KR20230079386A - 오렌지 유래 세포외 소포를 포함하는 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조직 복구 및/또는 재생 치료 방법에 사용하기 위한, 10 내지 500 nm 범위의 직경을 가지며 혈관신생 촉진 활성을 보이는 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 포함하는 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약학적 조성물에서, 오렌지 유래 EV는 하이드로겔 매트릭스에 분산되며 상기 매트릭스로부터 방출될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 제약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

오렌지 유래 세포외 소포를 포함하는 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물
본 발명은 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 포함하는 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물 및 재생 요법에서의 이의 용도에 관한 것이다.
세포외 소포(EV, Extracellular vesicle)는 모든 종류의 살아있는 세포에 의해 방출된 작은 입자의 혼합 집단이다. 세포외 소포(EV)에는 원형질막의 발아를 통해 방출되는 미세소포, 및 엔도솜 구획에서 유래된 엑소좀이 포함된다. 세포외 소포는 "입자", "미세입자", "나노소포", "미세소포" 및 "엑소좀"으로 언급된다(Yanez-Mo M, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015 May 14; 4:27066 doi: 10.3402/jev.v4.27066; Lotvall J, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 2014 Dec 22;3:26913. doi: 10.3402/jev.v3.26913.; Harrison P, et al. Extracellular Vesicles in Health and Disease. CRC Press, pages 1-5, 2014).
EV는 세포질 단백질, 표면 수용체, 지질 상호작용 단백질, DNA 및 RNA 분자를 함유하는 인지질 이중층에 의해 형성된다. 운반물(cargo)은 복잡하고 기원하는 세포에 따라 달라진다. EV는 그것의 운반물을 수령 세포에 전달할 수 있고, 이런 방식으로 신호전달 캐스케이드 및 세포 반응을 활성화하는 세포간 통신을 매개한다.
세포외 소포는 거의 모든 포유류 세포 유형 및 체액으로부터, 및 또한 박테리아 및 식물을 포함한 하등 유기체로부터 분리되었다. 최근에, 수많은 치료 접근법이 피부 재생 적용을 포함한 세포외 소포의 용도에 초점이 맞춰졌다.
CN 2016/10983610A는 표피 손상을 치료하기 위해 분무 병에서 사이토카인과 조합되는 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 세포외 소포의 용도를 개시한다.
CN109865033A는 당뇨병성 족부 손상을 회복시키기 위한, 중간엽 줄기 세포 엑소좀 및 연고 조성물을 포함하는, 외용 연고의 용도를 개시한다.
최근의 발견은 식용 식물로부터 유래된 EV가 또한 피부에 유익한 치료 효과를 나타내는 것을 보여주었다.
WO2017/052267은 주름 형성, 보습, 미백, 상피 세포 증식 및 콜라겐 침착의 측면에서 피부 개선을 촉진하기 위하여 국소적으로 투여된 식용 천연 식물 유래 EV의 용도를 개시한다.
WO 2019/027387 A2는 각질 형성 세포의 이동을 유도할 수 있기 때문에 상처 치유를 촉진하기 위한 밀통, 마늘 및 생강으로부터 유래된 세포외 소포의 용도를 개시한다.
PCT/EP2020/056632는 오렌지 유래 EV를 포함한 식물 유래 EV, 및 궤양, 피부염, 각막 손상, 눈 질환, 점막 병변 및 감염성 병변의 치료를 위한 이의 치료 용도를 개시한다.
상처 및 병변에 이용 가능한 현재의 치료 중에서, 가장 일반적인 약물치료 중 하나는 하이드로겔에 의해 대표된다. 원래 1950년대에 개발된 하이드로겔은 상처 표면으로부터 유체 교환을 조절하는 광범위한 수화 중합체 드레싱을 포함한다. 그것은 상처 기저부의 유체 수준을 조절하고 습한 환경을 유지하여, 조직 복구를 유리하게 하기 때문에 피부 상처 및 병변에 대한 치료제로서 사용된다. 위에서 언급된 특성에도 불구하고, 하이드로겔은 세포 증식, 세포 이동 또는 혈관 신생과 같은 치유 과정을 직접적으로 촉진할 수 없기 때문에 치료제로서 효과는 빈약하다(Tavakoli S, Klar AS. Advanced Hydrogels as Wound Dressings. Biomolecules. 2020;10(8):E1169. Published 2020 Aug 11. doi:10.3390/biom10081169. Broussard KC, Powers JG. Wound dressings: selecting the most appropriate type. Am J Clin Dermatol. 2013;14(6):449-459. doi:10.1007/s40257-013-0046-4).
