JP2023540610A - オレンジ由来の細胞外小胞を含むヒドロゲル形態の医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、直径が10~500nmの範囲であり、そして血管新生促進活性を示す、オレンジ由来の細胞外小胞(EV)を含む、組織修復および/または再生治療法における使用のための、ヒドロゲル形態の医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物において、オレンジ由来のEVは、ヒドロゲルマトリックス中に分散しており、該マトリックスから放出可能である。本発明はまた、該医薬組成物の製造方法に関する。
Description
本発明は、オレンジ由来の細胞外小胞(EV)を含むヒドロゲルの形態の医薬組成物、および再生療法におけるその使用に関する。
細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の生細胞によって放出される小さな粒子の混合集団である。細胞外小胞(EV)には、原形質膜の出芽によって放出される微小胞と、エンドソーム区画に由来するエクソソームが含まれる。細胞外小胞は、「粒子」、「マイクロ粒子」、「ナノ小胞」、「微小胞」および「エクソソーム」と称される(Yanez-Mo M, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015 May 14; 4:27066 doi: 10.3402/jev.v4.27066; Lotvall J, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 2014 Dec 22;3:26913. doi: 10.3402/jev.v3.26913.; Harrison P, et al. Extracellular Vesicles in Health and Disease. CRC Press, pages 1-5, 2014)。
EVは、細胞質タンパク質、表面受容体、脂質相互作用タンパク質、DNAおよびRNA分子を含むリン脂質二重層によって形成される。カーゴは複雑で、起源となる細胞によって異なる。EVは、カーゴを受容細胞に移送でき、このようにして、EVは、シグナル伝達カスケードおよび細胞応答を活性化する細胞間コミュニケーションを媒介する。
細胞外小胞は、ほぼすべての哺乳類の細胞型および体液から単離されており、細菌および植物を含む下等生物からも単離されている。近年、多くの治療アプローチは、皮膚再生用途を含む細胞外小胞の使用に焦点を当てている。
CN2016/10983610Aは、表皮損傷を処置するためのスプレーボトルにおける間葉系幹細胞由来の細胞外小胞のサイトカインと組み合わせた使用を開示している。
CN109865033Aは、間葉系幹細胞エクソソームおよび軟膏組成物を含む、糖尿病性足創傷を修復するための外用軟膏の使用を開示している。
最近の発見は、食用植物由来のEVも皮膚に有益な治療効果を示すことを示している。
WO2017/052267は、しわの形成、保湿、美白、上皮細胞の増殖およびコラーゲン沈着に関して、皮膚の改善を促進するために、局所投与される食用の天然植物由来のEVの使用を開示している。
WO2019/027387A2は、ケラチノサイトの移動を誘導できるので、創傷治癒を促進するための、ウィートグラス(wheatpass)、ニンニクおよびショウガ由来の細胞外小胞の使用を開示している。
PCT/EP2020/056632は、オレンジ由来のEVを含む植物由来のEVならびに潰瘍、皮膚炎、角膜損傷、眼疾患、粘膜病変および感染性病変の処置のためのその治療的使用を開示している。
創傷および病変に利用可能な現在の処置の中で、最も一般的な薬の1つはヒドロゲルに代表されるものである。ヒドロゲルは、初めに1950年代に開発されたもので、創傷表面からの体液交換を調節する様々な水和ポリマードレッシングで構成されている。それらは、組織修復に好都合な創傷床における体液のレベルを調節し、湿った環境を維持するため、皮膚の創傷および病変の処置として使用される。
上記の特性にもかかわらず、ヒドロゲルは、細胞増殖、細胞移動または血管新生などの治癒プロセスを直接促進できないため、治療薬としての効果は低い(Tavakoli S, Klar AS. Advanced Hydrogels as Wound Dressings. Biomolecules. 2020;10(8):E1169. Published 2020 Aug 11. doi:10.3390/biom10081169. Broussard KC, Powers JG. Wound dressings: selecting the most appropriate type. Am J Clin Dermatol. 2013;14(6):449-459. doi:10.1007/s40257-013-0046-4)。
先行技術の限界および欠点を克服するために、本発明は、添付の独立請求項に定義されるように、オレンジ由来の細胞外小胞(EV)を含むヒドロゲルの形態の医薬組成物、および該医薬組成物の製造方法を提供する。従属請求項は、特許請求する組成物および方法のさらなる有利な特徴を特定する。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書の不可欠な部分を形成する。
本発明者らは、オレンジ植物またはオレンジ果実に由来する細胞外小胞が、皮膚閉鎖、特に血管新生の有益なプロセスを促進することを発見した。さらに、本発明者らによって実施された実験的研究は、驚くべきことに、ヒドロゲルと組み合わせたオレンジ由来のEVが、EVまたはヒドロゲル単独と比較して、虚血または血管新生障害によって特徴付けられる皮膚病変の再生を促進するのに有意により効果的であることを明らかにした。
本発明者らの知る限り、先行技術は、血管新生促進効果を有するオレンジ植物またはオレンジ果実に由来する細胞外小胞を開示しておらず、虚血または血管新生障害を特徴とする創傷および皮膚病変に局所投与した場合のこれらのEVとヒドロゲルとの複合体の治療効果も開示していない。
したがって、本発明の態様は、
(i)オレンジ由来の細胞外小胞(EV);
(ii)ポリマーゲル化剤;
(iii)組成物の総重量の少なくとも10重量%の量の水;および
(iv)所望により、医薬的に許容されるビヒクル、添加剤および/または希釈剤
を含む、ヒドロゲルの形態の医薬組成物であって、
オレンジ由来の細胞外小胞(EV)が、脂質二重膜によって囲まれており、光散乱に基づくナノ粒子トラッキング解析(NTA)によって測定される直径が、10~500nmの範囲であること、および血管新生促進活性を示すことを特徴とし、
ポリマーゲル化剤と水が、オレンジ由来のEVが分散しているヒドロゲルマトリックスを形成し、該EVが、ヒドロゲルマトリックスから放出可能であり、
組成物が、組織修復および/または再生治療法における使用のためのものである、組成物である。
(i)オレンジ由来の細胞外小胞(EV);
(ii)ポリマーゲル化剤;
(iii)組成物の総重量の少なくとも10重量%の量の水;および
(iv)所望により、医薬的に許容されるビヒクル、添加剤および/または希釈剤
を含む、ヒドロゲルの形態の医薬組成物であって、
オレンジ由来の細胞外小胞(EV)が、脂質二重膜によって囲まれており、光散乱に基づくナノ粒子トラッキング解析(NTA)によって測定される直径が、10~500nmの範囲であること、および血管新生促進活性を示すことを特徴とし、
ポリマーゲル化剤と水が、オレンジ由来のEVが分散しているヒドロゲルマトリックスを形成し、該EVが、ヒドロゲルマトリックスから放出可能であり、
組成物が、組織修復および/または再生治療法における使用のためのものである、組成物である。
本明細書で用いる用語「オレンジ由来の細胞外小胞」は、シトラス・シネンシス(Citrus sinensis)の果実として意図されるオレンジ果実に由来するナノ粒子、およびシトラス・シネンシス種の1つ以上の植物からの細胞に由来するナノ粒子を指す。シトラス・シネンシスなる用語は、当技術分野で知られているように、シトラス・シネンシスのあらゆる変種を包含することが理解される。そのような変種の非限定的な例は、バレンシア、ネーブル、レッドオレンジ、ブラッドオレンジ、タロッコ、スイートオレンジ、モロ、サングイネッロおよびニューホールである。
オレンジ由来のEVは、リン脂質二重層によって区切られているかまたは封入されており、脂質、タンパク質、核酸、および由来する細胞に由来する他の分子を運ぶ。従来、細胞外小胞は、10~1000nmの範囲の直径を有する。
本発明は、10~500nmの範囲、好ましくは20~400nmの範囲、さらにより好ましくは25~350nmの範囲の直径を有するオレンジ由来の細胞外小胞(EV)を利用する。
当業者は、EVの直径を決定するために利用可能な標準的な方法をよく知っている。
そのような方法の中で、ナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、ブラウン運動の分析に基づいて、10~1000nmの範囲で懸濁液中のナノ粒子を可視化および測定するために一般的に使用される。この方法により、動的光散乱(DLS)を用いた溶液中の細胞外小胞の特性評価が可能になる。各小胞は、拡散を直接観察することにより、個別に、しかし同時に分析される。分析により、粒子濃度およびサイズ分布を決定できる。サイズは、粒子の並進拡散直径、いわゆる流体力学的直径の検出を可能にするブラウン運動に関連している。粒子運動の速度は、液体の粘度ならびに粒子の温度およびサイズに関連しており、粒子の密度または屈折率には影響されない。粒子運動の速度は、ストークス-アインシュタインの関係式によって計算される球相当の流体力学的半径に関連している。実際、懸濁液中の粒子または分子のブラウン運動は、レーザー光を様々な強度で散乱させる。これらの強度変動の分析により、ブラウン運動の速度が得られ、したがって、ストークス-アインシュタインの関係式を使用して粒子径が得られる。
