CN111424025A

CN111424025A - 用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的胶原酶的新方法

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Publication number: CN111424025A
Application number: CN202010162055.8A
Authority: CN
Inventors: S·瓦卡罗; M·卡普托; C·库帕里; G·盖恩纳里
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2020-07-17
Also published as: US20200354707A1; US20170314005A1; CA2870493A1; CA2870493C; CN104508127A; EA201491708A1; CN104508127B; EP2839000A1; PT2839000E; DK2839000T3; ITPD20120118A1; US20150056179A1; US9738883B2; WO2013156525A1; EP2839000B1; ES2575878T3; EA031435B1; US10774319B2; HK1208882A1; US11613743B2

Abstract

本发明要求用于产生和纯化通过非致病性需氧细菌溶藻弧菌解毒化学变型(NCIMB编号：11038，异名LMG 3418，后文中称为溶藻弧菌)产生的微生物胶原酶(微生物胶原酶EC 3.4.24.3)的新方法，该方法以稳定、可重现、便宜的发酵方法提供高产生水平的胶原酶。按照本文所述的方法从溶藻弧菌产生的胶原酶还具有优于其他微生物胶原酶的比活，在水溶液中稳定，且可以冷冻而无显著损伤。本发明的另一目的是包含按照所述的产生和纯化方法获得的胶原酶的药物组合物，其用于表征为胶原累积的障碍的治疗性处理的目的，或用于从减少局部胶原累积受益的瑕疵/缺陷的处理。

Description

用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的胶原酶的新方法

本申请为2013年4月17日提交的，发明名称为“用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的胶原酶的新方法”的申请号为 201380020103.8的分案申请。

技术领域

胶原酶是具有蛋白水解活性的金属酶，其需要活性部位中的锌离子来执行其分解天然胶原的具体功能。与其他蛋白酶不同，它们可以在生理pH 和温度条件下水解胶原。许多由细菌产生的胶原酶为现有技术中已知(弧菌属(Vibrio)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属 (Pseudomonas))；由梭菌属产生的那些胶原酶

广泛用于治疗多种来源的皮肤溃疡、褥疮、不同程度的烧伤和肥大性瘢痕的药物组合物中，因为它们分解存在于坏死组织中的胶原。这便于去除细胞碎片，细胞碎片常构成上皮细胞在创伤愈合和再生上皮过程中迁移的障碍(Rao, D.B.等,1975)。最近也将来自弧菌属的胶原酶用于相似目的(EP1901755)；此专利仅描述了包含角叉藻聚糖作为稳定剂的亲脂性组合物(脂质凝胶 (lipogel))。但是，通常由该物质发挥的炎性作用为技术人员已知。在任何情况下，不考虑其来源，胶原酶在水性载体中具有极低的稳定性，因此总是配制在完全亲脂的载体中；

和Bionect

是具有全亲脂基的软膏剂，其中酶绝非均匀分布，且随时间推移而经历显著的活性丧失。

亲脂性载体确保酶的稳定性和药物产品的可保存性，而对其治疗活性不利；胶原酶非常缓慢地从亲脂性载体释放，以致其生物利用率极大地受限。胶原酶也可以用于诸如粘连性囊炎(冻结肩)、掌挛缩病(Dupuytren’s contracture)、纤维性海绵体炎(Peyronie’s disease)、蜂窝织炎和手术后粘连的障碍的全身治疗，尤其是通过注射。在水性载体中的稳定性对这些应用至关重要。用于掌挛缩病的注射治疗的产品目前已上市(在使用时复溶的亲液物质)，该产品以精确的重量比包含通过发酵溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)提取和纯化的两种胶原酶的混合物。

如已述，后者是胶原酶最常见的来源之一；但是，它是需要厌氧发酵的致病微生物(Mandl,I.等,1958,Arch Biochem Biophys,74:465-475)。

1972年首次鉴定了无色杆菌属(Achromobacter)的一些菌株的溶胶原活性(Thomson,J.A.,Woods,D.R.和Welton,R.L.1972)，随后对解毒无色杆菌(Achromobacteriophagus)菌株(随后重新归类为溶藻弧菌解毒化学变型(Vibrio alginolyticuschemovar.iophagus)，Emod,I.等1983)进行了第一批研究，这些研究证明了具有高比活的胶原酶的存在(Welton和Woods 1973)。关于用来通过发酵产生胶原酶的微生物的选择，溶藻弧菌的使用比溶组织梭菌更有利，因为它是非致病性的，且允许在需氧环境中进行发酵，具有相当大的工业优势。微生物菌株的致病性是重要方面，因为成品中的任意杂质(微生物或蛋白质残余物)可引起严重的副作用。操作致病菌株明显需要在纯化阶段特别注意，因此是更复杂、昂贵的工业方法。

产生自溶藻弧菌的微生物胶原酶EC 3.4.24.3是Zn²⁺金属酶，其还因许多原因而不同于由溶组织梭菌产生的胶原酶：

·它特异性作用于合成肽Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg(其中PZ＝4-苯基偶氮苄基氧羰基)，该合成肽是选择用于评价溶胶原活性的合成底物。按照本发明产生的来自溶藻弧菌的胶原酶是唯一一种能够在 Leu-Gly键处分解胶原的胶原酶(Keil,B.,Gilles A.-M.,Lecroisey, A.,Hurion,N.和Tong,N.-T.1975；Keil B.Matrix Suppl. 1992；1:127-33)；

·它具有比获自溶组织梭菌的类似物高得多的蛋白水解活性；

·它在天然胶原的切割位点处具有特异性；它在2个位点处切割天然胶原的螺旋链，优选在距N端3/4的Pro-Y-Gly-Pro序列的Y-Gly 键处，其中Y是中性氨基酸。相反，来自溶组织梭菌的胶原酶在天然胶原链中存在多个切割位点(Lecroisey,A.Keil,B.1979)。

溶藻弧菌解毒化学变型菌株仅产生一种胶原酶，但纯化产物的 SDS-PAGE分析证明保持溶胶原活性的几个具有不同分子量的条带的存在。已将这些低分子量种类归因于该酶的自体蛋白水解过程，该过程受特别配制的缓冲液抑制(Keil-Dlouha,V.1976)。

1992年，Takeuchi等从溶藻弧菌克隆了编码胶原酶的整个序列。从核苷酸序列推断的氨基酸序列显示成熟胶原酶由739个氨基酸形成，具有 81,875Da的分子量。来自溶藻弧菌的胶原酶的核苷酸和氨基酸序列未与其他胶原酶的序列显示任何显著的相似性(Takeuchi,H.,1992)。到目前为止，用于从所讨论的菌株产生酶的方法产生相当低的产率及尤其是对注射用途而言具有不能令人满意的纯度的产物。专利EP 0115974描述了用于产生和纯化来自溶藻弧菌胶原酶的方法；终产品是仅在加入牛皮胶原片段(ASF) 后稳定的酶混合物(胶原酶、中性蛋白酶和内切核酸酶)。

所获得的物质具有非常低的纯度。此外，在通过注射施用所选择的药物组合物时，ASF的存在可以在制备所鉴定的药物形式时或尤其是在它是动物来源的物质时产生问题。

此外，如已述，目前已知的药物组合物采用软膏剂的形式，而对于局部应用，尤其是对于全身施用，胶原酶处于极纯的形式且在水性载体中稳定(以改善酶在组合物中的分布)是至关重要的；绝对优选水性载体用于注射治疗。

本发明通过公开用于产生和纯化来自溶藻弧菌的胶原酶的创新方法来克服这些问题，该方法的特征在于高产率、重现性、稳定性及成品的高纯度。成品还在水溶液中稳定，因此可以甚至在-20℃和-80℃之间的温度下长期保存而不遭受显著损伤。

由于高纯度和胶原链上切割的特异性，本文所要求的胶原酶还可以用来解离组织和分离细胞团或单细胞，以用于需要分离的细胞的所有实验和治疗方法。

发明详述

本发明要求用于产生和纯化通过非致病性需氧细菌溶藻弧菌解毒化学变型(NCIMB编号：11038，异名LMG 3418，后文中称为溶藻弧菌)产生的微生物胶原酶(微生物胶原酶EC 3.4.24.3)的新方法；该方法以稳定、可重现、便宜的发酵方法提供高产生水平的胶原酶。按照本文所述的产生和纯化方法从溶藻弧菌产生的胶原酶的序列(SEQ ID NO:1)的特征在于，与由来自溶藻弧菌的胶原酶基因编码的814个氨基酸的序列(本文报道为 SEQID NO:2，对应于微生物胶原酶EC 3.4.24.3)相比，缺失了氨基酸1-75。通过本发明的方法，产生了成熟蛋白质，该成熟蛋白质是活性核心，由739 个氨基酸组成，更确切而言，由氨基酸76-814组成：

