения порошка коллагеназы получают стабильный раствор.

Растворы, полученные таким образом, могут храниться при 4°С, хотя предпочтительно вводить их в виде инъекции непосредственно после приготовления или в пределах 8 ч после него. В дополнение к типичным терапевтическим применениям, описанным выше, коллагеназа в соответствии с настоящим изобретением может также использоваться при диссоциации тканей и при изоляции клеточных кластеров или отдельных клеток как для терапевтических целей, так и для целей экспериментальных исследований. Это применение используют, например, в процедуре трансплантации островковых клеток Лангерханса для изоляции островковых клеток от окружающей ткани поджелудочной железы. Коллагеназа также может успешно использоваться для изоляции кардиомиоцитов, гепатоцитов и опухолевых клеток для цели разработки соответствующей вакцины, и в целом для всех клеток, которые можно использовать в области генной инженерии тканей (костей, хрящей, щитовидной железы и тому подобное).

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	Fidia Farmaceutici S.p.A
<120>	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ КОЛЛАГЕНАЗЫ ИЗ VIBRIO ALGINOLYTICUS И

ПРИМЕНЕНИЕ КОЛЛАГЕНАЗЫ

<130>	1484PCT
<150> <151>	PD2012A000118 2012-04-18
<160>	3
<170>	PatentIn version 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 739 Белок Vibrio alginolyticus