当技術分野でよく知られているように、透過型電子顕微鏡(TEM)もまた、EVの形態を特性評価するための標準的なツールと考えられる。TEMは、EVの直接的な可視化および特性評価を可能にする高解像度の顕微鏡法である。EVを可視化できる最も使用されている手法の1つであるTEMは、EVの構造、形態、膜の完全性およびサイズを調べることができる。
本発明の好ましい一実施態様において、医薬組成物中のオレンジ由来のEVの量は、組成物の総容量に対して1010~1012EV/mlの範囲であり、より好ましくは、オレンジ由来のEVの量は1011EV/mlである。
本発明の好ましい別の実施態様において、医薬組成物中のオレンジ由来のEVタンパク質の量は、組成物の総容量に対して5μg~500μg/mlの範囲であり、より好ましくは組成物の総容量に対して40μg~60μg/mlの範囲である。
本発明の一実施態様において、EV集団のタンパク質含有量は、1~103ng/109EVの範囲である。
別の実施態様において、EVのRNA含有量は、10~60ng/1010EVの範囲である。
「タンパク質含有量」および「RNA含有量」なる表現は、本発明で用いられるEVの内部および膜含有量の両方を包含する。
本発明で用いられるEV中の脂質の例は、24-プロピリデンコレステロール、ベータシトステロール、カンペステロール、ジパルミチン、エイコサノールおよび/またはステアリン酸グリシドールを含むが、これらに限定されない。
本発明の範囲は、シトラス・シネンシスの単一変種の果実および/または植物に由来するEVを含む医薬組成物、ならびにシトラス・シネンシスの複数変種の果実および/または植物に由来するEVを含む医薬組成物を含む。
本発明で用いられるEVは、血管新生促進活性を示すことを特徴とする。
本明細書において、「血管新生促進効果」なる表現は、内皮細胞の移動、増殖または内皮細胞による血管形成の促進、およびインビトロまたはインビボでの血管新生促進メディエーターの放出の増加として意図される。血管新生は基本的な生物学的プロセスであり、その障害は、虚血性潰瘍(例えば褥瘡、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、虚血性潰瘍、滲出性潰瘍、代謝異常性潰瘍、外傷性潰瘍)、および粘膜病変(例えば糖尿病性病変)を含む、いくつかの種類の病変の病因に関与している。さらに、血管新生は、細胞に栄養素を提供し、組織再生を可能にするのに不可欠である。血管新生は、火傷、瘻孔、乾癬、角化症、角膜炎、裂傷、外傷性潰瘍、粘膜病変(例えばプロテアーゼによる外傷性病変、および口腔、褥瘡性、性器粘膜病変)、皮膚炎(にきび、湿疹、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、異汗性湿疹、神経皮膚炎、疱疹状皮膚炎を含む)、前がん病変の処置を目的としたアポトーシス促進薬によって誘発される細胞損傷(例えば光線性角化症)を含む、様々な病変の再生を促進する。したがって、本発明で用いられるオレンジ由来のEVは、上記疾患の処置に特に有用である。
好ましくは、本発明によるオレンジ由来のEVは、オレンジ絞り汁またはオレンジ植物細胞の培養培地から精製される。オレンジ植物細胞は、葉、果肉、シュートまたは新芽に由来してもよい。
適切な精製技術は、超遠心分離およびタンジェンシャルフローろ過を含むが、これらに限定されない。オレンジ由来のEVの精製のために用いられる最も適切な方法の選択は、当業者の知識および技術の範囲内である。
本発明の一実施態様において、医薬組成物中のオレンジ由来のEVは、新たに調製される。別の実施態様において、医薬組成物中のオレンジ由来のEVは、ヒドロゲルと組み合わせる前に、4℃、-20℃または-80℃で保存される。さらに別の実施態様において、オレンジ由来のEVは、ヒドロゲルと混合する前に凍結乾燥される。
本発明によれば、医薬組成物は、ヒドロゲルの形態である。ヒドロゲルは、ポリマーゲル化剤の1つ以上のモノマーの単純な反応によって生成される、水で膨潤した架橋ポリマーネットワークである。典型的には、ヒドロゲルマトリックスは、水と、1種類のポリマーまたは様々なポリマーの組合せで構成される。
本発明による医薬組成物中の水の量は、組成物の総重量の少なくとも10重量%である。
本発明の医薬組成物における使用に適したポリマーゲル化剤の例示的な非限定的な例としては、セルロースおよびセルロースベースのポリマー、例えばカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、コラーゲン、加水分解コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸(HA)、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)、グリセリン、プロピレングリコールおよびアルギン酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の範囲内には、水と、単一のポリマーまたは様々なポリマーの組合せのいずれかから構成されるヒドロゲルが含まれる。ポリマー分子は、天然の形態でまたは化学修飾して使用できることが理解される。このような成分は、個別にまたは組み合わせて使用できる。
ヒドロゲルは、例えばシート、非晶質ゲル(乾燥または事前混合)および含浸ガーゼを含むいくつかの異なる物理的状態で利用できるという利点を有する。それらの高い含水量は、軟部組織における高度に水和された生理学的細胞外マトリックス環境を模倣するため、いくつかの生物医学的用途に魅力的である。実際、ヒドロゲルは、水分を補給して湿った環境を維持する能力があるため、乾燥した創傷の処置に特に有用である。さらに、これらのシステムは、創傷を閉じたままにし、自己消化による壊死組織の除去を促進し、創傷のデブリードマンを促進する。また、創傷を冷やす効果も有し、知覚される痛みを軽減できる。
本発明による医薬組成物において、オレンジ由来のEVは、ヒドロゲルマトリックス中に分散および封入されており、そして、制御された方法で、すなわち徐々にかつ長時間にわたって該マトリックスから損傷組織へ放出可能である。
さらに、EV製剤のヒドロゲル封入により、これらの小胞を安定化させ、分解から保護し、これにより小胞の治療効果を高めることができる。
また、本発明の医薬組成物は、従来の方法に従って、適切な添加剤、防腐剤、溶媒または希釈剤を含有し得る。
例示的な添加剤は、パンテノール、グリコール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコールを含む)、ガム(グアーガムを含む)、糖(ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトールを含む)、ホウ酸およびホウ酸塩(四ホウ酸ナトリウムを含む)、グリセロール、グリセリン、アラントイン、プロタミン、ソルビトールカルボマーまたはカルボマーナトリウム、トリエタノールアミン、尿素(イミダゾリジニル尿素を含む)、アルギン酸、EDTA、安息香酸ナトリウム、リン酸カルシウムおよびケイ酸カルシウム、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、ステアリン酸マグネシウム、ツイーン、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、植物抽出物(アロエベラ液汁を含む)を含むが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤は、パラベン(エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベンを含む)、ホルムアルデヒド供与体(DMDMヒダントインを含む)、イミダゾリジニル尿素、およびグルタルアルデヒド、フェノール誘導体、安息香酸、ベンジルアルコールを含むが、これらに限定されない。
適切な溶媒または希釈剤は、精製水、エタノールおよびベンジルアルコールを含むが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物はまた、界面活性剤、湿潤剤、抗酸化剤、粘度安定剤、キレート剤、緩衝剤、低級アルコール、香料、pH調節剤などを含み得る。これらの分子は、天然の形態でまたは化学修飾して使用できる。このような成分は、個別にまたは組み合わせて使用できる。
本発明によれば、医薬組成物は、病変の閉鎖を促進する際の医薬組成物の有効性を改善するために、抗生物質、抗菌剤および抗真菌剤より選択される1つ以上の抗微生物剤をさらに含み得る。適切な抗生物質、抗真菌剤および抗菌剤は、イオン化銀(Ag+)(酸化銀、硝酸銀、硫酸銀、銀塩、銀ゼオライト、銀スルファジアジン(SSD)、および銀ナノ粒子(AgNP)を含む)、ポビドンヨード、カデキサマーヨウ素、グルコン酸クロルヘキシジン、キノロンおよびフルオロキノロン(シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシンを含む)、ペニシリン(アモキシシリンを含む)、ジクロキサシリン、セファロスポリン(セファレキシンを含む)、リンコサミド(クリンダマイシンを含む)、テトラサイクリン(ドキシサイクリンを含む)、EDTA、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、ストレプトマイシン、クリンダマイシン、ニトロフラゾンおよびゲンタマイシンを含むが、これらに限定されない。これらの分子は、天然の形態でまたは化学修飾して使用できる。このような成分は、個別にまたは組み合わせて使用できる。