此外，按照本发明的方法从溶藻弧菌产生的胶原酶还具有优于其他微生物胶原酶的比活，更纯，在水溶液中稳定，且可以冷冻而无显著损伤。

因此，本发明的另一个目的是按照所述的产生和纯化方法获得的胶原酶，其用于表征为胶原的累积的病理的治疗性处理，或用于从减少局部胶原累积受益的瑕疵/缺陷的处理；例如，值得一提的是，多种来源的皮肤溃疡、褥疮、不同程度的烧伤、烫伤和肥大性瘢痕、蜂窝织炎、手术后粘连，以及“冻肩”或粘连性囊炎、掌挛缩病、阴茎纤维性海绵体炎。

本发明的另一目的是包含按照所述的产生和纯化方法获得的胶原酶的药物组合物，其用于表征为胶原的累积的障碍的治疗性处理，或用于从减少局部胶原累积受益的瑕疵/缺陷的处理；实例是多种来源的皮肤溃疡、褥疮、不同程度的烧伤、烫伤和肥大性瘢痕、蜂窝织炎、手术后粘连、粘连性囊炎(冻肩)、掌挛缩病和阴茎纤维性海绵体炎。

按本文所述获得的胶原酶还适合应用于组织解离，及细胞团或单细胞的分离。此应用用于例如胰岛细胞移植方法，以从周围胰腺组织分离胰岛细胞，且通常用于需要组织解离的所有实验和治疗方法。

通过下文所述的方法获得的胶原酶表征为：

分子量为82Kda；

比活在1000和1800nkat/mg之间；

纯度在98.0和100％之间；

缺乏微生物和蛋白质污染物，特别是缺乏内毒素和DNA；

在5.5和11之间的pH下稳定；

在4℃和40℃之间的T下在水溶液中稳定，尤其是在37℃下稳定；

在4℃下在水溶液中稳定30天；

在-20℃和-80℃之间的T下在水溶液中稳定24-48个月；

获得稳定冷冻粉末的亲液性(lyophilisability)。

它优选还表征为：

N端序列：H₂N-Thr-Ala-Cys-Asp-Leu-Glu-Ala-Leu-Val-Thr-Glu-

Ser-Ser-Asn-Gln(SEQ ID NO:3)；

受Ag和Cu盐及螯合剂EDTA抑制；

可在-20℃和-80℃之间的温度下(即以冷冻形式)保存而无酶活性的显著丧失(5-15％)。

本发明的胶原酶产生和纯化方法包括以下阶段：

阶段A：将溶藻弧菌解毒化学变型接种入三角瓶，并用非牛动物来源的培养液发酵；

阶段B：通过用100-500kD分子量截留(MWCO)盒(优选300kD)进行切向流超滤(TFF1)来澄清这样获得的发酵液；

阶段C：通过用5-30kD MWCO盒(优选10kD MWCO)进行切向流超滤(TFF2)来透析和浓缩阶段B中获得的澄清培养基；

阶段D：在6.9和7.4之间的pH下，优选在7.1的pH下，通过携带弱碱性基团的阴离子交换树脂来纯化阶段C中获得的含有胶原酶的溶液；

阶段E：通过用10-50kD MWCO盒(优选30kD MWCO)进行切向流超滤(TFF3)来透析和浓缩所收集的源自阶段D的具有溶胶原活性的级分；

阶段F：在6.9和7.4之间的pH下，优选在7.1的pH下，通过携带强碱性基团的阴离子交换树脂来纯化这样获得的溶液；

阶段G：通过用10-50kD MWCO盒(优选30kD MWCO)进行切向流超滤(TFF4)来渗滤和浓缩源自阶段F的具有≥95％的溶胶原活性的级分；

阶段H：通过0.2μm绝对过滤器过滤这样获得的含有胶原酶的溶液，并保存在-20℃和-80℃之间的温度下。

在每个阶段结束时用下文“测试方法”段落中所述的材料和方法测试。

阶段A：是分批发酵法；在含有培养液的三角瓶中制备接种物，该培养液由非牛动物来源(如猪来源)的蛋白胨或非牛动物和植物来源的蛋白胨的混合物、NaCl、CaCl₂和TRIS(三羟甲基氨基甲烷)在6.9和7.4之间，优选7.1的pH下形成。在600nm下测量的光密度(OD_600nm)达到1和4之间的值时，接种物即可转移至发酵罐。

用来进行发酵的培养基与用来制备接种物的相同，加入少量消泡剂来防止由通气和搅拌引起的泡沫形成。

一次发酵持续14-20小时，通常为16小时。发酵期间，通过无菌方法取样来检验纯度、OD_600nm、酶活性和pH。

在酶活性≥25,000nkat/升时，终止发酵，并加入CaCl₂来稳定酶。使温度降至约8℃，并使混合物处于搅拌之下。

对在阶段A获得的溶液进行以下控制测试：OD_600nm、pH、酶活性、蛋白质浓度、SDS-PAGE。

除目的胶原酶外，源自阶段A的发酵液含有(present)在发酵期间由细菌产生的其他蛋白酶(主要是丝氨酸蛋白酶)、具有高分子量的蛋白质聚集体和培养基的残留物。

阶段B：通过用100-500kD MWCO盒(优选300kD)进行切向流超滤 (TFF1)来澄清源自阶段A的发酵液；这消除了微生物细胞和具有高分子量的蛋白质聚集体。

对在阶段B获得的溶液进行以下控制测试：pH、酶活性、蛋白质浓度、 SDS-PAGE、酪蛋白酶测定。

阶段C：通过用5-30kD MWCO盒(优选10kD MWCO)进行超滤来浓缩和透析源自阶段B的澄清培养基15-25倍。在阶段C获得的溶液通常含有500-700nkat/ml的酶活性，且在-20℃下稳定12个月。用5-30kD MWCO盒进行的切向流过滤的目的是显著减小体积，并用25mMTRIS-HCl、10mM CaCl₂、pH 7.1缓冲液替换培养基，该缓冲液稳定胶原酶，且适合用于随后的纯化方法。

对在阶段C获得的溶液进行以下控制测试：pH、酶活性、蛋白质浓度、SDS-PAGE。

阶段D：用携带二乙基氨基烷基，优选二乙基氨基乙基的阴离子交换树脂，如DE-52(二乙基氨基乙基纤维素DEAE Whatman)对源自阶段C的含有胶原酶的溶液进行第一次层析纯化。这些树脂携带弱碱性基团，因此在6.9和7.4之间的窄pH范围内，优选7.1具有依赖于pH的离子化程度。

然后将源自阶段C的含有胶原酶的溶液上样至用DE-52树脂装填的柱 (PallChromatography Column Resolute Mod.400-V-EP7040)内。通过紫外 -可见光检测器在280nm监测层析运行。

在对柱进行上样前，用与在阶段C期间在其中透析胶原酶的缓冲液相同的缓冲液(后文称为“平衡缓冲液”(25mM TRIS-HCl、10mM CaCl₂、 pH 7.1))平衡柱。

上样后，用相同的平衡缓冲液洗脱具有结合的胶原酶的树脂，以消除未与树脂结合的蛋白质。用具有更高电导的缓冲液(后文称为“洗涤缓冲液” (300mM TRIS-HCl和10mMCaCl₂、pH 7.1))进行第二次洗涤，以消除低分子量杂质。用称为“洗脱缓冲液”(300mMTRIS-HCl、700mM NaCl 和10mM CaCl₂、pH 7.1)的第三缓冲液通过进一步提高电导来洗脱与树脂结合的胶原酶。

阶段E：将洗脱期间收集的含有胶原酶活性且在SDS-PAGE中显示良好纯度的级分组合，并转移至具有10-50kD MWCO盒(优选30kD)的超滤系统，以在稳定胶原酶且适合用于随后的纯化方法的缓冲液中浓缩和透析。

对在阶段E获得的溶液进行以下控制测试：pH、酶活性、蛋白质浓度、 SDS-PAGE、酪蛋白酶测定。

阶段F：将源自阶段E的溶液转至具有阴离子交换层析的第二纯化阶段，该阴离子交换层析使用携带由季铵形成的强碱性交换基团的树脂，如 Source^TM15Q(GEHealthcare)。通过紫外-可见光检测器在280nm监测层析运行。

上样前，用与在阶段E期间在其中透析胶原酶的缓冲液相同的缓冲液 (平衡缓冲液)平衡用Source^TM15Q树脂装填的柱(Millipore GS 70-550)。