<220>

<221> mat_peptide <222> (1)..(739) <223>

<400> 1

Thr Ala Cys Asp Leu Glu Ala Leu Val Thr Glu Ser Ser Asn Gln Leu

5 10 15

- 17 031435

Ile

Ser

Glu

Ile 20

Leu

Ser

Gln

Gly

Ala 25

Thr

Cys

Val

Asn

Gln 30

Leu

Phe

Ser

Ala

Glu

Ser

Arg

Ile

Gln

Glu

Ser

Val

Phe

Ser

Ser

Asp

His

Met

35

40

45

Tyr

Asn

Ile

Ala

Lys

His

Thr

Thr

Thr

Leu

Ala

Lys

Gly

Tyr

Thr

Gly

50

55

60

Gly

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Glu

Thr

Leu

Phe

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Gly

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Ala

Glu

Phe

Tyr

Asn

Asp

Asn

Ile

Ser

Phe

Ile

Glu

Trp

Val

85

90

95

Thr

Pro

Ala

Val

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Ala

Phe

Val

Asn

Thr

Ala

Ser

100

105

110

Phe

Tyr

Glu

Asn

Ser

Asp

Arg

His

Gly

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Val

Ile

115

120

125

Ile

Thr

Met

Asp

Ser

Ala

Gly

Leu

Gln

His

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gln

Val

130

135

140

Thr

Gln

Trp

Leu

Thr

Arg

Trp

Asn

Asp

Gln

Tyr

Ala

Gln

His

Trp

Tyr

145

150

155

160

Met

Arg

Asn

Ala

Val

Asn

Gly

Val

Phe

Thr

Ile

Leu

Phe

Gly

Gly

Gln

165

170

175

Trp

Asn

Glu

Gln

Phe

Val

Gln

Ile

Ile

Gly

Asn

Gln

Thr

Asp

Leu

Ala

180

185

190

Lys

Ala

Leu

Gly

Asp

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

Ser

Ser

Ile

Gly

Ala

Glu

195

200

205

Asp

Glu

Phe

Met

Ala

Ala

Asn

Ala

Gly

Arg

Glu

Leu

Gly

Arg

Leu

Thr

210

215

220

Lys

Tyr

Thr

Gly

Asn

Ala

Ser

Ser

Val

Val

Lys

Ser

Gln

Leu

Ser

Arg

225

230

235

240

Ile

Phe

Glu

Gln

Tyr

Glu

Met

Tyr

Gly

Arg

Gly

Asp

Ala

Val

Trp

Leu

245

250

255

Ala

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Cys

Ser

Glu

Phe

Gly

260

265

270

- 18 031435

Ile

Cys

Asn 275

Phe

Glu

Thr

Glu

Leu 280

Lys

Gly

Leu

Val

Leu 285

Ser

Gln

Thr

Tyr

Thr

Cys

Ser

Pro

Thr

Ile

Arg

Ile

Leu

Ser

Gln

Asn

Met

Thr

Gln

290

295

300

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Ala

Cys

Ser

Lys

Met

Gly

Tyr

Glu

Glu

Gly

Tyr

305

310

315

320

Phe

His

Gln

Ser

Leu

Glu

Thr

Gly

Glu

Gln

Pro

Val

Lys

Asp

Asp

His

325

330

335

Asn

Thr

Gln

Leu

Gln

Val

Asn

Ile

Phe

Asp

Ser

Ser

Thr

Asp

Tyr

Gly

340

345

350

Lys

Tyr

Ala

Gly

Pro

Ile

Phe

Asp

Ile

Ser

Thr

Asp

Asn

Gly

Gly

Met

355

360

365

Tyr

Leu

Glu

Gly

Asp

Pro

Ser

Gln

Pro

Gly