創傷の閉鎖を促進する効力を改善するために、本発明の医薬組成物は、抗炎症剤をさらに含み得る。適切な抗炎症剤は、ステロイド抗炎症剤、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾンおよびプレドニゾン、ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えばイブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、サリチル酸、インドメタシンを含むが、これらに限定されない。このような成分は、個別にまたは組み合わせて使用できる。
また、医薬組成物は、その治療効果を改善するために、増殖因子および再生促進剤を含み得る。適切な増殖因子および再生促進剤は、上皮細胞増殖因子(EGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、および線維芽細胞増殖因子(FGF)を含むが、これらに限定されない。
好ましくは、本発明による医薬組成物は、創傷のpHを下げ、アルカローシスを予防し、感染を予防し、創傷閉鎖を促進するために、3.5~7.0の間、より好ましくは4.0~5.0の間に入る酸性pHを有する。
本発明の医薬組成物は、標的部位に応じていくつかの方法で投与可能である。皮膚および外部粘膜の修復のために、医薬組成物を局所または局所注射により投与し得る。局所投与のために、医薬組成物は、ゲル剤、軟膏剤(ointment)、クリーム剤または軟膏剤(salve)に製剤化され得る。好ましくは、医薬組成物は、漏れることなく創傷への付着を改善するために、柔らかい粘性テクスチャーを有する。
EVヒドロゲル送達を促進し、経時的なEVの放出を制御するために、医薬組成物をパッチ、手術用糸、ガーゼなどの医療デバイスと組み合わせ得る。
EVの投与量ならびに放出の速度および持続時間を、処置すべき状態、患者の特性、病変の大きさなどの様々な要因に応じて決定し、そして、当業者の通常の知識を用いることにより当業者は決定できる。
好ましくは、ヒドロゲルマトリックスからのオレンジ由来のEVの放出は、少なくとも1日間(24時間)にわたって、例えば少なくとも2日間(48時間)、少なくとも3日間(72時間)、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間または少なくとも8日間にわたって行われる。
医薬組成物を局所投与するとき、好ましくは、創傷の表面全体を覆うように分配されるべきであり、所望により、創傷を清潔に保つために二次ドレッシングで覆われるべきである。
医薬組成物は、単回単位用量としてまたは複数の単回単位用量として、好ましくはプラスチックまたはアルミニウム製のチューブに包装され得る。このようなチューブには、創傷床へのゲルの分配を可能にする小さなスパウトを設けることができる。医薬組成物は、細胞および/または組織の修復を向上させることを意図している。
下記の実施例で詳細に説明するように、本発明の医薬組成物は、オレンジ由来の血管新生促進EVとヒドロゲルの治療効果を組み合わせ、驚くべきことに、損傷した組織に対する相乗的再生効果の改善を達成する。さらに、本発明の医薬組成物は、EVの安定化および保存、ならびに病変部位へのEVの局所的で効率的かつ時間制御された放出を保証する。
これらの特徴により、本発明の医薬組成物は、皮膚および粘膜などの損傷組織、特に潰瘍、皮膚炎、角膜損傷、眼疾患、粘膜病変および感染性病変などの数種類の病変の処置に特に適したものとなる。本発明は、特に損傷組織が血管新生障害を示すか、または血管新生の促進が損傷組織の再生を加速するとき、損傷組織および細胞修復に対する再生効果を促進する治療的局所処置として、ヒドロゲルに組み合わせたオレンジ由来のEVの適用可能性を提供する。
一実施態様において、本発明の医薬組成物は、皮膚、粘膜または軟組織病変の閉鎖、例えば皮膚創傷の閉鎖のための再生治療法において用いられる。
損傷組織が血管新生障害を示す疾患および状態は、虚血性潰瘍(例えば褥瘡、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、虚血性潰瘍、滲出性潰瘍、代謝異常性潰瘍、外傷性潰瘍)、および粘膜病変(例えば糖尿病性病変)を含むが、これらに限定されない。
損傷組織における血管新生の促進が組織再生を促進する疾患および状態は、火傷、瘻孔、乾癬、角化症、角膜炎、裂傷、外傷性潰瘍、粘膜病変(例えばプロテアーゼによる外傷性病変、および口腔、褥瘡性、性器粘膜病変)、皮膚炎(にきび、湿疹、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、異汗性湿疹、神経皮膚炎、疱疹状皮膚炎を含む)、前がん病変の処置を目的としたアポトーシス促進薬によって誘発される細胞損傷(例えば光線性角化症)を含むが、これらに限定されない。
本発明の範囲内には、上記で定義した医薬組成物の製造方法もまた含まれる。本発明によれば、当該方法は、下記工程:
(i)ポリマーゲル化剤を所定量の水に溶解させて、ヒドロゲルマトリックスを得る工程であって、所定量の水が、医薬組成物の総重量の少なくとも10重量%を占める工程;
(ii)上記で定義したオレンジ由来の細胞外小胞(EV)を、工程(i)で得られたヒドロゲルマトリックスに加える工程;
(iii)該オレンジ由来のEVをヒドロゲルマトリックスと混合して、これにより、EVがヒドロゲルマトリックス中に分散したヒドロゲル形態の医薬組成物を得る工程
を含む。
(i)ポリマーゲル化剤を所定量の水に溶解させて、ヒドロゲルマトリックスを得る工程であって、所定量の水が、医薬組成物の総重量の少なくとも10重量%を占める工程;
(ii)上記で定義したオレンジ由来の細胞外小胞(EV)を、工程(i)で得られたヒドロゲルマトリックスに加える工程;
(iii)該オレンジ由来のEVをヒドロゲルマトリックスと混合して、これにより、EVがヒドロゲルマトリックス中に分散したヒドロゲル形態の医薬組成物を得る工程
を含む。
本発明による方法で使用するのに適したポリマーゲル化剤は、医薬組成物を参照して上記した通りである。
好ましくは、ポリマーゲル化剤は、水の総容量に対して1~100mg/ml、より好ましくは水の総容量に対して2~50mg/mlの範囲内に含まれる濃度で所定量の水に溶解される。
本発明の方法によれば、工程(ii)におけるオレンジ由来のEVとヒドロゲルマトリックスとの混合を、好ましくは少なくとも30秒間ボルテックスすることによって行い得る。
本発明の方法は、混合後、ヒドロゲルマトリックス中に分散したオレンジ由来のEVを含む組成物を37℃で5~10分間保持する工程(iv)をさらに含み得る。
本発明の方法の一実施態様において、工程(i)において、ポリマーゲル化剤を完全に溶解させるために、ポリマーゲル化剤を水中で37℃にて少なくとも30分間機械的に撹拌する。
別の実施態様において、ヒドロゲルおよびオレンジ由来のEVを、混合前に少なくとも10分間、37℃に保持する。
さらに別の実施態様において、工程(iii)の混合後、得られた組成物を37℃で少なくとも10分間保持する。
下記の実験セクションは、純粋に説明のために提供され、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。下記の実験セクションでは、添付の図面を参照する。
さらに、図7は、実験例4における、インビトロで内皮細胞の増殖を促進する能力を示す。内皮細胞を、オレンジ由来のEV単独またはヒドロゲル単独、またはEVとヒドロゲルの組合せで24、48および72時間刺激した。図の下部のグラフは、上記のとおり刺激を24時間行った際の内皮細胞の増殖を割合(平均±SEM)として示している。N=3の実験を各データセットに対して実施した。CTR-:非刺激の細胞。CTR+:線維芽細胞については10%ウシ胎児血清を添加した培地、または内皮細胞についてはウシ胎児血清および増殖因子(Endogro)を添加した培地。EV:109オレンジ由来のEV。H1:カルボキシメチルセルロースのヒドロゲル単独。H1+EV:カルボキシメチルセルロースのヒドロゲルと109オレンジ由来のEV。H2:コラーゲンのヒドロゲル単独。H2+EV:コラーゲンのヒドロゲルと109オレンジ由来のEV。統計的有意性を、各条件を他のすべての条件と比較して計算した。p:***<0.001対CTR-;#<0.05対H1;§<0.001対H2;α<0.05対EV。
材料および方法
細胞外小胞の単離
細胞外小胞を、オレンジ絞り汁から単離した。シトラス・シネンシス植物の果実を絞り、絞り汁を、孔の大きさを下げて連続的にろ過して、繊維を除去した。EVを、分画超遠心またはタンジェンシャルフローろ過で精製した。分画超遠心では、絞り汁を1,500gで30分間遠心分離して、破片および他の夾雑物を除去した。その後、EVを最初に10,000gでの超遠心分離、続いて4℃にて1時間の100,000gでの超遠心分離によって精製した(Beckman Coulter Optima L-90K、Fullerton、CA、USA)。最終ペレットを、1%DMSOを添加したリン酸緩衝生理食塩水で再懸濁し、0.22μmフィルターでろ過して滅菌した。