将源自阶段E的含有胶原酶的溶液上样至柱中，并用平衡缓冲液洗脱具有结合的胶原酶的树脂，以消除未结合的蛋白质。用第二缓冲液(洗脱缓冲液，2-300mM TRIS-HCl和10mM CaCl₂、pH 7.1)通过进一步提高电导来洗脱与树脂结合的胶原酶。

阶段G：将洗脱期间收集的含有溶胶原活性且在SDS-PAGE中显示≥ 95％的纯度的级分组合，并转移至具有10-50kD MWCO盒(优选30kD) 的超滤系统，以在稳定胶原酶的缓冲液中浓缩和透析。

对在阶段G获得的溶液进行以下控制测试：pH、酶活性、蛋白质浓度、SDS-PAGE。

阶段H：将源自阶段G的胶原酶溶液稀释在稳定缓冲液中，并滤过 0.2μm绝对过滤器。这样获得的无菌溶液是纯化方法的终产品，针对以下特征进行分析：

-蛋白质浓度

-酶活性

-pH

-酪蛋白酶测定

-SDS纯度

-UPLC SEC二聚体和高分子量分析

-内毒素

-无菌测试

分析方法

胶原酶的酶活性的分光光度测定(Wünsch,E.,&Heidrich,H.G.,修改)

本方法允许测定存在于水溶液中的胶原酶的活性。活性表示为开特，其定义为在方法指定的条件下在1秒内催化1摩尔底物的转化的酶的量。与所分析的溶液的量相关的在37℃和pH 7.1下在预设时间内催化底物转化的酶的量表示为nkat/ml。该方法的原理基于胶原酶和胶原酶特异的合成底物PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸(其中PZ＝4-苯基偶氮苄基氧羰基)之间的反应。与胶原酶反应后，合成底物切割为2个片段：PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酰和甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸。第二片段是无色的，而第一片段是生色团，且可以在用用柠檬酸酸化的乙酸乙酯的有机溶液萃取后通过分光光度法测定。该片段在320nm的吸光度与酶活性成比例。

为了进行酶促测定，有必要制备样品的一系列稀释液，以使酶浓度落入该方法的线性范围。

将待分析的样品稀释在25mM Tris、10mM CaCl₂、pH 7.1缓冲液中；使0.5ml此缓冲溶液与2ml 1.23mM的合成底物溶液在37℃反应15分钟。在酶促反应结束时，用含5:1乙酸乙酯和0.5％柠檬酸的混合物、pH 3.5 的有机相萃取0.5ml反应混合物。去除有机相，并通过加入300mg无水硫酸钠来脱水。在320nm通过分光光度法针对乙酸乙酯分析经脱水的有机相。用以下公式计算表示为nkat/ml的酶活性的结果：

1000＝从μmol至nmol的转化因子

900＝15分钟的秒数

fd＝胶原酶溶液的初始稀释度的转化因子

50＝样品稀释度的转化因子(取0.5ml并稀释至2.5ml。取0.5ml并稀释至5ml)

标准浓度(μmol/ml)＝0.02＝0.4ml 250μM溶液稀释至5ml。

通过与胶原酶相同的酶促反应来提供空白，其中用参考缓冲液(25mM Tris、10mMCaCl₂、pH 7.1)替代含有酶的溶液。

标准是乙酸乙酯中的反应片段PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酸的0.2504mM 溶液。

将0.4ml此溶液加至由4.6ml乙酸乙酯和1ml 0.5％柠檬酸组成、pH 3.5的溶液。去除有机相，并通过加入300mg无水硫酸钠来脱水。在320nm 通过分光光度法针对乙酸乙酯分析经脱水的有机相。

通过Lowry法测定蛋白质浓度

通过以下参考文献的Lowry法来测定含有胶原酶的溶液的蛋白质浓度：

1.European Pharmacopoeia 5.0,Total Protein,Chapter 2.5.33；

2.Lowry,O.H.等,1951,“Protein measurement with the Folin phenolreagent”,J.Biol.Chem.,193,265–275.

UPLC大小排阻

用UPLC大小排阻分析来测定二聚体和高分子量分子(定义为杂质)和/ 或胶原酶降解产物。所用仪器是配有Acquity UPLC BEH 200SEC柱的具有PDA eλ检测器的AcquityUPLC H-Class。用按以下配制的pH 6.4-6.7 的磷酸盐缓冲液以无梯度模式进行分析：Na₂PO₄ 8.9g/l、NaH₂PO₄ 6.9g/l 和NaCl 8.76g/l。缓冲液在使用前滤过0.2μm绝对过滤器。对于每个测试，将1.5-4μg蛋白质注入5μl体积。

SDS-PAGE电泳

按照Laemmli法(Laemmli,U.K.,1970,“Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4”,Nature,227, 680-685)在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。

酪蛋白酶的测定

用酪蛋白酶测定作为用于测定作为杂质存在于胶原酶溶液中的非特异性蛋白酶的方法。该分析方法按照Anson,M.L.(1938)J.Gen.Physiol.22, 79-89，和Folin,O.和Ciocalteu,V.(1927)J.Biol.Chem.73,627-650进行。用酪蛋白作为底物测定酪蛋白酶。该反应可以示意性显示如下：

通过用Folin-Ciocalteu试剂探究反应来比色测定反应产生的酪氨酸的量，该试剂具有在碱性环境中氧化酪氨酸使得它显示蓝色的特性。简言之，将1ml待分析溶液加至5ml 0.65％(W/V)酪蛋白溶液，并使其在37℃反应30分钟。在孵育结束时加入0.5ml三氯乙酸(TCA)，2分钟后将样品滤过0.45μm滤器。收集滤液；加入5ml 0.5M Na₂CO₃和1ml 0.5NFolin-Ciocalteu，使混合物在37℃反应30分钟。在反应结束时，进一步将样品滤过0.45μm滤器，用分光光度计分析滤液，在660nm波长测量吸光度。同时，用1.1mM L-酪氨酸溶液作为标准制备空白和校准线。

用以下公式计算结果：

c＝已知项

m＝角系数

10＝从30分钟至5小时的转化因子

6.5＝以ml表示的终止溶液的总体积

8＝比色液的总体积

1＝胶原酶样品的ml数

2＝用于显色的样品的ml数

fd＝稀释因子

光密度OD_600nm的测量

此方法允许评价产生方法的从5升三角瓶至1000升生物反应器的多个阶段期间的细胞生长。为了进行OD_600nm测量，取1ml细胞悬液，12000rcf 离心5分钟，去除上清，将细胞重悬在1ml蒸馏水中，然后在600nm读取吸光度。

内毒素测定

按欧洲药典，内毒素测试，2.6.14章中所述进行最终胶原酶溶液中的内毒素测定。

通过UPLC测定胶原酶的酶活性

本方法允许通过UPLC分析来定量胶原酶的活性。该方法基于对外部标准定量由酶促反应(按照Wünsch法)产生的片段。

与所分析的溶液的量相关的在37℃和pH 7.1下在预设时间内催化底物转化的酶的量表示为nkat/ml。活性表示为开特，其定义为在该方法所指定的条件下在1秒内催化1摩尔底物转化的酶的量。

该方法在线性条件中的使用范围扩展至可按照所述方法分析的溶液中胶原酶的最大活性约1.2nkat/ml，无需进行“稀释”。

使胶原酶的水溶液与合成底物PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸(其中PZ＝4-苯基偶氮苄基氧羰基)反应。在受控条件(pH、温度、时间)下释放两个片段：PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酸；甘氨酰-L-脯氨酰-D- 精氨酸。通过UPLC测定第二片段。

UPLC系统的运行参数为：

-流速：0.919ml/分钟

-运行持续时间：3分钟

-波长：320nm

-注射体积：1.4μl

-柱温：25℃

时间(分钟)	柠檬酸0.5％w/v pH 3.5	乙腈
			0	50	50
1.17	50	50
			0.34	10	90
1.13	10	90

在这些条件下，底物在约0.25分钟后洗脱，片段在约0.44分钟后洗脱。

酶活性的测定由以下步骤组成：

I.制备25mM TRIS-HCl、10mM CaCl₂、pH 7.1缓冲溶液(试剂A)。

II.制备0.5％柠檬酸溶液(试剂B)。

III.制备1.23mM底物溶液(试剂C)。

IV.在乙腈中制备200μM的PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酸溶液(试剂E)。

V.制备待分析的胶原酶溶液(溶液D)。用缓冲溶液(试剂A)在容量瓶中稀释酶溶液，以获得活性低于1.2nkat/ml的溶液。

VI.酶促反应。用玻璃吸管将2ml试剂C和0.5ml溶液D吸入螺口试管。使混合物在恒温槽中37℃反应15分钟。反应结束时，此溶液称为溶液Y。按以下平行制备“空白”W：2ml试剂C和0.5ml缓冲溶液(试剂A)。使混合物在恒温槽中37℃反应15分钟。