Asn

Ile

Pro

Asn

Phe

Ile

370

375

380

Ala

Tyr

Glu

Ala

Ser

Tyr

Ala

Asn

Ala

Asp

His

Phe

Val

Trp

Asn

Leu

385

390

395

400

Glu

His

Glu

Tyr

Val

His

Tyr

Leu

Asp

Gly

Arg

Phe

Asp

Leu

Tyr

Gly

405

410

415

Gly

Phe

Ser

His

Pro

Thr

Glu

Lys

Ile

Val

Trp

Trp

Ser

Glu

Gly

Ile

420

425

430

Ala

Glu

Tyr

Val

Ala

Gln

Glu

Asn

Asp

Asn

Gln

Ala

Ala

Leu

Glu

Thr

435

440

445

Ile

Leu

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Thr

Leu

Ser

Glu

Ile

Phe

Glu

Thr

Thr

450

455

460

Tyr

Asp

Gly

Phe

Asp

Val

Asp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Trp

Gly

Tyr

Leu

Ala

465

470

475

480

Val

Arg

Phe

Met

Phe

Glu

Asn

His

Lys

Asp

Asp

Val

Asn

Gln

Met

Leu

485

490

495

Val

Glu

Thr

Arg

Gln

Gly

Asn

Trp

Ile

Asn

Tyr

Lys

Ala

Thr

Ile

Thr

500

505

510

Gln

Trp

Ala

Asn

Leu

Tyr

Gln

Ser

Glu

Phe

Glu

Gln

Trp

Gln

Gln

Thr

515

520

525

- 19 031435

Leu Val 530

Ser Asn Gly Ala

Pro 535

Asn

Ala

Val

Ile

Thr 540

Ala

Asn

Ser

Lys

Gly

Lys

Val

Gly

Glu

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

Ser

Glu

Asn

Ser

Thr

Asp

545

550

555

560

Pro

Asn

Gly

Lys

Ile

Val

Ser

Val

Leu

Trp

Asp

Phe

Gly

Asp

Gly

Ser

565

570

575

Thr

Ser

Thr

Gln

Thr

Lys

Pro

Thr

His

Gln

Tyr

Gly

Ser

Glu

Gly

Glu

580

585

590

Tyr

Ser

Val

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Asp

Ser

Glu

Gly

Leu

Thr

Ala

Thr

595

600

605

Ala

Thr

His

Thr

Val

Val

Ile

Ser

Ala

Leu

Gly

Gly

Asn

Asp

Thr

Leu

610

615

620

Pro

Gln

Asp

Cys

Ala

Val

Gln

Ser

Lys

Val

Ser

Gly

Gly

Arg

Leu

Thr

625

630

635

640

Ala

Gly

Glu

Pro

Val

Cys

Leu

Ala

Asn

Gln

Gln

Thr

Ile

Trp

Leu

Ser

645

650

655

Val

Pro

Ala

Val

Asn

Glu

Ser

Ser

Asn

Leu

Ala

Ile

Thr

Thr

Gly

Asn

660

665

670

Gly

Thr

Gly

Asn

Leu

Lys

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asn

Ser

Gly

Trp

Pro

Asp

675

680

685

Asp

Thr

Asn

Leu

His

Gly

Trp

Ser

Asp

Asn

Ile

Gly

Asn

Gly

Glu

Cys

690

695

700

Ile

Thr

Leu

Ser

Asn

Gln

Ser

Asn

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Val

Lys

Val

Ser

705

710

715

720

Gly

Asp

Phe

Glu

Asn

Ala

Ala

Ile

Val

Val

Asp

Phe

Asp

Ala

Gln

Lys

725

730

735

Cys Arg Gln

<210>	2
<211>	814
<212>	Белок
<213>	Vibrio alginolyticus

- 20 031435 <220>

<221>

<222> (1)..(814) <223> Активная сердцевина коллагеназы от Vibrio Alginolyticus <400> 2