細胞外小胞を、オレンジ絞り汁から単離した。シトラス・シネンシス植物の果実を絞り、絞り汁を、孔の大きさを下げて連続的にろ過して、繊維を除去した。EVを、分画超遠心またはタンジェンシャルフローろ過で精製した。分画超遠心では、絞り汁を1,500gで30分間遠心分離して、破片および他の夾雑物を除去した。その後、EVを最初に10,000gでの超遠心分離、続いて4℃にて1時間の100,000gでの超遠心分離によって精製した(Beckman Coulter Optima L-90K、Fullerton、CA、USA)。最終ペレットを、1%DMSOを添加したリン酸緩衝生理食塩水で再懸濁し、0.22μmフィルターでろ過して滅菌した。
細胞外小胞を、-80℃で長期間使用または保存した。タンジェンシャルフローろ過では、最初に絞り汁をデプスフィルターシートディスクSupracap 50(Pall)でろ過して清澄化し、繊維および細片を除去した。その後、ろ過した絞り汁を、タンジェンシャルフローろ過カセットTFF Omega(Pall Cadence)を用いた濃縮およびダイアフィルトレーションによって精製した。最後に、タンジェンシャルフローろ過の残留物を0.2nmフィルターでろ過滅菌した。
ナノ粒子トラッキング解析(NTA)
ナノ粒子トラッキング解析(NTA)を用いて、405nmレーザーとNTA 3.1分析ソフトウェアを備えたNanoSight LM10システム(NanoSight Ltd.、Amesbury、UK)を使用して、直径でEVの大きさおよびプロファイルを定義した。レーザー光源にさらされた試料中に存在するEVのブラウン運動を、カメラで記録し、ストークス-アインシュタインの関係式によってNTAによるサイズおよび濃度のパラメーターに変換した。カメラレベルは、すべての取得について16であり、各サンプルについて、30秒間の5つの動画を記録した。簡単に説明すると、精製したEVを、1mlの小胞を含まない生理食塩水(Fresenius Kabi、Runcorn、UK)中で1:2000に希釈した。NTA取得後の設定を最適化し、すべての試料間で一定に維持し、その後、各動画を分析して、EV平均、モードおよび濃度を測定した。
ナノ粒子トラッキング解析(NTA)を用いて、405nmレーザーとNTA 3.1分析ソフトウェアを備えたNanoSight LM10システム(NanoSight Ltd.、Amesbury、UK)を使用して、直径でEVの大きさおよびプロファイルを定義した。レーザー光源にさらされた試料中に存在するEVのブラウン運動を、カメラで記録し、ストークス-アインシュタインの関係式によってNTAによるサイズおよび濃度のパラメーターに変換した。カメラレベルは、すべての取得について16であり、各サンプルについて、30秒間の5つの動画を記録した。簡単に説明すると、精製したEVを、1mlの小胞を含まない生理食塩水(Fresenius Kabi、Runcorn、UK)中で1:2000に希釈した。NTA取得後の設定を最適化し、すべての試料間で一定に維持し、その後、各動画を分析して、EV平均、モードおよび濃度を測定した。
透過型電子顕微鏡(TEM)
EVの透過型電子顕微鏡観察を、EVを200メッシュのニッケルフォームバーカーボンコーティンググリッド(Electron Microscopy Science、Hatfield、PA)に20分間ロードすることにより実施した。その後、EVを2.5%グルタルアルデヒドおよび2%スクロースを含む溶液で固定し、蒸留水で繰り返し洗浄した後、試料をNanoVan(Nanoprobes、Yaphank、NK、USA)でネガティブ染色し、Jeol JEM 1010電子顕微鏡で観察した。
EVの透過型電子顕微鏡観察を、EVを200メッシュのニッケルフォームバーカーボンコーティンググリッド(Electron Microscopy Science、Hatfield、PA)に20分間ロードすることにより実施した。その後、EVを2.5%グルタルアルデヒドおよび2%スクロースを含む溶液で固定し、蒸留水で繰り返し洗浄した後、試料をNanoVan(Nanoprobes、Yaphank、NK、USA)でネガティブ染色し、Jeol JEM 1010電子顕微鏡で観察した。
タンパク質の抽出および定量
タンパク質を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを添加したRIPAバッファー(150nM NaCl、20nM Tris-HCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1%デオキシコール酸、1%Triton X-100、pH7.8)(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)によってEVから抽出した。タンパク質含有量を、BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts、USA)により製造者のプロトコールに従って定量した。簡単に説明すると、10μlの試料を96ウェルプレートのウェルに分注し、ウシ血清アルブミン(BSA)で確立した線形標準曲線を用いて総タンパク質濃度を決定した。
タンパク質を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを添加したRIPAバッファー(150nM NaCl、20nM Tris-HCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1%デオキシコール酸、1%Triton X-100、pH7.8)(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)によってEVから抽出した。タンパク質含有量を、BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts、USA)により製造者のプロトコールに従って定量した。簡単に説明すると、10μlの試料を96ウェルプレートのウェルに分注し、ウシ血清アルブミン(BSA)で確立した線形標準曲線を用いて総タンパク質濃度を決定した。
RNAの抽出および定量
全RNAを、miRNeasyミニキット(Qiagen、Hilden、Germany)を製造者のプロトコールに従って用いて、EVおよび細胞から単離した。試料のRNA濃度を、分光光度計(mySPEC、VWR、Radnor、PA、USA)を用いて定量した。
全RNAを、miRNeasyミニキット(Qiagen、Hilden、Germany)を製造者のプロトコールに従って用いて、EVおよび細胞から単離した。試料のRNA濃度を、分光光度計(mySPEC、VWR、Radnor、PA、USA)を用いて定量した。
ヒドロゲルの製造
ヒドロゲルを、ヒドロゲルを水または生理食塩水中に再懸濁させることにより生成した。用いたヒドロゲルには、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、エチルセルロース、キトサン、ゼラチンおよびPEG(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)が含まれた。十分に混合した後、0.22μmフィルターでろ過することによりヒドロゲルを滅菌し、すぐに使用できるようにした。ヒドロゲルをオレンジ由来のEVと組み合わせるために、ヒドロゲルを様々な用量のEV(108、109、1010EV)と混合した。
ヒドロゲルを、ヒドロゲルを水または生理食塩水中に再懸濁させることにより生成した。用いたヒドロゲルには、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、エチルセルロース、キトサン、ゼラチンおよびPEG(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)が含まれた。十分に混合した後、0.22μmフィルターでろ過することによりヒドロゲルを滅菌し、すぐに使用できるようにした。ヒドロゲルをオレンジ由来のEVと組み合わせるために、ヒドロゲルを様々な用量のEV(108、109、1010EV)と混合した。
細胞培養
ヒト微小血管内皮細胞(HMEC)を、初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞のシミアンウイルス40での不死化により得た。HMECを、BulletKit(EBM、Lonza、Basel、Switzerland)および1ml Mycozap CL(Lonza)を添加したEndothelial Basal Medium中で培養した。正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、初代成体線維芽細胞(Lonza)である。NHDFを、BulletKitおよび1mlのMycozap PR(Lonza)を添加したFGM-2 Growth Media(Lonza)中で培養した。
ヒト微小血管内皮細胞(HMEC)を、初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞のシミアンウイルス40での不死化により得た。HMECを、BulletKit(EBM、Lonza、Basel、Switzerland)および1ml Mycozap CL(Lonza)を添加したEndothelial Basal Medium中で培養した。正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、初代成体線維芽細胞(Lonza)である。NHDFを、BulletKitおよび1mlのMycozap PR(Lonza)を添加したFGM-2 Growth Media(Lonza)中で培養した。