VII.通过吸取0.5ml溶液Y并将它引入含有2.0ml 0.5％柠檬酸的10 ml瓶中，并用乙腈补足体积来制备样品。

VIII.通过将0.5ml空白W、2.0ml柠檬酸和1.5ml试剂E引入10ml 瓶，并用乙腈补足体积来制备参考溶液。

IX.注入1.4μl参考溶液，然后注入1.4μl待分析的溶液。

用以下公式计算表示为nkat/ml的酶活性的结果：

酶活性的计算＝每毫升溶液每秒的纳摩尔数(nkat/ml)，其中：

1000＝从微摩尔至纳摩尔的转化因子

100＝样品稀释的转化因子(0.5ml至2.5ml。0.5ml至10ml)

900＝15分钟的秒数

标准浓度(μmoles/ml)＝0.03(1.5ml 200μM溶液至10ml)

fd＝用来制备溶液D的胶原酶溶液的稀释因子

蛋白质的表征

N端序列的测定

用液相自动蛋白质测序仪(ABI-Perkin Elmer mod.477°)通过Edman 降解法测定源自溶藻弧菌解毒化学变型的胶原酶的N端氨基酸序列。对整个GenBank数据库运行序列的BLAST(Basic Logical Alignment Search Tool)检索，通过生物信息学分析来验证所获得的序列。

肽段作图分析

为了分析肽图，首先用DTT还原胶原酶，用碘乙酰胺烷化，然后用 PD10柱脱盐，用1％乙酸洗脱。对洗脱物进行胰蛋白酶消化，并用 MALDI-MS分析片段。整体质谱报道在(图1：胰蛋白酶消化分析)中；这使我们能够确定超过90％的氨基酸序列与保存在数据库中的对应于产生自溶藻弧菌解毒化学变型的胶原酶的序列相同。

圆二色性

在连接25℃恒温槽的J-810型Jasco光谱偏振计上记录远紫外圆二色 (FUV-CD)谱。用0.1cm杯子按20nm/分钟的速度记录光谱，每8秒响应一次，用于两次累积的平均。每个样品重复测试三次。

CD信号表示为平均残基椭圆率，用公式[θ]＝θobs x MRW/(10x l x c) 计算，其中θobs是观察到的以mdeg表示的椭圆率，“MRW”是每个残基的平均分子量，“T”是以cm表示的光程，“c”是以mg/ml表示的浓度。按0.2mg/ml的浓度分析样品。

附图说明

图1：胰蛋白酶消化分析

图2：产生和纯化方法的流程图

图3:300K和10K超滤阶段的SDS-PAGE

图4：DE-52的典型层析谱

图5：SDS-PAGE图

图6：Source^TM15Q的典型层析谱

图7：Source fractions^TM15Q的SDS-PAGE

图8：终产品的SDS-PAGE

图9：实验用物品

图10：用于修改的步骤1的Eppendorf管

图11：数据分析

实施例1：在800L发酵中从溶藻弧菌解毒化学变型产生和纯化胶原酶

(图2：产生和纯化方法的流程图)

发酵

发酵分为2个阶段：

阶段1：制备接种物

阶段2：发酵

阶段1：培养基为液体，由溶解在蒸馏水(Millipore milliQ)中的1.21g/l TRIS、23.4g/l NaCl、0.29g/l CaCl₂和15g/l非牛动物来源的蛋白胨(猪，或含猪和植物来源的蛋白胨的混合物)的溶液组成。用HCl将培养基的pH 调节至7.1，并在高压灭菌器中在≥122℃的温度下灭菌30分钟。将1.5ml 安瓿的溶藻弧菌解毒化学变型(WCB-工作细胞库)接种入含有2L培养基的5L三角瓶，并在30℃下约150转/分钟搅拌孵育8至16个小时。在 OD_600nm达到1和4之间的值时，接种物可转移至发酵罐。

阶段2：培养基与用于阶段1的培养基相同，加入0.25g/l Sigma 204 消泡剂，在发酵罐中≥122℃灭菌30分钟。通过无菌方法将2L接种物转移至含有800L发酵液的发酵罐，发酵参数设置如下：

-温度30℃±1℃；

-搅拌50-150转/分钟；

-空气10-80Nm³/h；

-溶解氧>50％；

-pH 7.1±0.1；

-压力0-0.4bar。

典型的发酵持续14-20小时，通常为16小时，其对应于整个发酵过程中胶原酶活性的最高水平。发酵期间，通过无菌方法取样来检验培养物的纯度、OD_600nm和酶活性。通过修改的Wünsch-Heidrich法(Wünsch,E.& Heidrich,H.G.1963)分光光度测定胶原酶的活性。

在酶活性≥25,000nkat/升时，终止发酵，并加入CaCl₂(至多为1.47g/l 的终浓度)，以稳定酶。使温度降低至约8℃，使混合物在搅拌下放置约10-30 分钟。通常，发酵液具有以下特征：

1)酶活性在25,000和50,000nkat/升之间

2)OD_600nm在5和8之间

3)缺乏微生物污染物

澄清：300kD MWCO(分子量截留)盒的TFF1超滤

将约800升发酵液转移至包含Holder Sartocon II(Sartorius)的超滤系统，其中放置了五个300kD MWCO盒(编号3021467907E-SG)，每个盒具有0.5m²的过滤面积。滤膜由改性聚醚砜(PES)制成，其主要特征是对蛋白质的低亲和力，允许>80％的培养基回收和澄清，胶原酶丧失低。

300kD盒超滤的目的是从发酵液去除微生物质，并消除约320Kda的蛋白质聚集体。

透析和浓缩：10kD MWCO盒TFF2超滤

澄清后，在PALL Mod UF-A-P0971超滤系统中浓缩和透析培养基，其中放置了六个10kD MWCO盒(编号34293012R)，每个盒具有0.5m²的过滤面积。滤膜由改性聚醚砜(PES)制成，其主要特征是对蛋白质的低亲和力，允许>80％的回收。10kD盒超滤使体积减小15-25倍，消除低分子量污染物，并用25mM TRIS、10mM CaCl₂、pH 7.1缓冲液替换培养基，该缓冲液适合用于随后的纯化方法。超滤后，进行以下分析：

1)酶活性

2)蛋白质测定

3)SDS-PAGE(图3:300K和10K超滤阶段的SDS-PAGE)

图3说明

泳道1High Range SigmaMarker^TM

泳道2 10μl发酵液

泳道3 20μl发酵液

泳道4 10μl TFF 300K滤液

泳道5 20μl TFF 300K滤液

泳道6 2μl TFF 10K截留液

泳道7 5μl TFF 10K截留液

泳道8 16μl TFF 10K截留液

泳道9 2μg FIDIA胶原酶

弱阴离子层析(Whatman DE-52)

源自超滤方法的含有胶原酶的溶液是用DE-52树脂(Whatman DEAE：二乙基氨基乙基纤维素)通过弱阴离子交换层析进行的第一步纯化的起始物质。

通过紫外-可见光检测器在280nm监测层析运行。通常，将10-25升蛋白质浓度为0.8-1.2g/l的含有胶原酶的溶液上样入用10Kg DE-52树脂装填的柱(PallChromatography Column Resolute Mod.400-V-EP7040)。上样入柱的总蛋白质的量为0.8-3g/Kg树脂。用10柱体积(BV)的25mM TRIS-HCl和10mM CaCl₂、pH 7.1(后文称为“平衡缓冲液”)平衡树脂。

上样后，用2-4BV(通常2BV)的平衡缓冲液洗脱具有结合的胶原酶的树脂，以消除未与树脂结合的蛋白质，并使电导值恢复至上样样品之前的那些值。

为了消除低分子量杂质，用3-5BV(通常4BV)按以下配制的缓冲液进一步洗脱：300mM TRIS-HCl和10mM CaCl₂、pH 7.1(洗涤缓冲液)。用 3-5BV(通常4BV)组成如下的第三缓冲液通过提高电导来洗脱与树脂结合的胶原酶：300mM TRIS-HCl、700mM NCl和10mMCaCl₂，pH 7.1(洗脱缓冲液)。