Met 1

Glu

Leu

Lys

Ile 5

Leu

Ser

Val

Ala

Ile 10

Ala

Thr

Thr

Leu

Thr 15

Ser

Thr

Gly

Val

Phe

Ala

Leu

Ser

Glu

Pro

Val

Ser

Gln

Val

Thr

Glu

Gln

20

25

30

His

Ala

His

Ser

Ala

His

Thr

His

Gly

Val

Glu

Phe

Asn

Arg

Val

Glu

35

40

45

Tyr

Gln

Pro

Thr

Ala

Thr

Leu

Pro

Ile

Gln

Pro

Ser

Lys

Ala

Thr

Arg

50

55

60

Val

Gln

Ser

Leu

Glu

Ser

Leu

Asp

Glu

Ser

Ser

Thr

Ala

Cys

Asp

Leu

65

70

75

80

Glu

Ala

Leu

Val

Thr

Glu

Ser

Ser

Asn

Gln

Leu

Ile

Ser

Glu

Ile

Leu

85

90

95

Ser

Gln

Gly

Ala

Thr

Cys

Val

Asn

Gln

Leu

Phe

Ser

Ala

Glu

Ser

Arg

100

105

110

Ile

Gln

Glu

Ser

Val

Phe

Ser

Ser

Asp

His

Met

Tyr

Asn

Ile

Ala

Lys

115

120

125

His

Thr

Thr

Thr

Leu

Ala

Lys

Gly

Tyr

Thr

Gly

Gly

Gly

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Leu

Glu

Thr

Leu

Phe

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Gly

Tyr

Tyr

Ala

Glu

Phe

145

150

155

160

Tyr

Asn

Asp

Asn

Ile

Ser

Phe

Ile

Glu

Trp

Val

Thr

Pro

Ala

Val

Lys

165

170

175

Glu

Ser

Val

Asp

Ala

Phe

Val

Asn

Thr

Ala

Ser

Phe

Tyr

Glu

Asn

Ser

180

185

190

Asp

Arg

His

Gly

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Val

Ile

Ile

Thr

Met

Asp

Ser

195

200

205

Ala

Gly

Leu

Gln

His

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gln

Val

Thr

Gln

Trp

Leu

Thr

210

215

220

- 21 031435

Arg Trp Asn Asp Gln 225

Tyr Ala Gln His 230

Trp

Tyr 235

Met

Arg

Asn

Ala

Val 240

Asn

Gly

Val

Phe

Thr

Ile

Leu

Phe

Gly

Gly

Gln

Trp

Asn

Glu

Gln

Phe

245

250

255

Val

Gln

Ile

Ile

Gly

Asn

Gln

Thr

Asp

Leu

Ala

Lys

Ala

Leu

Gly

Asp

260

265

270

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

Ser

Ser

Ile

Gly

Ala

Glu

Asp

Glu

Phe

Met

Ala

275

280

285

Ala

Asn

Ala

Gly

Arg

Glu

Leu

Gly

Arg

Leu

Thr

Lys

Tyr

Thr

Gly

Asn

290

295

300

Ala

Ser

Ser

Val

Val

Lys

Ser

Gln

Leu

Ser

Arg

Ile

Phe

Glu

Gln

Tyr

305

310

315

320

Glu

Met

Tyr

Gly

Arg

Gly

Asp

Ala

Val

Trp

Leu

Ala

Ala

Ala

Asp

Thr

325

330

335

Ala

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Cys

Ser

Glu

Phe

Gly

Ile

Cys

Asn

Phe

Glu

340

345

350

Thr

Glu

Leu

Lys

Gly

Leu

Val

Leu

Ser

Gln

Thr

Tyr

Thr

Cys

Ser

Pro

355

360

365

Thr

Ile

Arg

Ile

Leu

Ser

Gln

Asn

Met

Thr

Gln

Glu

Gln

His

Ala

Ala

370

375

380

Ala

Cys

Ser

Lys

Met

Gly

Tyr

Glu

Glu

Gly

Tyr

Phe

His

Gln

Ser

Leu

385

390

395

400

Glu

Thr

Gly

Glu

Gln

Pro

Val

Lys

Asp

Asp

His

Asn

Thr

Gln

Leu

Gln

405

410

415

Val

Asn

Ile

Phe

Asp

Ser

Ser

Thr

Asp

Tyr

Gly

Lys

Tyr

Ala

Gly

Pro

420

425

430

Ile

Phe

Asp

Ile

Ser

Thr

Asp

Asn

Gly

Gly

Met

Tyr

Leu

Glu

Gly

Asp

435

440

445

Pro

Ser

Gln

Pro

Gly

Asn

Ile

Pro

Asn

Phe

Ile

Ala

Tyr

Glu

Ala

Ser

450

455

460

Tyr

Ala

Asn

Ala

Asp

His

Phe

Val

Trp

Asn

Leu

Glu

His

Glu

Tyr

Val

465 470 475 480

- 22 031435

His

Tyr

Leu

Asp

Gly 485

Arg

Phe

Asp

Leu

Tyr 490

Gly

Gly

Phe

Ser

His 495

Pro

Thr

Glu

Lys

Ile

Val

Trp

Trp

Ser

Glu

Gly

Ile

Ala

Glu

Tyr

Val

Ala

500

505

510

Gln

Glu

Asn

Asp

Asn

Gln

Ala

Ala

Leu

Glu

Thr

Ile

Leu

Asp

Gly

Ser

515

520

525

Thr

Tyr

Thr

Leu

Ser

Glu

Ile

Phe

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

Gly

Phe

Asp

530

535

540

Val

Asp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Trp

Gly

Tyr

Leu

Ala

Val

Arg

Phe

Met

Phe

545

550

555

560

Glu

Asn

His

Lys

Asp

Asp

Val

Asn

Gln

Met

Leu

Val

Glu

Thr

Arg

Gln

565

570

575

Gly

Asn

Trp

Ile

Asn

Tyr

Lys

Ala

Thr

Ile

Thr

Gln

Trp

Ala

Asn

Leu

580

585

590

Tyr

Gln

Ser

Glu

Phe

Glu

Gln

Trp

Gln

Gln

Thr

Leu

Val

Ser

Asn

Gly

595

600

605

Ala

Pro

Asn

Ala

Val

Ile

Thr

Ala

Asn

Ser

Lys

Gly

Lys

Val

Gly

Glu

610

615

620

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