선행 기술의 한계 및 단점을 극복하기 위하여, 본 발명은 첨부된 독립 청구항에서 정의된 것과 같이 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 포함하는 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물뿐만 아니라 상기 제약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다. 종속 청구항은 청구된 조성물 및 방법의 추가의 유익한 특징을 확인한다. 첨부된 청구범위의 주제는 본 발명의 필수 부분을 형성한다.
본 발명자들은 오렌지 식물 또는 오렌지 과일로부터 유래된 세포외 소포가 피부 봉합, 특히 혈관신생을 위한 유익한 과정을 촉진한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들에 의해 수행된 실험적인 연구는 놀랍게도 하이드로겔과 조합된 오렌지 유래 세포외 소포(EV)가 허혈 또는 손상된 혈관신생을 특징으로 하는 피부 병변의 재생을 촉진하는데 있어 세포외 소포 또는 하이드로겔 단독과 비교하여 상당히 더 효과적인 것을 드러냈다.
본 발명자들이 알기로, 선행 기술은 허혈 또는 손상된 혈관신생을 특징으로 하는 상처 및 피부 병변에 국소적으로 투여되었을 때 하이드로겔과 이들 세포외 소포(EV)의 복합체의 혈관신생 촉진(proangiogenic) 효과 또는 치료 효과를 갖는 오렌지 식물 또는 오렌지 과일로부터 유래된 세포외 소포를 개시하지 않는다.
그러므로, 본 발명의 측면은 조직 복구 및/또는 재생 치료 방법에 사용하기 위한, 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물로서,
(i) 오렌지 유래 세포외 소포(EV);
(ii) 중합체 겔화제;
(iii) 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 10 중량%의 양의 물; 및
(iv) 선택적으로, 제약학적으로 허용 가능한 비히클, 부형제, 및/또는 희석제를 포함하며,
상기 오렌지 유래 세포외 소포(EV)는 지질 이중층 막에 의해 둘러싸이고, 광산란 기반 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 측정되는 10 내지 500 nm의 범위의 직경을 가지고 혈관신생 촉진 활성을 가지며,
상기 중합체 겔화제 및 물은 오렌지 유래 세포외 소포(EV)가 분산되는 하이드로겔 매트릭스를 형성하고, 상기 EV는 하이드로겔 매트릭스로부터 방출 가능하다.
본원에서 사용되는, 용어 "오렌지 유래 세포외 소포"는 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis) 과일로서 의도된 오렌지 과일로부터 유래된 나노입자뿐만 아니라 시트러스 시넨시스 종의 하나 이상의 식물로부터의 세포로부터 유래된 나노입자를 지칭한다. 용어 시트러스 시넨시스라는 용어는 기술분야에 알려져 있는 임의의 시트러스 시넨시스 변종을 포함하는 것으로 이해된다. 그러한 변종의 비제한적인 예는 발렌시아(Valencia), 네이블(Navel), 레드 오렌지(Red Orange), 블러드 오렌지(Blood Orange), 타로코(Tarocco), 스윗 오렌지(Sweet Orange), 모로(Moro), 상귀넬로(Sanguinello), 및 뉴홀(Newhall)이다.
오렌지 유래 세포외 소포(EV)는 인지질 이중층에 의해 구분되거나 캡슐화되며 그것이 유래되는 세포부터 유래된 지질, 단백질, 핵산 및 기타 분자를 운반한다. 종래에는, 세포외 소포는 10-1000 nm 범위의 직경을 가진다.
본 발명은 10 내지 500 nm 범위, 바람직하게는 20 내지 400 nm 범위, 보다 더 바람직하게는 25 내지 350 nm 범위의 직경을 가지는 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 사용한다.
기술분야에 숙련된 사람은 EV 직경을 측정하기 위해 이용 가능한 표준 방법에 대해 잘 알고 있다.
그러한 방법 중에서, 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)이 브라운 운동의 분석을 토대로 10 - 1000 nm의 범위의 현탁액 중의 나노입자를 시각화하고 측정하기 위해 전형적으로 사용된다. 이 방법은 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)으로 용액 중의 세포외 소포의 특성화를 허용한다. 각각의 소포는 확산의 직접 관찰에 의해 개별적으로 그러나 동시에 분석된다. 이 분석으로 입자 농도 및 크기 분포를 측정할 수 있다. 크기는 소위 유체역학적 직경으로 불리는, 입자의 병진 확산 직경의 측정을 허용하는 브라운 운동과 관련이 있다. 입자 이동 속도는 액체의 점도, 및 입자의 온도 및 크기와 관련이 있으며 입자 밀도 또는 굴절률의 영향을 받지 않는다. 입자의 이동 속도는 스톡스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)을 통해 계산된 구 등가(sphere-equivalent) 유체역학적 반경과 관련이 있다. 실제로, 현탁액에서 입자 또는 분자의 브라운 운동은 레이저 빛이 상이한 강도로 산란되는 것을 유발한다. 이들 강도 변동의 분석은 스톡스-아인슈타인 관계를 사용하여 브라운 운동의 속도와 따라서 입자 크기를 산출한다.