对在用洗脱缓冲液洗脱期间收集的级分进行酶活性测定，并用 SDS-PAGE分析。

如图4(DE-52的典型层析谱)中所示，典型的层析谱呈现三个不同的峰：

-第一个峰(I)(用平衡缓冲液洗脱的峰)对应于未结合的蛋白质，其无酶活性。

-第二个峰(II)对应于洗涤缓冲液的洗脱，其具有溶胶原活性，但将其废弃，因为还存在许多杂质。

-第三个峰(III)对应于洗脱缓冲液的洗脱，且是具有最高酶活性和最高纯度的峰。

通常，含有胶原酶的峰具有18-22升的体积，针对以下特征进行分析：

1)酶活性

2)蛋白质测定

3)SDS-PAGE(图5)

图5说明

泳道1 5μl TFF2后的样品

泳道2 20μl未结合

泳道3 10μl峰I级分1

泳道4 10μl峰I级分2

泳道5 10μl峰II级分1

泳道6 10μl峰II级分2

泳道7 10μl峰III

透析和浓缩：30kD MWCO盒的TFF3超滤

在Cogent^TM(Millipore)超滤系统中浓缩和透析对应于第三层析峰的级分，其中放置了两个30k MWCO盒(编号31158044R)，每个盒具有0.1m²的过滤面积。滤膜由聚醚砜(PES)制成，其主要特征是对蛋白质的低亲和力，允许>95％的回收。30kD盒超滤使体积减小3-6倍，并用25mM TRIS、 10mM CaCl₂、pH 7.1缓冲液替换来自DE-52的洗脱缓冲液，该缓冲液适合用于随后的纯化方法。对超滤液进行以下控制：

1)酶活性

2)蛋白质测定

强阴离子层析(Source^TM15Q GE Healthcare)

源自TFF3的胶原酶溶液是用Source^TM15Q树脂(GE Healthcare)通过强阴离子交换层析进行的第二步纯化的起始物质。通过紫外-可见光检测器在280nm监测层析运行。通常，将3-6升蛋白质浓度为0.8-1.2mg/ml的含有胶原酶的溶液上样入用100-200ml Source^TM15Q树脂装填的柱 (Millipore GBP 70-550)；上样入柱的总蛋白质的量为24-36mg/ml树脂。上样前，用2柱体积(BV)的10mM TRIS-HCl和10mM CaCl₂₅、pH 7.1(称为“平衡缓冲液”)平衡树脂。

上样后，用5-7BV平衡缓冲液洗脱具有结合的胶原酶的树脂，以消除未结合的蛋白质，并使电导恢复至初始值。用5-10BV的300mM Tris-HCl 和10mM CaCl₂、pH 7.1(洗脱缓冲液)洗脱与树脂结合的胶原酶。将含有胶原酶的级分洗脱在图6(Source^TM15Q的典型层析谱)中所示的层析谱中可见的单个峰(通常为1-2升)中。

对在洗脱期间收集的含有胶原酶的级分进行以下控制：

1)酶活性

2)蛋白质测定

3)SDS-PAGE(图7：Source fractions^TM15Q的SDS-PAGE)

图7说明：

泳道1 20μl未结合浓缩20X

泳道2 10μl级分1

泳道3 10μl级分2

泳道4 LMW

透析和浓缩：30kD MWCO盒的TFF4超滤

将含有胶原酶的级分转移至Cogent^TM(Millipore)超滤系统，其中放置了两个具有聚醚砜(PES)膜的30kD MWCO盒，每个盒具有0.1m²的过滤面积。此超滤步骤允许对25mMTRIS-HCl和10mM CaCl₂ pH 7.1透析和浓缩样品。

过滤和保存

将源自TFF4的溶液滤过0.2μm聚醚砜(PES)绝对过滤器进行产品的最后除菌。将终产品于专用容器中保存在-20℃。

针对以下特征分析这样获得的胶原酶溶液：蛋白质浓度、酶活性、pH、非特异性蛋白酶测定、SDS-PAGE纯度(图8：终产品的SDS-PAGE)、UPLC SEC纯度(二聚体和高分子量分析)、用于测定内毒素的LAL测试(根据欧洲药典，产品须包含不超过5IU/kg/小时)。

图8说明

泳道1 HMW

泳道2 Fidia胶原酶0.5μg/泳道

泳道3 Fidia胶原酶1μg/泳道

泳道4 Fidia胶原酶2μg/泳道

具体特征总结在下表中。

表

申请人已测试了按照本发明产生和纯化的胶原酶来验证以下特征，结果在下文给出：

纯净：具有98和100％之间的纯度；

不含微生物和蛋白质污染物(内毒素、DNA)；

在5.5和11之间的pH下稳定(通过酶促测试确定)；

在4℃和40℃之间的T下，在例如包含25mM TRIS-HCl、10mM CaCl₂、pH 7.1的水溶液中稳定，尤其是在37℃下稳定；

在4℃下在水溶液中稳定30天；

在-20℃和-80℃之间的T下在水溶液中稳定24-48个月；

可以用适宜的赋形剂(下文所述)冷冻干燥来获得稳定的亲液 (lyophilic)粉末。

用尤其适于维持其稳定性的赋形剂制备胶原酶的亲液物 (lyophilisate)(其是本发明的另一目的)，且可以优选包含：

-麦芽糖：95-96％，优选95.75％；

-盐(如TRIS-HCl+CaCl₂)：1.0-1.5％，优选1.3％；

-胶原酶：2.5-3.5％，优选2.95％，以获得具有7-20nkat/mg粉末之间的酶活性的冻干粉末。

上文针对胶原酶亲液物所示的量是与该亲液物的总重量相比按重量计的百分比。

因此，按照该产生和纯化方法获得的胶原酶适合用于制备多种类型的药物组合物，且如所述设计用于表征为胶原累积的障碍的治疗或从减少局部胶原累积受益的瑕疵/缺陷的皮肤美容(dermocosmetic)处理。最常见的应用涉及不同程度的烧伤、烫伤、褥疮、血管性溃疡和糖尿性病溃疡的外部和/或局部处理；在这些情况下，胶原酶有效地消除焦痂，从而允许活的潜在细胞活化用于修复过程的目的。其他治疗性应用涉及蜂窝织炎、手术后粘连、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩；在这些情况下，异常的胶原产生已不利地影响了正常的修复过程，它们可以从不规则累积的胶原的裂解受益。

可用胶原酶治疗的其他障碍是粘连性囊炎(冻肩)、掌挛缩病和阴茎纤维性海绵体炎。

取决于障碍，可以需要局部或全身应用，尤其是可注射的应用。

关于局部应用，本文所要求的酶在水溶液中惊人的稳定性允许将其配制在亲水性载体中；具体而言，已发现，可以用特定聚合物配制胶原酶，该聚合物与它所放置于其上的病灶的溢泌物接触而水化，产生凝胶。在这种情况下，酶逐渐地和以比用迄今用过的普通亲脂性载体获得的量更大的量释放，产生更好的疗效；还可以减少每天应用的次数，从而改善患者的依从性。在本发明的范围内优选的局部药物形式是扑粉，其工业制备无需任何特殊方法，其可以以药物制剂的形式容易地测量，正确地沉积在病灶的边缘之内，且可以长期保存。所使用的亲水性聚合物必须能够吸收由创伤快速产生的流体，产生粘性凝胶物质。该凝胶必须明显具有黏度特征，该黏度特征允许它驻留在创伤床上；过量的固体凝胶趋于玻璃化，而过量的液体凝胶携带着它所含的活性成分从创伤床滑落。此外，由于制备物必须无菌，所选择的聚合物在水化后维持其流变特性至关重要，甚至在之前通过常用手段(通常为γ射线)灭菌时。如本文简述，为了鉴定最适宜的聚合物，申请人对许多聚合物(淀粉和衍生物、藻酸盐、纤维素衍生物、聚乙烯醇和衍生物、树胶和果胶)进行了一系列测试。在直径5cm的玻璃平皿中产生盐溶液的2.5mm厚的连续膜，从具有固定大小的孔的钢筛将待检查的粉状聚合物(约1g)洒在其上。加入更多液体，只要转变为凝胶的聚合物能够吸收它，维持黏度，使得它在垂直拿住时不从平皿滴下。评价液体的吸收率及所获得的凝胶的透明度和稠度后，确定最适合用于本发明的目的的聚合物是羟乙酸玉米淀粉。

由于其崩解特性，羟乙酸玉米淀粉是用于制备片剂和胶囊的细的白色、可流动、非常吸湿的粉末，但从未被直接应用使用过。羟乙酸玉米淀粉具有5.5和7.5之间的pH，即类似于将它应用于其上的组织的pH，且在水中膨胀至其体积的至多300倍。