Ser

Glu

Asn

Ser

Thr

Asp

Pro

Asn

Gly

Lys

Ile

625

630

635

640

Val

Ser

Val

Leu

Trp

Asp

Phe

Gly

Asp

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gln

Thr

645

650

655

Lys

Pro

Thr

His

Gln

Tyr

Gly

Ser

Glu

Gly

Glu

Tyr

Ser

Val

Ser

Leu

660

665

670

Ser

Val

Thr

Asp

Ser

Glu

Gly

Leu

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

His

Thr

Val

675

680

685

Val

Ile

Ser

Ala

Leu

Gly

Gly

Asn

Asp

Thr

Leu

Pro

Gln

Asp

Cys

Ala

690

695

700

Val

Gln

Ser

Lys

Val

Ser

Gly

Gly

Arg

Leu

Thr

Ala

Gly

Glu

Pro

Val

705

710

715

720

Cys

Leu

Ala

Asn

Gln

Gln

Thr

Ile

Trp

Leu

Ser

Val

Pro

Ala

Val

Asn

725 730 735

- 23 031435

Glu

Ser

Ser Asn Leu 740

Ala

Ile

Thr

Thr Gly Asn Gly 745

Thr

Gly 750

Asn

Leu

Lys

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asn

Ser

Gly

Trp

Pro

Asp

Asp

Thr

Asn

Leu

His

755

760

765

Gly

Trp

Ser

Asp

Asn

Ile

Gly

Asn

Gly

Glu

Cys

Ile

Thr

Leu

Ser

Asn

770

775

780

Gln

Ser

Asn

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Val

Lys

Val

Ser

Gly

Asp

Phe

Glu

Asn

785

790

795

800

Ala

Ala

Ile

Val

Val

Asp

Phe

Asp

Ala

Gln

Lys

Cys

Arg

Gln

805

810

<210>	3
<211>	15
<212>	Белок
<213>	Vibrio Alginolyticus

<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(1)..(15)
<223>	N-окончание зрелой цепи
<400>	3
Thr Ala Cys Asp Leu Glu Ala Leu Val	Thr Glu	Ser Ser Asn Gln
1	5	10	15

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения и очистки коллагеназы из Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, включающий следующие стадии:

   стадия А: инокуляция Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus в колбу Эрленмейера и ферментация в культуральном бульоне на основе пептона небычьего животного происхождения или на основе смеси пептонов небычьего животного происхождения и растительного происхождения;

   стадия В: осветление ферментированного бульона, полученного на стадии А, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассеты с номинальным отсечением по молекулярной массе (MWCO) 100-500 кДа;

   стадия С: диализ и концентрирование осветленного бульона/раствора, полученного на стадии В, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 5-30 кДа;

   стадия D1: очистка раствора, полученного на стадии С, с помощью анионообменной смолы, несущей слабоосновные группы, при рН в пределах от 6,9 до 7,4;

   стадия D2: оценка коллагенолитической активности в собранных на стадии D1 фракциях с помощью стандартного хроматофорного субстрата коллагеназы;

   стадия Е: диализ и концентрирование собранных на стадии D1 фракций, которые имеют коллагенолитическую активность, определенную на стадии D2, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа;

   стадия F1: очистка раствора, полученного на стадии Е, с помощью анионообменной смолы, несущей сильноосновные группы, при рН в пределах от 6,9 до 7,4;

   стадия F2: оценка коллагенолитической активности в собранных на стадии F1 фракциях с помощью стандартного хроматофорного субстрата коллагеназы;

   стадия G: диализ и концентрирование собранных на стадии F1 фракций, которые имеют коллагено

   - 24 031435 литическую активность >95%, определенную на стадии F2, посредством ультрафильтрации в тангенциальном потоке с помощью кассет с MWCO 10-50 кДа;

   стадия Н: фильтрование раствора, содержащего коллагеназу, полученную на стадии G, через 0,2мкм абсолютный фильтр и хранение при температуре в пределах от -20 до -80°С.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии В осветление ферментированного бульона осуществляют с помощью кассеты с MWCO 300 кДа;

   на стадии С диализ и концентрирование осветленного бульона/раствора осуществляют с помощью кассет с MWCO 10 кДа;

   на стадии D1 очистку раствора осуществляют при рН 7,1;

   на стадии Е диализ и концентрирование фракций осуществляют с помощью кассет с MWCO 30 кДа; на стадии F1 очистку раствора осуществляют при рН 7,1;