기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 투과 전자 현미경검사(Transmission Electron Microscopy, TEM)가 또한 EV의 형태를 특성화하기 위한 표준 도구인 것으로 간주된다. TEM은 EV의 직접적인 시각화 및 특성화를 허용하는 고해상도의 현미경검사 방법이다. EV를 시각화할 수 있는 가장 많이 사용되는 기법 중 하나인 TEM은 EV 구조, 형태, 막 통합성 및 크기를 연구하는 것을 허용한다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 제약학적 조성물 중의 오렌지 유래 EV의 양은 조성물의 총 부피에 대해 1010 내지 1012 EV/ml의 범위이고, 보다 바람직하게 오렌지 유래 EV의 양은 1011 EV/ml이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 제약학적 조성물 중의 오렌지 유래 EV 단백질의 양은 조성물의 총 부피에 대해 5 μg 내지 500 μg/ml 범위이고, 보다 바람직하게는 조성물의 총 부피에 대해 40 μg 내지 60 μg/ml 범위이다.
본 발명의 한 구현예에서, EV 집단의 단백질 함량은 1 내지 103 ng/109 EV의 범위이다.
또 다른 구현예에서, EV의 RNA 함량은 10 내지 60 ng/1010 EV의 범위이다.
표현 "단백질 함량" 및 "RNA 함량"은 둘 다 본 발명에서 사용된 EV의 내부 및 막 함량을 포함한다.
본 발명에서 사용된 EV의 지질의 예는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 24-프로필리덴 콜레스테롤(24-Propylidene cholesterol), 베타 시토스테롤(beta sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 다이팔미틴(dipalmitin), 에이코사놀(eicosanol) 및/또는 글리시돌 스테아레이트(glycidol stearate)를 포함한다.
본 발명의 범주는 시트러스 시넨시스의 단일 변종의 과일 및/또는 식물로부터 유래된 EV를 함유하는 제약학적 조성물뿐만 아니라 복수의 시트러스 시넨시스 변종의 과일 및/또는 식물로부터 유래된 EV를 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다.
본 발명에서 사용된 EV는 혈관신생 촉진 활성을 보이는 것을 특징으로 한다.
본 설명 내에서, 표현 "혈관신생 촉진 효과"는 내피 세포 이동, 내피 세포에 의한 증식 또는 혈관 형성의 촉진 및 시험관내 또는 생체내에서 혈관신생 촉진 매개체의 증가된 방출로서 의도된다. 혈관신생은 기본적인 생물학적 과정이고 그것의 손상은 허혈성 궤양(ischemic ulcer), 예컨대 압력 궤양(pressure ulcer), 동맥 궤양(arterial ulcer), 정맥 궤양(venous ulcer), 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 허혈성 궤양, 삼출성 궤양(exudative ulcer), 대사 이상성 궤양(dysmetabolic ulcer), 외상성 궤양(traumatic ulcer), 및 당뇨병성 병변(diabetic lesion)과 같은 점막 병변(mucosal lesion)을 포함한, 여러 종류의 병변의 병인에 관여한다. 더욱이, 혈관신생은 세포에 영양분을 제공하고 조직 재생을 허용하기에 필수적이다. 혈관신생은 화상(burn), 누공(fistulae), 건선(psoriasis), 각화증(keratosis), 각막염(keratitis), 열구(fissure), 외상성 궤양, 점막 병변(예컨대 보철물로 인한 외상성 병변 및 구강, 욕창(decubital), 생식기 점막 병변), 피부염(여드름(acne), 습진(eczema), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 이한증성 습진(dyshidrotic eczema), 신경피부염(neurodermatitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis) 포함), 전암성 병변(예컨대 광선 각화증(actinic keratosis))을 치료하기 위한 목적의 세포자멸사 촉진 약물에 의해 유도된 세포 손상을 포함한 상이한 병변의 재생을 가속화한다. 따라서, 본 발명에서 사용된 오렌지 유래 EV는 위에서 언급된 질환의 치료에 특히 유용하다.
바람직하게, 본 발명에 따른 오렌지 유래 EV는 오렌지 주스 또는 오렌지 식물 세포의 배양 배지로부터 정제된다. 오렌지 식물 세포는 잎, 과일 펄프, 싹 또는 새싹으로부터 유래될 수 있다.