除胶原酶外，扑粉还可以包含其他活性成分，该活性成分刺激细胞迁移，以允许创伤床更快地再生上皮，从而更快地封闭创伤。在多种可能的物质中，透明质酸是尤其适合用于这些目的；它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的交替残基组成的杂多糖。取决于它所获自的来源和所使用的制备方法，它是具有50,000和13 x 10⁶Da之间的分子量的直链聚合物。用于本发明的HA可以源自任意来源，如从鸡冠提取(EP 138572 B1)、发酵(从链球菌属(Streptococcus))或生物合成(从芽孢杆菌属(Bacillus))，且具有400和3x10⁶Da之间、尤其是1x 10⁵Da和1x 10⁶Da之间、甚至更尤其是200,000和750,000Da之间的平均分子量。优选地，本文中用于局部应用的HA具有130和230kDa之间，优选145和210kDa之间、甚至更优选160和200kDa之间的分子量；后者将在后文中称为具有200kDa的平均MW的HA。具有200和1800kDa之间，优选500和1300kDa之间、甚至更优选750和1200kDa之间的平均分子量的HA用于可注射应用。提到平均分子量指通过特性黏度法(Terbojevich等,Carbohydr Res,1986,363-377)计算的重链平均MW。

HA在自然界中见于胞外凝胶中，脊椎动物结缔组织的基质(HA是其中的主要成分之一)中，关节滑液、玻璃体液和脐带中。

已证明，HA在结构方面(在组织胞外基质及调节其水化中)及作为刺激它直接和间接涉及的一系列过程(血块形成、吞噬活性、成纤维细胞增殖、新血管形成、再生上皮等)的物质都在组织修复过程中发挥至关重要的作用 (Weigel P.等,J Theoretical Biol,1986:219-234；Abatangelo G.等,J Surg Res, 1983,35:410-416；Goa K.等,Drugs,1994,47:536-566)。本文所述制剂中的 HA的作用不仅是促进创伤愈合，更重要的是还通过阻止它们向需要再生的区域迁移来防止汇集在创伤边缘的胶原酶损伤驻留在该处的活的健康细胞。此外，如已证明及将在下文中说明，HA(其也是吸收性聚合物)的存在辅助在创伤床上形成凝胶，改善胶原酶的释放，从而改善胶原酶的酶活性。

所鉴定的制剂还可以包含促进粉末在混合阶段的滑动的物质；如技术人员已知，最常用的那些包括胶态二氧化硅，其可以可选地以0.1和3％之间，优选0.2和1％之间的量包括。

在本发明的范围内，申请人因此打算要求以扑粉的形式用于局部用途的药物组合物，其包含：

通过上述方法获得的胶原酶，以等同于2和8nkat/g成品之间，优选 5nkat/g成品的活性的量；

可选地，重量平均分子量在130和230kDa之间，优选145和210kDa 之间、甚至更优选160和200kDa之间的HA，以0.1和5％之间，优选0.2 和2％之间的量；

可选地，胶态二氧化硅，以0.1和3％之间，优选0.2和1％之间的量；

羟乙酸玉米淀粉，以达到百分比组成所需的量。

上文针对扑粉所示的量是与该组合物的总重量相比按重量计的百分比。

现将以实例而不是限制的方式描述上文公开的药物组合物的制备的一些实例。

实施例2：含有胶原酶、透明质酸(HA)和羟乙酸玉米淀粉的扑粉(制剂 1)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

胶原酶等同于5nkat/g

200kDa平均MW HA 0.2g

羟乙酸玉米淀粉适量至100g

称量约一半量的胶凝聚合物，并引入容器；称量之前微粉化并按50μ过筛的胶原酶和HA，并引入容器。最后，称量其余量的胶凝聚合物，并引入容器。通过在用聚乙烯sub-cap和聚丙烯螺旋盖密封的平行六面体聚乙烯小瓶中直接混合粉末来进行制备，该小瓶具有足以留出至少40-50％的空预留空间的容量。以斜位(45度)固定在V混合器的臂中的小瓶按50转/分钟的速度围绕其短轴倾斜旋转。进行混合，直至混合物同质。

实施例3：含有胶原酶、透明质酸(HA)、羟乙酸玉米淀粉和助流剂的扑粉(制剂2)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

称量约一半量的胶凝聚合物，并引入容器；称量之前微粉化并按50μ过筛的胶原酶和HA，并引入容器。最后，称量其余量的胶凝聚合物和助流剂，并引入容器。通过在用聚乙烯sub-cap和聚丙烯螺旋盖密封的平行六面体聚乙烯小瓶中直接混合粉末来进行制备，该小瓶具有足以留出至少 40-50％的空预留空间的容量。以斜位(45度)固定在V混合器的臂中的小瓶按50转/分钟的速度围绕其短轴倾斜旋转。进行混合，直至混合物同质。

实施例4：含有胶原酶、透明质酸(HA)、羟乙酸玉米淀粉和助流剂的扑粉(制剂3)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

对于制备，见实施例2。

实施例5：含有胶原酶和羟乙酸玉米淀粉的扑粉(制剂4)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

胶原酶等同于5nkat/g

羟乙酸玉米淀粉适量至100g

称量约一半量的胶凝聚合物，并引入容器；称量胶原酶，并引入容器。最后，称量其余量的胶凝聚合物，并引入容器。通过在用聚乙烯sub-cap 和聚丙烯螺旋盖密封的平行六面体聚乙烯小瓶中直接混合粉末来进行制备，该小瓶具有足以留出至少40-50％的空预留空间的容量。以斜位(45度) 固定在V混合器的臂中的小瓶按50转/分钟的速度围绕其短轴倾斜旋转。进行混合，直至混合物同质。

实施例6：含有胶原酶、羟乙酸玉米淀粉和助流剂的扑粉(制剂5)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

胶原酶等同于5nkat/g

胶态二氧化硅 0.2g

羟乙酸玉米淀粉适量至100g

称量约一半量的胶凝聚合物，并引入容器；称量胶原酶，并引入容器。最后，称量其余量的胶凝聚合物和助流剂，并引入容器。通过在用聚乙烯 sub-cap和聚丙烯螺旋盖密封的平行六面体聚乙烯小瓶中直接混合粉末来进行制备，该小瓶具有足以留出至少40-50％的空预留空间的容量。以斜位(45度)固定在V混合器的臂中的小瓶按50转/分钟的速度围绕其短轴倾斜旋转。进行混合，直至混合物同质。

实施例7：含有胶原酶、羟乙酸玉米淀粉和助流剂的扑粉(制剂6)的制备

测量亲液形式的胶原酶，使得它对应于5nkat/g成品的活性。

胶原酶等同于5nkat/g

胶态二氧化硅 1g

羟乙酸玉米淀粉适量至100g

对于制备，见实施例5。

如所述，在水化后评价了该扑粉灭菌前和灭菌后的流变学及其就胶原酶释放而言的表现。通过与在亲脂性载体中包含胶原酶的标准产品(Bionect

)比较来进行此最后的测试。

灭菌前和灭菌后的流变学评价

按照实施例1和3制备制备所测试的样品，该样品代表了所鉴定的那些制剂中最复杂的制剂。

用7ml盐溶液水化各1g未灭菌的制剂1和制剂3；对1g预先用γ射线(剂量25kGray)灭菌的相同制剂进行相同的方法。用配有60mm直径和1度角的板-锥测量的HAAKE mod.MarsII黏度计分析这样获得的凝胶来评价黏度模量G’和G”；在具有8分钟内从0至5秒-1的恒定加速度的速度斜坡的旋转控制下在20±0.5℃进行测量；按1.0秒-1进行内推。结果显示在图表1(灭菌前和灭菌后的流变学评价)中：甚至在灭菌后，各制剂也明显地保持其流变学特性实际上未变。不含助流剂的制剂1具有略优的G’和G”模量，但未达到统计上显著的程度。这意味着，助流剂对流变学无影响，因此是否使用它取决于操作条件。但是，必须强调，所选择的聚合物在初步测试中保持所鉴定的黏附和黏度的特征，这是对包含在制剂中的酶的最佳释放是必要的。

溶胶原活性的评价

这些测试测试含和不含透明质酸的制剂与在亲脂性载体中含胶原酶 (软膏剂)的市售参考产品(Bionect

)和透明质酸相比的行为。

由于助流剂对胶原酶的酶活性无影响，决定测试制剂1(含HA)和4(不含HA)。用对标准市售底物(胶原酶生色底物试剂盒-Fluka 27669)的定量测定来测定酶的降解活性。适宜地修改该方法，以允许测试所检查的样品的粉状制剂，并模拟体内应用后该制剂将要经受的条件。该测定基于特异性胶原酶底物的水解：4-苯基偶氮苄基氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH (成分A)。该底物在胶原酶的存在下降解为Pz-Pro-Leu-OH(橘黄色片段) 和H-Gly-Pro-D-Arg-OH。肽Pz-Pro-Leu-OH在有机溶剂中可溶，用乙酸乙酯从用柠檬酸酸化的混合物萃取。过量未降解的底物保留在酸化的水相中。在320nm读数通过分光光度法定量测定乙酸乙酯中的 Pz-Pro-Leu-OH。

材料和方法

胶原酶生色底物试剂盒-Fluka 27669

制剂1

制剂4

Bionect

盐溶液

TRIS缓冲液

25mM柠檬酸

乙酸乙酯

无水Na₂SO_4.