細胞外小胞の取込み
オレンジ由来のEVの細胞への取込みを評価するために、EVをPKH-26色素(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)で37℃にて30分間標識し、10mLポリカーボネートチューブを用いて4℃にて100,000gで2時間超遠心分離することにより洗浄した(SW 90 Tiローター、Beckman Coulter Optima L-90K超遠心機)。取込み実験では、25,000 HMEC細胞/ウェルを24ウェルプレートに播種し、生理食塩水(CTR-)、ヒドロゲル、またはヒドロゲルとEVの組合せを含む0.4μmの細孔を有するトランスウェルで培養した。各時点(6、24、48および72時間)後、トランスウェルを取り外し、細胞を十分に洗浄し、トリプシンで分離し、CytExpertソフトウェア(Beckman Coulter Optima L-90K、Fullerton、CA、USA)を備えたCytoFLEXフローサイトメーターを用いてFACSにより蛍光を測定した。
オレンジ由来のEVの細胞への取込みを評価するために、EVをPKH-26色素(Sigma-Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)で37℃にて30分間標識し、10mLポリカーボネートチューブを用いて4℃にて100,000gで2時間超遠心分離することにより洗浄した(SW 90 Tiローター、Beckman Coulter Optima L-90K超遠心機)。取込み実験では、25,000 HMEC細胞/ウェルを24ウェルプレートに播種し、生理食塩水(CTR-)、ヒドロゲル、またはヒドロゲルとEVの組合せを含む0.4μmの細孔を有するトランスウェルで培養した。各時点(6、24、48および72時間)後、トランスウェルを取り外し、細胞を十分に洗浄し、トリプシンで分離し、CytExpertソフトウェア(Beckman Coulter Optima L-90K、Fullerton、CA、USA)を備えたCytoFLEXフローサイトメーターを用いてFACSにより蛍光を測定した。
インビトロでの管形成アッセイ
管または毛細血管様構造のインビトロ形成を、24ウェルプレート中の増殖因子低減マトリゲル(BD Bioscience、Franklin Lakes、NJ、USA)で試験した。HMEC(25,000細胞/ウェル)を、DMEM単独(非処理の対照)またはEndoGRO MV-VEGF培地(陽性対照)、またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEM中、マトリゲルでコーティングされたウェルに播種した。各条件を3回繰り返し実施した。24時間のインキュベート後、5つのランダムフィールド位相コントラスト画像(倍率は×10)を各ウェルについて記録した。管構造のネットワークの全長を、ImageJソフトウェアを用いて測定した。結果を各条件当たりの全長の平均として表す。試験を、24、48および72時間で採取した条件培地で繰り返した。
管または毛細血管様構造のインビトロ形成を、24ウェルプレート中の増殖因子低減マトリゲル(BD Bioscience、Franklin Lakes、NJ、USA)で試験した。HMEC(25,000細胞/ウェル)を、DMEM単独(非処理の対照)またはEndoGRO MV-VEGF培地(陽性対照)、またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEM中、マトリゲルでコーティングされたウェルに播種した。各条件を3回繰り返し実施した。24時間のインキュベート後、5つのランダムフィールド位相コントラスト画像(倍率は×10)を各ウェルについて記録した。管構造のネットワークの全長を、ImageJソフトウェアを用いて測定した。結果を各条件当たりの全長の平均として表す。試験を、24、48および72時間で採取した条件培地で繰り返した。
インビトロでのスクラッチ試験アッセイ
内皮細胞(HMEC)および線維芽細胞(NHDF)を、適切な培養培地中で24ウェルプレートに約50×103細胞/ウェルの密度で播種した。細胞が完全なコンフルエントに達したとき、スクラッチを無菌チップで作製し、創傷を模倣した。刺激前(t=0)、Leicaカメラ(Leica、Wetzlar、Germany)を用いてウェルの顕微鏡写真を取得した。その後、細胞を、DMEM単独(陰性対照)、または陽性対照としてHMECについてはEndogro(Lonza)もしくはNHDFについては10%FBSを含むDMEM、またはEV含有DMEM(用量は109EV)またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEMで刺激した。「創傷閉鎖」現象を、Leicaカメラを用いて写真を撮りながら24時間モニターした。画像を、創傷領域を測定するImageJソフトウェア(Bethesda、MD、USA)により分析した。結果を、t0での創傷面積を100%として考慮し、24時間で細胞が占める対応する面積を計算して、創傷閉鎖の割合として表す。試験を、24、48および72時間で採取した条件培地で繰り返した。
内皮細胞(HMEC)および線維芽細胞(NHDF)を、適切な培養培地中で24ウェルプレートに約50×103細胞/ウェルの密度で播種した。細胞が完全なコンフルエントに達したとき、スクラッチを無菌チップで作製し、創傷を模倣した。刺激前(t=0)、Leicaカメラ(Leica、Wetzlar、Germany)を用いてウェルの顕微鏡写真を取得した。その後、細胞を、DMEM単独(陰性対照)、または陽性対照としてHMECについてはEndogro(Lonza)もしくはNHDFについては10%FBSを含むDMEM、またはEV含有DMEM(用量は109EV)またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEMで刺激した。「創傷閉鎖」現象を、Leicaカメラを用いて写真を撮りながら24時間モニターした。画像を、創傷領域を測定するImageJソフトウェア(Bethesda、MD、USA)により分析した。結果を、t0での創傷面積を100%として考慮し、24時間で細胞が占める対応する面積を計算して、創傷閉鎖の割合として表す。試験を、24、48および72時間で採取した条件培地で繰り返した。
インビトロでの増殖アッセイ
内皮細胞(HMEC)および線維芽細胞(NHDF)を96ウェルプレートに2,000細胞/ウェルの密度で播種し、付着させた。培養培地をDMEMに交換して一晩放置した。その後、細胞をDMEM単独(陰性対照)、または陽性対照としてHMECについてはEndogro(Lonza)もしくはNHDFについては10%FBSを含むDMEM、またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEMで72時間刺激した。各条件を4回繰り返し実施した。その後、10μlのBrdU標識溶液(BrdU比色アッセイ、Roche)を各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。刺激の影響を、24時間のインキュベーション後に分析した。アッセイの開発を、製造者の指示書に従って実施した。吸光度を、370nmでELISAリーダーにより測定した。各条件の平均吸光度を計算した。吸光度は増殖率に正比例する。すべての平均吸光度を、参照試料として用いる非処理の対照(CTR-)の平均に対して正規化した。結果は、1に等しい陰性対照と比較した相対増殖率を示している。
内皮細胞(HMEC)および線維芽細胞(NHDF)を96ウェルプレートに2,000細胞/ウェルの密度で播種し、付着させた。培養培地をDMEMに交換して一晩放置した。その後、細胞をDMEM単独(陰性対照)、または陽性対照としてHMECについてはEndogro(Lonza)もしくはNHDFについては10%FBSを含むDMEM、またはヒドロゲル単独もしくはEVを含むヒドロゲル(用量は109EV)の存在下のDMEMで72時間刺激した。各条件を4回繰り返し実施した。その後、10μlのBrdU標識溶液(BrdU比色アッセイ、Roche)を各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。刺激の影響を、24時間のインキュベーション後に分析した。アッセイの開発を、製造者の指示書に従って実施した。吸光度を、370nmでELISAリーダーにより測定した。各条件の平均吸光度を計算した。吸光度は増殖率に正比例する。すべての平均吸光度を、参照試料として用いる非処理の対照(CTR-)の平均に対して正規化した。結果は、1に等しい陰性対照と比較した相対増殖率を示している。
インビボ実験
9週齢の正常な雄性(BALB)または糖尿病のNOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)の雄性マウスに麻酔をかけ、背中の皮膚毛を電気シェービングにより除去した。NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)マウスにストレプトゾトシン(40mg/kg)を4日間腹腔内注射することにより糖尿病を誘発し、動物を、血糖値>200として糖尿病の約20日後に処置した。使い捨ての生検パンチ(PMD Medical)を用いて、正中線の両側に直径6mmの全層皮膚創傷を4つ作成した。各動物は、各創傷に対して異なる処置を受けた。創傷の作成日を0日として数えた。創傷測定により、動物を様々な時点(正常マウスは0、3、6日目;糖尿病マウスは0、3、6、10および14日目)でモニターした。各時点で、創傷に新たに処置を適用した。最後の時点で、マウスを屠殺し、背中の皮膚の創傷を組織学的分析のために採取した。組織学的分析を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて実施し、Imagejソフトウェアを用いて、創傷幅、創傷内に新たに形成された上皮の割合としての再上皮化の割合、創傷の上皮の厚さを測定するために使用した。