   на стадии G диализ и концентрирование фракций осуществляют с помощью кассет с MWCO 30 кДа.
3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором культурный бульон основан на пептоне свиного животного происхождения или на смеси пептонов свиного и растительного происхождения.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором слабоосновные группы анионообменной смолы представляют собой диэтиламиноалкильные группы и сильноосновные группы анионообменной смолы представляют собой группы четвертичного аммония.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что слабоосновные группы анионообменной смолы представляют собой диэтиламиноэтильные группы.
6. 6. Коллагеназа из Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, полученная и очищенная способом по любому из пп.1-5, отличающаяся молекулярной массой 82 кДа;

   удельной активностью в пределах от 1000 до 1800 нкатал/мг;

   чистотой в пределах от 98,0 до 100%;

   отсутствием микробных и белковых загрязнений;

   стабильностью при рН в пределах от 5,5 до 11;

   стабильностью в водном растворе при 4°С в течение 30 дней;

   стабильностью в водном растворе при температуре в пределах от -20 до -80°С в течение 24-48 месяцев;

   лиофилизируемостью с получением стабильного лиофильного порошка.
7. 7. Коллагеназа по п.6, которая стабильна в водном растворе, содержащем 25 мМ TRIS-HCl и 10 мМ CaCl2, при рН 7,1.
8. 8. Препарат в форме стабильного лиофильного порошка, включающий 2,5-3,5% коллагеназы по любому из пп.6 и 7, 95-96% мальтозы и 1,0-1,5% солей, причем ферментативная активность коллагеназы находится в пределах от 7 до 20 нкатал/мг препарата.
9. 9. Препарат по п.8, содержащий

   95,75% мальтозы

   1,3% солей

   2,95% коллагеназы.
10. 10. Применение коллагеназы по любому из пп.6 и 7 в лечении ожогов различной степени, пролежней, ошпаривания, кожных язв различной природы, сосудистых и диабетических язв, целлюлита, послеоперационных спаек, гипертрофических рубцов и келоидов.
11. 11. Применение коллагеназы по любому из пп.6 и 7 в лечении адгезивного капсулита, синдрома Дюпюитрена и болезни Пейрони.
12. 12. Фармацевтическая композиция в форме пылевидного порошка для местного лечения ожогов различной степени, пролежней, ошпаривания, кожных язв различной природы, сосудистых и диабетических язв, целлюлита, послеоперационных спаек, гипертрофических рубцов и келоидов, содержащая коллагеназу по п.6, в количестве, эквивалентном активности, находящейся в пределах от 2 до 8 нкатал/г готовой композиции;

    гликолят кукурузного крахмала в качестве наполнителя в необходимом количестве.
13. 13. Фармацевтическая композиция по п.12, дополнительно содержащая гиалуроновую кислоту со средневзвешенной молекулярной массой от 130 до 230 кДа в количестве от 0,1 до 5%.
14. 14. Фармацевтическая композиция по п.12, дополнительно содержащая гиалуроновую кислоту со средневзвешенной молекулярной массой от 130 до 230 кДа в количестве от 0,1 до 5% и коллоидный диоксид кремния в количестве от 0,1 до 3%.
15. 15. Фармацевтическая композиция для инъекций для лечения адгезивного капсулита, синдрома Дюпюитрена и болезни Пейрони, содержащая коллагеназу по п.6 в форме, полученной сушкой вымораживанием, или препарат по п.9, в количестве, эквивалентном активности, находящейся в пределах от 120 до 450 нкатал/дозу;

    стерильный солевой раствор.

    - 25 031435
16. 16. Фармацевтическая композиция для инъекций по п.15, дополнительно содержащая гиалуроновую кислоту со средневзвешенной молекулярной массой от 750 до 1200 кДа в концентрации от 1 до 30 мг/мл солевого раствора.

    4700 Reflector Spec #1 [BP - 1335.6,1312]