每种制剂进行3次测试。

步骤1.将1.1ml浓度为2.6mM的底物溶液放入1.5ml Corning Costar SpinX管(Sigma,图9A)，如Fluka商业测定法中所报道。将100mg 用4倍于其重量的盐溶液水化的各粉状胶原酶制剂(制剂1和4)插入具有 0.22μm孔隙度的膜的容器(图9B)中。用适宜的盖子密封容器，以防止粉末由于在实验期间进一步吸收液体而膨胀。将容器放入具有底物溶液的管中(图9C)。密封管并颠倒，以允许底物溶液和容器膜之间的接触。胶原酶和底物可以自由跨过膜，而粉末截留在容器中。在32℃孵育整个制备物。按流程中所指定替换容器，以模拟每天应用、每两天应用和单次应用。

对于软膏剂Bionect

按下文所述修改步骤1：

将0.6ml浓度为1.3mM的底物溶液放入1.5ml Eppendorf管(图10：用于修改的步骤1的Eppendorf管)，如Fluka商业测定法中所报道。将约 250mg Bionect

装入Eppendorf管的盖子，使其与底物溶液接触，并在32℃孵育。按流程中所指定替换盖子，以模拟每天应用、每两天应用和单次应用。

步骤2：在到达预设的接触期时，在每个固定的时间点取125μl按步骤1中所述处理的底物混合物，并放入1.5ml Eppendorf管。向此溶液中加入250μl柠檬酸(25mM)和1.25ml乙酸乙酯。搅拌溶液15秒并离心。将含有水解的底物的乙酸乙酯转移至含有无水Na₂SO₄的Eppendorf管。振荡并离心Eppendorf管后，将有机相转移至新的Eppendorf管。在320nm 通过分光光度法测定包含在有机相中的水解底物。

数据分析报道在图表2、3和4中。

显而易见，在所测试的每种应用频率下，对于所考虑的每个时间点，粉状制剂都表现得远比参考产品好。

具体而言，与参考产品相比，制剂1和4的值总是高度显著，证明它们更好的功效，这意味着对患者更少的应用。在任何情况下，粉状制剂都明显表现得远好于在亲脂性载体中包含胶原酶的那些。这不仅意味着存在于粉状制剂中的胶原酶在羟乙酸玉米淀粉吸收溢泌物时产生的水性环境中发挥作用，证明之前所提出的在水溶液中的稳定性，还意味着它令人惊奇地运行得比预期好。

关于可注射制剂，如之前所述，它们实质上利用通过上述方法获得的酶的纯度及其在环境温度和-20℃至-80℃之间的温度下惊人的稳定性。可注射组合物优选由优选在使用时复溶在水溶液中的冻干形式的胶原酶组成，且每个单位剂量包含：

按照所述方法获得的胶原酶，以等同于120和450nkat之间的活性的量；

无菌盐溶液(NaCl 0.9％)；

可选地，重量平均分子量在750和1200kDa之间的HA，以1和30 mg/ml盐溶液之间，优选8和20mg/ml之间、甚至更优选10和15mg/ml 之间的浓度。

现将以实例而不是限制的方式描述胶原酶的可注射溶液的制备的一些实例。

实施例8：在无菌盐溶液(0.9％NaCl)中制备胶原酶的可注射溶液

胶原酶等同于196nkat

无菌盐溶液 1ml

用刻度注射器吸取0.35ml无菌盐溶液来复溶包含在适宜的无菌安瓿中的亲液形式的酶。轻轻搅拌后，获得稳定溶液。

实施例9：在无菌盐溶液(0.9％NaCl)中制备胶原酶的可注射溶液

胶原酶等同于392nkat

无菌盐溶液 1ml

用刻度注射器吸取0.7ml无菌盐溶液来复溶包含在适宜的无菌安瓿中的亲液形式的酶。轻轻搅拌后，获得稳定溶液。

实施例10：配制在750kDa MW HA中的胶原酶的可注射溶液的制备

胶原酶等同于196nkat

HA溶液 1ml

通过将包含在适宜的无菌安瓿中的10mg预先微粉化的HA溶解在1 ml无菌盐溶液中来预先建立HA溶液。用刻度注射器量取的0.35ml HA 溶液复溶亲液形式的酶。轻轻搅拌直至胶原酶粉末溶解后，获得稳定溶液。

实施例11：配制在1200kDa MW HA中的胶原酶的可注射溶液的制备

胶原酶等同于392nkat

HA溶液 1ml

通过将包含在适宜的无菌安瓿中的15mg预先微粉化的HA溶解在1 ml无菌盐溶液中来预先建立HA溶液。用刻度注射器量取的0.7ml HA溶液复溶亲液形式的酶。轻轻搅拌直至胶原酶粉末溶解后，获得稳定溶液。

这样获得的溶液可以保存在4℃，但优选在制备后立即或在8小时内注射它们。除上文所述的通常的治疗性用途外，本发明的胶原酶还可以用来解离组织和分离细胞团或单细胞，用于治疗和实验研究目的。此应用用于例如胰岛细胞移植法，以从周围胰腺组织分离胰岛细胞。胶原酶还可以成功用于分离心肌细胞、肝细胞和肿瘤细胞用于发展对应的疫苗的目的，且通常用于组织工程领域所有可用的细胞(骨、软骨、甲状腺等)。

序列表

<110> 菲迪亚制药股份公司（Fidia Farmaceutici S.p.A）

<120> 用于产生和纯化来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的胶原酶的新方法

<130> 1484PCT

<150> PD2012A000118

<151> 2012-04-18

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 739

<212> PRT

<213> 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

<220>

<221> mat_肽

<222> (1)..(739)

<223> 来自溶藻弧菌的胶原酶的活性中心

<400> 1

Thr Ala Cys Asp Leu Glu Ala Leu Val Thr Glu Ser Ser Asn Gln Leu

1 5 10 15

Ile Ser Glu Ile Leu Ser Gln Gly Ala Thr Cys Val Asn Gln Leu Phe

20 25 30

Ser Ala Glu Ser Arg Ile Gln Glu Ser Val Phe Ser Ser Asp His Met

35 40 45

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50 55 60

Gly Gly Ser Asp Glu Leu Glu Thr Leu Phe Leu Tyr Leu Arg Ala Gly

65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Glu Phe Tyr Asn Asp Asn Ile Ser Phe Ile Glu Trp Val

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Thr Pro Ala Val Lys Glu Ser Val Asp Ala Phe Val Asn Thr Ala Ser

100 105 110

Phe Tyr Glu Asn Ser Asp Arg His Gly Lys Val Leu Ser Glu Val Ile

115 120 125

Ile Thr Met Asp Ser Ala Gly Leu Gln His Ala Tyr Leu Pro Gln Val

130 135 140

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145 150 155 160

Met Arg Asn Ala Val Asn Gly Val Phe Thr Ile Leu Phe Gly Gly Gln

165 170 175

Trp Asn Glu Gln Phe Val Gln Ile Ile Gly Asn Gln Thr Asp Leu Ala

180 185 190

Lys Ala Leu Gly Asp Phe Ala Leu Arg Ala Ser Ser Ile Gly Ala Glu

195 200 205

Asp Glu Phe Met Ala Ala Asn Ala Gly Arg Glu Leu Gly Arg Leu Thr

210 215 220

Lys Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ser Val Val Lys Ser Gln Leu Ser Arg

225 230 235 240

Ile Phe Glu Gln Tyr Glu Met Tyr Gly Arg Gly Asp Ala Val Trp Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Tyr Thr Cys Ser Pro Thr Ile Arg Ile Leu Ser Gln Asn Met Thr Gln