9週齢の正常な雄性(BALB)または糖尿病のNOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)の雄性マウスに麻酔をかけ、背中の皮膚毛を電気シェービングにより除去した。NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)マウスにストレプトゾトシン(40mg/kg)を4日間腹腔内注射することにより糖尿病を誘発し、動物を、血糖値>200として糖尿病の約20日後に処置した。使い捨ての生検パンチ(PMD Medical)を用いて、正中線の両側に直径6mmの全層皮膚創傷を4つ作成した。各動物は、各創傷に対して異なる処置を受けた。創傷の作成日を0日として数えた。創傷測定により、動物を様々な時点(正常マウスは0、3、6日目;糖尿病マウスは0、3、6、10および14日目)でモニターした。各時点で、創傷に新たに処置を適用した。最後の時点で、マウスを屠殺し、背中の皮膚の創傷を組織学的分析のために採取した。組織学的分析を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて実施し、Imagejソフトウェアを用いて、創傷幅、創傷内に新たに形成された上皮の割合としての再上皮化の割合、創傷の上皮の厚さを測定するために使用した。
統計分析
データ分析を、ソフトウェアGraph Pad 8デモ版を用いて実施した。結果を、平均±標準誤差(SEM)として表す。一元配置分散分析(ANOVA)を用いて群間の統計的差異を示し、スチューデントのt検定を2つの試料間の比較に用いた。有意性の最小レベルとしてp<0.05を用いた。
データ分析を、ソフトウェアGraph Pad 8デモ版を用いて実施した。結果を、平均±標準誤差(SEM)として表す。一元配置分散分析(ANOVA)を用いて群間の統計的差異を示し、スチューデントのt検定を2つの試料間の比較に用いた。有意性の最小レベルとしてp<0.05を用いた。
結果/実施例
実施例1
実験に、オレンジ由来のEVを用いた。EVを、分画超遠心分離またはタンジェンシャルフローろ過により単離した。2つの方法で得られたEVの特性評価の結果は同一であった。オレンジ由来のEVは、Nanosight分析により25~400nmの範囲の直径サイズを示し、直径の平均サイズは約200nm(図1A)であった。透過型電子顕微鏡(TEM)分析により示すとおり(図1Bおよび1E)、オレンジ由来のEVは、電子密度の高い膜によって区切られた丸い形態を示した。TEM分析により、EVの直径の平均サイズが約200nmであることが確認された。
実験に、オレンジ由来のEVを用いた。EVを、分画超遠心分離またはタンジェンシャルフローろ過により単離した。2つの方法で得られたEVの特性評価の結果は同一であった。オレンジ由来のEVは、Nanosight分析により25~400nmの範囲の直径サイズを示し、直径の平均サイズは約200nm(図1A)であった。透過型電子顕微鏡(TEM)分析により示すとおり(図1Bおよび1E)、オレンジ由来のEVは、電子密度の高い膜によって区切られた丸い形態を示した。TEM分析により、EVの直径の平均サイズが約200nmであることが確認された。
オレンジ由来のEVの含有量を調べるために、EVのタンパク質およびRNAの含有量を測定した。タンパク質濃度は図1Cに示されており、タンパク質含有量が不均一であり、109EV当たり平均600ngのタンパク質であることが示されている。RNA濃度は図1Dに示されており、RNA含有量は可変であり、1010EV当たり平均22ngのRNAであることが示している。
更なる分析により、オレンジ由来のEVが、HSP70、HSP80、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PD)、フルクトース-ビスリン酸アルドラーゼ6(FBA6)などの小胞に特徴的なタンパク質;およびパテリン-3様およびクラスリン重鎖などの植物タンパク質を含むことが示された。
また、オレンジ由来のEVの脂質含有量は、24-プロピリデンコレステロール、ベータシトステロール、ステアリン酸グリシドール、ジパルミチン、カンペステロール、エイコサノール、エイコサン、ヘキサデカン、ヘキサデカノール、オクタデカン、オクタデカノール、テトラデカン、テトラデセン、バレンセンおよびステアレートを含む、脂質のカーゴを明らかにした。
実施例2
ヒドロゲルがオレンジ由来のEVを制御された方法で保持および放出することを評価するために実験を行った。この目的のために、医薬品組成物の周囲の微小環境に放出されるEVおよびEVタンパク質の量を、経時的に測定した(図2)。簡単に説明すると、本発明の医薬組成物を生理食塩水と接触させ、EVの放出を生理食塩水中で経時的に測定した。この分析は、カルボキシメチルセルロースまたはコラーゲンのいずれかで構成されるヒドロゲルが、30分後にすでに粒子としてEVを放出できることを明確に示した(図2A、C)。さらに、タンパク質の定量により、EVが30分後にすでにヒドロゲルから放出されることが確認された(図2B、D)。EVの放出は30分後にすでに検出可能であり、時間の経過とともに24時間から48時間まで増加し、72時間後も存在していた。他のヒドロゲル(エチルセルロース、キトサン、ゼラチン、PEG)でも同様のデータが得られた。まとめると、これらの結果は、すべてのヒドロゲルが、オレンジ由来のEVを保持することができ、細胞または皮膚表面と接触させたときに、30分間の処理後にすでに始まり、少なくとも3日後まで、時間と共に増える制御放出ができることを示している。
ヒドロゲルがオレンジ由来のEVを制御された方法で保持および放出することを評価するために実験を行った。この目的のために、医薬品組成物の周囲の微小環境に放出されるEVおよびEVタンパク質の量を、経時的に測定した(図2)。簡単に説明すると、本発明の医薬組成物を生理食塩水と接触させ、EVの放出を生理食塩水中で経時的に測定した。この分析は、カルボキシメチルセルロースまたはコラーゲンのいずれかで構成されるヒドロゲルが、30分後にすでに粒子としてEVを放出できることを明確に示した(図2A、C)。さらに、タンパク質の定量により、EVが30分後にすでにヒドロゲルから放出されることが確認された(図2B、D)。EVの放出は30分後にすでに検出可能であり、時間の経過とともに24時間から48時間まで増加し、72時間後も存在していた。他のヒドロゲル(エチルセルロース、キトサン、ゼラチン、PEG)でも同様のデータが得られた。まとめると、これらの結果は、すべてのヒドロゲルが、オレンジ由来のEVを保持することができ、細胞または皮膚表面と接触させたときに、30分間の処理後にすでに始まり、少なくとも3日後まで、時間と共に増える制御放出ができることを示している。
実施例3
生物学的作用を発揮するには、オレンジ由来のEVがヒドロゲルから放出され、標的細胞に侵入する必要がある。医薬組成物に組み込まれたEVの機能を評価するために、これらの小胞が様々な時点(6、24、48および72時間)で標的細胞に侵入する(取り込み)能力を分析する実験を行った(図3)。このタイプの実験では、蛍光色素で標識したオレンジ由来のEV(108EV、109EV、1010EV)の用量を増やして、医薬組成物中に含ませた。
生物学的作用を発揮するには、オレンジ由来のEVがヒドロゲルから放出され、標的細胞に侵入する必要がある。医薬組成物に組み込まれたEVの機能を評価するために、これらの小胞が様々な時点(6、24、48および72時間)で標的細胞に侵入する(取り込み)能力を分析する実験を行った(図3)。このタイプの実験では、蛍光色素で標識したオレンジ由来のEV(108EV、109EV、1010EV)の用量を増やして、医薬組成物中に含ませた。
組成物を標的細胞と接触させ、標的細胞(内皮細胞)におけるEVの取込みを細胞蛍光測定分析により定量した。取込み率を、本発明の医薬組成物をEV単独(ヒドロゲルなし)および標的細胞単独(陰性対照、CTR-)と比較することにより評価した。図3に示す結果は、医薬組成物に含まれるEVおよびEV単独の両方が標的細胞に侵入することを示している。興味深いことに、EV単独の取込みは、6時間および24時間の処理後にヒドロゲルに含まれるEVと比較して有意に高かった。しかしながら、時間が長くなると、すなわち48時間および72時間では傾向が逆転し、EVとヒドロゲルの組み合わせにより、標的細胞への取込みが有意に増加した。この影響は時間とともに増加し、72時間で最大のピークに達した。まとめると、これらのデータは、ヒドロゲルがEVを分解から保護し、24時間後にすでに、EV単独と比較して、これらの小胞のより効率的かつ長期的な放出と標的細胞への取込みを可能にすることを示している。同様のデータが、異なるヒドロゲル(カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、エチルセルロース、キトサン、ゼラチン、PEG)で得られた。
実施例4