290 295 300

Glu Gln His Ala Ala Ala Cys Ser Lys Met Gly Tyr Glu Glu Gly Tyr

305 310 315 320

Phe His Gln Ser Leu Glu Thr Gly Glu Gln Pro Val Lys Asp Asp His

325 330 335

Asn Thr Gln Leu Gln Val Asn Ile Phe Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Gly

340 345 350

Lys Tyr Ala Gly Pro Ile Phe Asp Ile Ser Thr Asp Asn Gly Gly Met

355 360 365

Tyr Leu Glu Gly Asp Pro Ser Gln Pro Gly Asn Ile Pro Asn Phe Ile

370 375 380

Ala Tyr Glu Ala Ser Tyr Ala Asn Ala Asp His Phe Val Trp Asn Leu

385 390 395 400

Glu His Glu Tyr Val His Tyr Leu Asp Gly Arg Phe Asp Leu Tyr Gly

405 410 415

Gly Phe Ser His Pro Thr Glu Lys Ile Val Trp Trp Ser Glu Gly Ile

420 425 430

Ala Glu Tyr Val Ala Gln Glu Asn Asp Asn Gln Ala Ala Leu Glu Thr

435 440 445

Ile Leu Asp Gly Ser Thr Tyr Thr Leu Ser Glu Ile Phe Glu Thr Thr

450 455 460

Tyr Asp Gly Phe Asp Val Asp Arg Ile Tyr Arg Trp Gly Tyr Leu Ala

465 470 475 480

Val Arg Phe Met Phe Glu Asn His Lys Asp Asp Val Asn Gln Met Leu

485 490 495

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500 505 510

Gln Trp Ala Asn Leu Tyr Gln Ser Glu Phe Glu Gln Trp Gln Gln Thr

515 520 525

Leu Val Ser Asn Gly Ala Pro Asn Ala Val Ile Thr Ala Asn Ser Lys

530 535 540

Gly Lys Val Gly Glu Ser Ile Thr Phe Ser Ser Glu Asn Ser Thr Asp

545 550 555 560

Pro Asn Gly Lys Ile Val Ser Val Leu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ser

565 570 575

Thr Ser Thr Gln Thr Lys Pro Thr His Gln Tyr Gly Ser Glu Gly Glu

580 585 590

Tyr Ser Val Ser Leu Ser Val Thr Asp Ser Glu Gly Leu Thr Ala Thr

595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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Gly Asp Phe Glu Asn Ala Ala Ile Val Val Asp Phe Asp Ala Gln Lys

725 730 735

Cys Arg Gln

<210> 2

<211> 814

<212> PRT

<213> 溶藻弧菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(814)

<223> 来自溶藻弧菌的微生物胶原酶EC 3.4.24.3

<400> 2

Met Glu Leu Lys Ile Leu Ser Val Ala Ile Ala Thr Thr Leu Thr Ser

1 5 10 15

Thr Gly Val Phe Ala Leu Ser Glu Pro Val Ser Gln Val Thr Glu Gln

20 25 30

His Ala His Ser Ala His Thr His Gly Val Glu Phe Asn Arg Val Glu

35 40 45

Tyr Gln Pro Thr Ala Thr Leu Pro Ile Gln Pro Ser Lys Ala Thr Arg

50 55 60

Val Gln Ser Leu Glu Ser Leu Asp Glu Ser Ser Thr Ala Cys Asp Leu

65 70 75 80

Glu Ala Leu Val Thr Glu Ser Ser Asn Gln Leu Ile Ser Glu Ile Leu

85 90 95

Ser Gln Gly Ala Thr Cys Val Asn Gln Leu Phe Ser Ala Glu Ser Arg

100 105 110

Ile Gln Glu Ser Val Phe Ser Ser Asp His Met Tyr Asn Ile Ala Lys

115 120 125

His Thr Thr Thr Leu Ala Lys Gly Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Asp Glu

130 135 140

Leu Glu Thr Leu Phe Leu Tyr Leu Arg Ala Gly Tyr Tyr Ala Glu Phe

145 150 155 160

Tyr Asn Asp Asn Ile Ser Phe Ile Glu Trp Val Thr Pro Ala Val Lys

165 170 175

Glu Ser Val Asp Ala Phe Val Asn Thr Ala Ser Phe Tyr Glu Asn Ser

180 185 190

Asp Arg His Gly Lys Val Leu Ser Glu Val Ile Ile Thr Met Asp Ser

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Asn Gly Val Phe Thr Ile Leu Phe Gly Gly Gln Trp Asn Glu Gln Phe

245 250 255

Val Gln Ile Ile Gly Asn Gln Thr Asp Leu Ala Lys Ala Leu Gly Asp

260 265 270

Phe Ala Leu Arg Ala Ser Ser Ile Gly Ala Glu Asp Glu Phe Met Ala

275 280 285

Ala Asn Ala Gly Arg Glu Leu Gly Arg Leu Thr Lys Tyr Thr Gly Asn

290 295 300

Ala Ser Ser Val Val Lys Ser Gln Leu Ser Arg Ile Phe Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Glu Met Tyr Gly Arg Gly Asp Ala Val Trp Leu Ala Ala Ala Asp Thr

325 330 335

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370 375 380

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385 390 395 400

Glu Thr Gly Glu Gln Pro Val Lys Asp Asp His Asn Thr Gln Leu Gln

405 410 415

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His Tyr Leu Asp Gly Arg Phe Asp Leu Tyr Gly Gly Phe Ser His Pro

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500 505 510

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545 550 555 560

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Tyr Gln Ser Glu Phe Glu Gln Trp Gln Gln Thr Leu Val Ser Asn Gly

595 600 605

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Ser Val Thr Asp Ser Glu Gly Leu Thr Ala Thr Ala Thr His Thr Val

675 680 685

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805 810

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 溶藻弧菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(15)

<223> 成熟链的N端

<400> 3

Thr Ala Cys Asp Leu Glu Ala Leu Val Thr Glu Ser Ser Asn Gln

1 5 10 15

Claims

1.来自溶藻弧菌解毒化学变型的纯化的具有SEQ ID NO:1序列的胶原酶，特征在于：

分子量为82Kda；

比活在1000和1800nkat/mg之间；

纯度在98.0和100％之间；

无微生物或蛋白质污染物；

在5.5和11之间的pH下稳定；

在4℃和40℃之间的温度下在水溶液中稳定；

在4℃下在水溶液中稳定30天；

在-20℃和-80℃之间的温度下在水溶液中稳定24-48个月；

获得稳定的亲液粉末的亲液性(lyophilisability)。

2.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶在pH 7.1下在包含25mM TRIS-HCl和10mM CaCl₂的水溶液中稳定。

3.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶在37℃稳定。

4.权利要求1的纯化的胶原酶，其中所述胶原酶处于具有7-20nkat/mg粉末范围内的酶活性的稳定亲液粉末的形式，其包含：

麦芽糖：95-96％，优选95.75％；

盐：1.0-1.5％，优选1.3％；

胶原酶：2.5-3.5％，优选2.95％。

5.权利要求1-4中任一项的纯化的胶原酶，其用于治疗不同程度的烧伤、褥疮、烫伤、多种来源的皮肤溃疡、血管性和糖尿病性溃疡、蜂窝织炎、手术后粘连、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩。

6.权利要求1-4中任一项的纯化的胶原酶，其用于治疗粘连性囊炎、掌挛缩病和纤维性海绵体炎。

7.用于局部用途的药物组合物，其处于扑粉的形式，其包含：

权利要求1-4中任一项的纯化的胶原酶，其量等同于成品的2和8nkat/g之间的活性范围的量，优选量等同于成品的5nkat/g活性的量；

羟乙酸玉米淀粉，其量为达到百分比组成所需的量；

重量平均分子量在130和230kDa之间，优选145和210kDa之间、甚至更优选160和200kDa之间的透明质酸，其量在0.1和5％之间，优选量在0.2和2％之间；

可选地，胶态二氧化硅，其量在0.1和3％之间，优选量在0.2和1％之间。

8.可注射药物组合物，其每个单位剂量包含：

冻干形式的权利要求1-4中任一项的纯化的胶原酶，其量为等同于120和450nkat之间的活性的量；

无菌盐溶液；

重量平均分子量在750和1200kDa之间的透明质酸，其浓度为1和30mg/ml盐溶液之间，优选浓度为8和20mg/ml之间、甚至更优选浓度为10和15mg/ml之间。

9.权利要求7的药物组合物，其用于不同程度的烧伤、烫伤、褥疮、血管性和糖尿病性溃疡、蜂窝织炎、手术后粘连、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩的外部和/或局部治疗。

10.权利要求8的药物组合物，其用于治疗粘连性囊炎、掌挛缩病和纤维性海绵体炎。