本発明の医薬組成物の治療可能性を調べるために、インビトロ機能試験を行った。特に、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む医薬組成物の、内皮細胞の血管新生および移動、ならびに線維芽細胞の移動を促進する能力をインビトロで試験した。
本発明の医薬組成物の治療可能性を調べるために、インビトロ機能試験を行った。特に、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む医薬組成物の、内皮細胞の血管新生および移動、ならびに線維芽細胞の移動を促進する能力をインビトロで試験した。
ヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物を用いて、インビトロで細胞を24、48および72時間刺激した。ここに示す結果は、2種類のヒドロゲル、すなわちカルボキシメチルセルロースのヒドロゲル(H1)およびコラーゲンのヒドロゲル(H2)を用いて得られたものである。同様の結果を、ゼラチン、キトサン、PEGおよびエチルセルロースを含む、他の種類のヒドロゲルでも得た。
EV血管新生促進能力を、管形成アッセイにより、ヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物またはヒドロゲル単独またはEV単独を含むマトリゲルに内皮細胞を播種し(図4)、24、48および72時間インキュベートして試験した。内皮細胞を、オレンジ由来のEV単独(EV)、ヒドロゲル単独(H1、H2)、またはヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物(H1+EV、H2+EV)で刺激した。24、48または72時間のEVの放出後、すべての条件を試験した。非処理の対照(CTR-)と比較してEV単独(EV)で、およびヒドロゲル単独(H1およびH2)と比較してヒドロゲルとEVを含む組成物(H1+EV、H2+EV)で、管の全長の有意な増加が観察された。さらに、ヒドロゲルとEVを含む組成物(H1+EV、H2+EV)は、EV単独(EV)およびヒドロゲル単独(H1、H2)より血管新生の促進において有意に効果的であることが示された。このような結果は、各時点(24、48および72時間)で観察された。これは、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む組成物が、内皮細胞に対する血管新生の促進において相乗効果を有し、このような医薬組成物が、1日(24時間)の処置後にすでにヒドロゲル単独またはオレンジ由来のEV単独より有意に効果的であることを示している。当該効果は、処置後少なくとも3日間にわたって維持される。
内皮細胞および線維芽細胞の移動に対する本発明の医薬組成物の影響を、細胞の単層にスクラッチを行い、24時間後の細胞の移動を測定することによって評価した。ヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物を用いて、インビトロで細胞を24、48および72時間刺激した。
ここに示す結果は、2種類のヒドロゲル、カルボキシメチルセルロースのヒドロゲル(H1)およびコラーゲンのヒドロゲル(H2)を用いて得られたものである。同様の結果を、ゼラチン、キトサン、PEGおよびエチルセルロースを含む、他の種類のヒドロゲルでも得た。
細胞移動の促進にも効果的であるが、統計的に有意に低い程度であるEV単独(EV)、および効果的でなく、非処理の対照に匹敵するヒドロゲル単独(H1およびH2)と比較して、オレンジ由来のEVとヒドロゲルの組合せ(H1+EVおよびH2+EV)を用いると、内皮細胞(図5)および線維芽細胞(図6)の有意に高い移動速度が観察された。24、48または72時間のEVの放出後および両種の細胞で、すべての条件を試験した。実験は、オレンジ由来のEVとヒドロゲルが、新しい血管の形成だけでなく、内皮細胞の移動の促進においても相乗効果を有し、このような医薬組成物が、1日(24時間)の処置後にすでにヒドロゲル単独またはオレンジ由来のEV単独より有意に効果的であることを示している。当該効果は、処置後少なくとも3日間にわたって維持される(図5)。実際、内皮細胞の移動は、新しい血管の形成(血管新生)に寄与し、このデータは、本発明の医薬組成物の血管新生促進活性を裏付ける。
線維芽細胞でも同様の結果が得られ(図6)、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む医薬組成物が、病変に存在する他の細胞タイプを促進することにより治療効果を発揮することを示している。実際、線維芽細胞は再生過程に関与しており、その移動の促進は創傷閉鎖の加速に寄与する。本発明の医薬組成物が病変部位の複数の細胞に作用できるという事実は、組織再生および創傷閉鎖の促進に対するその有益な効果を裏付ける。
また、内皮細胞および線維芽細胞に対して様々な種類のヒドロゲルが毒性ないことを、インビトロで増殖アッセイにより評価した(図7)。カルボキシメチルセルロースヒドロゲル(H1)またはコラーゲンヒドロゲル(H2)は、線維芽細胞(図、右上のパネル)および内皮細胞(図7、左上のパネル)の増殖速度に影響を与えず、低下させないことが観察された。同様の結果は、ゼラチン、キトサン、エチルセルロースおよびPEGを含む様々な種類のヒドロゲルでも得られた。化合物の毒性は、細胞の増殖の低下によって明らかになる。H1またはH2で刺激された線維芽細胞および内皮細胞の増殖率は、基礎状態(刺激していない対照、CTR-)に匹敵する。このデータは、ヒドロゲルが毒性ではなく、治療目的でオレンジ由来のEVと組み合わせて使用できることを示している。
また、ヒドロゲルから放出されたオレンジ由来のEV(H1+EVおよびH2+EV)は、オレンジ由来のEV単独(EV)またはヒドロゲル単独(H1およびH2)と比較して、内皮細胞の増殖を有意に増加させることが観察された(図7、下のパネル)。本発明の組成物において、オレンジ由来のEVとヒドロゲルは、非処理の対照(CTR-)と比較して内皮細胞の増殖の促進において相乗効果を有し、当該組成物は、ヒドロゲル単独またはオレンジ由来のEV単独より有意に効果的である。ここに示す結果は、2種類のヒドロゲル、カルボキシメチルセルロースのヒドロゲル(H1)およびコラーゲンのヒドロゲル(H2)を用いて得られたものである。同様の結果を、ラチン、キトサンおよびエチルセルロースを含む、他の種類のヒドロゲルでも得た。
実施例4に示したすべての実験により、EVがヒドロゲルから徐々に放出され、各時点(24、48および72時間)で生物学的効果を維持できることが確認される。本発明の医薬組成物は、数時間(6時間)の処置後にすでにヒドロゲルおよびEV生物活性の両方を改善する。当該効果は、処置後少なくとも3日間にわたって維持される。実際、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む医薬組成物は、数時間の処置後にすでに効果的であり、数日間有効性を維持し、レシピエント細胞へのEVのゆっくりした分布を保証する。
実験例4に示したすべての結果は、オレンジ由来のEVとヒドロゲルを含む医薬組成物の治療活性が主にその血管新生促進活性によって媒介されることを示している。実際、EVとヒドロゲルの組合せは、内皮細胞の増殖および移動を促進し、より高い新しい血管の形成を誘導する。さらに、EVとヒドロゲルの組合せは、線維芽細胞など、病変の再生に関与し、病変に存在する他の細胞タイプにも作用する。線維芽細胞の移動を促進することにより、EVとヒドロゲルの組合せは、線維芽細胞が病変部位に移動してコラーゲンを沈着させ、創傷閉鎖の促進に貢献することができる。
実施例5
医薬組成物の治療効果を評価するために、様々なヒドロゲルをオレンジ由来のEVと組み合わせて、その活性を潰瘍のインビボモデルで試験した(図8)。マウスモデルで潰瘍を誘発し、カルボキシメチルセルロース(H1)、カルボキシメチルセルロースおよびEV(H1+EV)、キトサン(H2)、キトサンおよびEV(H2+EV)で処置した。3日後、薬物を変更し、6日間の処置後に治療効果を評価した。効果を、処置前の時間0での最初の創傷面積と比較した創傷面積の割合として測定した。データは、ヒドロゲル単独(カルボキシメチルセルロースおよびキトサン)の両方が、非処置の創傷(CTR-)と比較して創傷面積をわずかに減少させることができたことを明確に示した(図8)。重要なことに、各ヒドロゲルとオレンジ由来のEVの組合せは、治療効果を有意に増加させた(H1+EV対H1、およびH2+EV対H2)。結果により、ヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物の治療効果が確認された。より具体的には、この実験は、ヒドロゲルとEVの組合せが、ヒドロゲル単独より創傷閉鎖の加速により効率的であることを示している。この理由から、本発明の医薬組成物は、血管新生が治癒過程に有利に働き、加速させるいくつかの種類の病変、例えば火傷、瘻孔、乾癬、角化症、角膜炎、裂傷、外傷性潰瘍、粘膜病変(例えばプロテアーゼによる外傷性病変、および口腔、褥瘡性、性器粘膜病変)、皮膚炎(にきび、湿疹、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、異汗性湿疹、神経皮膚炎、疱疹状皮膚炎を含む)、前がん病変の処置を目的としたアポトーシス促進薬によって誘発される細胞損傷(例えば光線性角化症)の処置に特に有用である。
医薬組成物の治療効果を評価するために、様々なヒドロゲルをオレンジ由来のEVと組み合わせて、その活性を潰瘍のインビボモデルで試験した(図8)。マウスモデルで潰瘍を誘発し、カルボキシメチルセルロース(H1)、カルボキシメチルセルロースおよびEV(H1+EV)、キトサン(H2)、キトサンおよびEV(H2+EV)で処置した。3日後、薬物を変更し、6日間の処置後に治療効果を評価した。効果を、処置前の時間0での最初の創傷面積と比較した創傷面積の割合として測定した。データは、ヒドロゲル単独(カルボキシメチルセルロースおよびキトサン)の両方が、非処置の創傷(CTR-)と比較して創傷面積をわずかに減少させることができたことを明確に示した(図8)。重要なことに、各ヒドロゲルとオレンジ由来のEVの組合せは、治療効果を有意に増加させた(H1+EV対H1、およびH2+EV対H2)。結果により、ヒドロゲルとオレンジ由来のEVを含む医薬組成物の治療効果が確認された。より具体的には、この実験は、ヒドロゲルとEVの組合せが、ヒドロゲル単独より創傷閉鎖の加速により効率的であることを示している。この理由から、本発明の医薬組成物は、血管新生が治癒過程に有利に働き、加速させるいくつかの種類の病変、例えば火傷、瘻孔、乾癬、角化症、角膜炎、裂傷、外傷性潰瘍、粘膜病変(例えばプロテアーゼによる外傷性病変、および口腔、褥瘡性、性器粘膜病変)、皮膚炎(にきび、湿疹、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、異汗性湿疹、神経皮膚炎、疱疹状皮膚炎を含む)、前がん病変の処置を目的としたアポトーシス促進薬によって誘発される細胞損傷(例えば光線性角化症)の処置に特に有用である。
本発明の医薬組成物の治療活性をさらに分析する目的で、当該組成物の再生効果を、糖尿病性潰瘍のインビボマウスモデルで評価した(図9)。実際、糖尿病性潰瘍は、組織再生能力を損なう糖尿病状態のため、通常の潰瘍より閉鎖が困難である。創傷面積を、処置前の時間0での最初の面積に対する創傷面積の割合として表した(図9A)。創傷を糖尿病マウスに施し、薬物を3日ごとに変更した。創傷面積の測定を、時間0と3、6、10および14日後に行った。分析は、本発明の医薬組成物での処置が、非処置の創傷(CTR-)およびヒドロゲル単独(ヒドロゲル)と比較して、各時点で創傷閉鎖の加速に最も効果的であることを明確に示した(図9A)。
さらに、ヒドロゲルとEVの組合せでの処置は、3日間の処置後にすでに創傷面積の有意な減少を誘発できた(図9A)。組織の組織学的分析により、ヒドロゲル単独および非処置の創傷(CTR-)と比較して、本発明の組成物のより高い治療効果が確認された(図9B、C、D)。ヘマトキシリンとエオシンで染色した組織切片を用いて、創傷の幅(図9B)、再上皮化の割合(図9C)、および上皮の厚さ(図9D)を測定した。
創傷の幅は、ヒドロゲル単独での処置または非処置の対照と比較して、ヒドロゲルとEVの組合せでの処置で有意に減少した(図9B)。
再上皮化の割合の分析は、ヒドロゲルとEVの組合せでの処置が、ヒドロゲル単独での処置または非処置の対照と比較して、創傷における新しい上皮の有意に高い形成を誘導したことを示した(図9C)。新しい上皮は、創傷閉鎖に不可欠である。
最後に、ヒドロゲルとEVの組合せでの処置を受けた組織切片は、ヒドロゲル単独での処置または非処置の対照と比較して、より高い上皮の厚さを示し(図9D)、これは、再生がより効率的であり、正常のより高度な上皮の厚さを回復できることを示している。
まとめると、すべてのデータより、糖尿病性潰瘍の創傷閉鎖の促進において、ヒドロゲル単独での処置と比較して、すでに3日間の処置後に、本発明の医薬組成物のより高い治療効果が確認される。これは、そのような医薬組成物が、糖尿病性足潰瘍、糖尿病性粘膜潰瘍、代謝異常性潰瘍の場合、または虚血性潰瘍、例えば褥瘡、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、虚血性潰瘍、滲出性潰瘍、外傷性潰瘍を含む虚血性損傷、および他の粘膜病変の存在のように、自然な血管新生過程が損なわれているかまたは欠陥のあるいくつかの種類の病変の処置に特に有用であることを示している。
Claims (15)
- 下記:
(i)オレンジ由来の細胞外小胞(EV);
(ii)ポリマーゲル化剤;
(iii)組成物の総重量の少なくとも10重量%の量の水;および
(iv)所望により、医薬的に許容されるビヒクル、添加剤および/または希釈剤
を含む、ヒドロゲルの形態の医薬組成物であって、
オレンジ由来の細胞外小胞(EV)が、脂質二重膜によって囲まれており、光散乱に基づくナノ粒子トラッキング解析(NTA)によって測定される直径が、10~500nmの範囲であること、および血管新生促進活性を示すことを特徴とし、
ポリマーゲル化剤と水が、オレンジ由来のEVが分散しているヒドロゲルマトリックスを形成し、該オレンジ由来のEVが、ヒドロゲルマトリックスから放出可能であり、
組成物が、組織修復および/または再生治療法における使用のためのものである、組成物。 - オレンジ由来のEVが、シトラス・シネンシス種の1つ以上の植物および/または該1つ以上のシトラス・シネンシス植物の1つ以上の果実由来である、請求項1に記載の使用のための医薬組成物。
- オレンジ由来のEVの量が、組成物の総容量に対して1010~1012EV/mlの範囲である、請求項1または2に記載の使用のための医薬組成物。
- オレンジ由来のEVタンパク質の量が、組成物の総容量に対して5μg~500μg/mlの範囲である、請求項1または2に記載の使用のための医薬組成物。
- オレンジ由来のEVのタンパク質含有量が、1~1×103ng/109EVの範囲である、のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- オレンジ由来のEVのRNA含有量が、10~60ng/1010EVの範囲である、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- ポリマーゲル化剤が、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、コラーゲン、加水分解コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸(HA)、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)、グリセリン、プロピレングリコール、アルギン酸カルシウム、およびそれらのあらゆる組合せを含む、セルロースおよびセルロースベースのポリマーからなる群より選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- 抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、増殖因子、再生促進剤、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される治療剤をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- pHが3.5~7.0である、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- 組織病変を閉鎖するための再生治療法における使用のための、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 虚血性潰瘍(例えば褥瘡、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、虚血性潰瘍、滲出性潰瘍、代謝異常性潰瘍、外傷性潰瘍)、粘膜病変(例えば糖尿病性病変)、火傷、瘻孔、乾癬、角化症、角膜炎、裂傷、外傷性潰瘍、粘膜病変(プロテアーゼによる外傷性病変、および口腔、褥瘡性、性器粘膜病変を含む)、皮膚炎(にきび、湿疹、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、異汗性湿疹、神経皮膚炎、疱疹状皮膚炎を含む)、および前がん病変の処置を目的としたアポトーシス促進薬によって誘発される細胞損傷(光線性角化症を含む)からなる群より選択される疾患または状態の治療的処置における使用のための、請求項1~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 局所投与または注射による投与に適した、請求項1~11のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- 処置が、少なくとも1日間にわたるヒドロマトリックスからのオレンジ由来のEVの放出を含む、請求項12に記載の使用のための医薬組成物。
- ヒドロマトリックスからのオレンジ由来のEVの放出が、少なくとも7日間にわたって行われる、請求項13に記載の使用のための医薬組成物。
- 下記工程:
(i)ポリマーゲル化剤を所定量の水に溶解させて、ヒドロゲルマトリックスを得る工程であって、所定量の水が、医薬組成物の総重量の少なくとも10重量%を占める工程;
(ii)請求項1、2、3、4、5または6のいずれか一項に定義されるオレンジ由来の細胞外小胞(EV)を、工程(i)で得られたヒドロゲルマトリックスに加える工程;および
(iii)該オレンジ由来のEVをヒドロゲルマトリックスと混合して、これにより、EVがヒドロゲルマトリックス中に分散したヒドロゲル形態の医薬組成物を得る工程
を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法。
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