적합한 정제 기법에는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 초원심분리(ultracentrifugation) 및 접선 흐름 여과(tangential flow filtration)가 포함된다. 오렌지 유래 EV의 정제를 위해 사용될 가장 적합한 방법의 선택은 기술분야에 숙련된 통상적인 지식을 가진 사람의 지식 및 기술 내에 속한다.
본 발명의 한 구현예에서, 제약학적 조성물 중의 오렌지 유래 EV는 신선하게 제조된다. 또 다른 구현예에서, 제약학적 조성물 중의 오렌지 유래 EV는 하이드로겔과 조합되기 전에 4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 보관된다. 또 다른 구현예에서, 오렌지 유래 EV는 하이드로겔과 혼합되기 전에 동결건조된다.
본 발명에 따르면, 제약학적 조성물은 하이드로겔의 형태이다. 하이드로겔은 수팽윤(water-swollen)이고, 중합체 겔화제의 하나 이상의 단량체의 간단한 반응에 의해 생성되는 가교된 중합체 네트워크이다. 전형적으로, 하이드로겔 매트릭스는 물과 한 가지 유형의 중합체 또는 상이한 중합체의 조합으로 구성된다. 발명에 따르는 제약학적 조성물 중의 물의 양은 조성물의 총 중량의 적어도 10 중량%이다.
본 발명의 제약학적 조성물에 사용하기에 적합한 중합체 겔화제의 예시적인 비제한적인 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 셀룰로스 및 셀룰로스 기반 중합체, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 셀룰로스 검, 콜라겐, 가수분해된 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 히알루론산(HA), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리황화 글리코사미노글리칸(polysulfated glycosaminoglycan, PSGAG), 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 알긴산 칼슘을 들 수 있다.
본 발명의 범주 내에는 물과 단일 중합체 또는 상이한 중합체의 조합으로 구성된 하이드로겔이 있다. 중합체 분자는 천연 형태로 또는 화학적으로 변형되어 사용될 수 있는 것이 이해된다. 그러한 구성요소는 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
하이드로겔은 예를 들어, 시트, 무정형 겔(건조 또는 사전 혼합됨), 및 함침된 거즈를 포함한 여러 상이한 물리적 상태로 이용 가능할 수 있는 장점을 가진다. 그것의 높은 수분 함량은 그것이 연조직에서 고도로 수화된 생리적 세포외 매트릭스 환경을 모방하기 때문에 여러 생체의학적 적용에 매력적이다. 실제로, 하이드로겔은 재수화되고 습한 환경을 유지하는 능력을 가지기 때문에 건조한 상처의 치료에 특히 유용하다. 더욱이, 이들 시스템은 상처를 봉합된 상태로 유지하고, 괴사성 조직의 제거를 자가용해를 통해 촉진하며, 상처 괴사조직 제거를 촉진한다. 그것은 또한 상처에 대한 냉각 효과를 가지며 인지된 통증을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물에서, 오렌지 유래 EV는 하이드로겔 매트릭스에 분산되고 캡슐화되며 상기 매트릭스로부터 손상된 조직에 제어된 방식으로, 즉 점진적으로 및 연장된 기간에 걸쳐 방출될 수 있다.
더욱이, EV 조제물의 하이드로겔 캡슐화는 이들 소포를 안정화시키고 분해로부터 보호할 수 있음으로써, 소포의 치료 효과가 향상되게 한다. 추가적으로, 본 발명의 제약학적 조성물은 종래 방법에 따르는 적합한 부형제, 보존제, 용매 또는 희석제를 함유할 수 있다.
예시적인 부형제로는, 한정하는 것은 아니지만, 판테놀, 글리콜, 이를테면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 검, 이를테면 구아 검, 당, 이를테면 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 붕산 및 보레이트, 이를테면 사붕산 나트륨, 글리세롤, 글리세린, 알란토인, 프로타민, 소르비톨 카보머 또는 나트륨 카보머, 트라이에탄올아민, 우레아, 이를테면 이미다졸리디닐 우레아, 알긴산염, EDTA, 벤조산 나트륨, 인산 칼슘 및 규산 칼슘, 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 스테아르산 마그네슘, 트윈, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 식물 추출물, 이를테면 알로에 바르바덴시스(Aloe Barbadensis) 잎 주스를 들 수 있다.
예시적인 보존제로는, 한정하는 것은 아니지만, 파라벤, 이를테면 에틸 파라벤, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, DMEM 히단토인(DMDM hydantoin), 이미다졸리디닐 우레아, 및 글루타르알데하이드를 포함한 포름알데하이드 공여자(donor), 페놀 유도체, 벤조산(benzoic acid), 벤질 알코올을 들 수 있다. 적합한 용매 또는 희석제로는, 한정하는 것은 아니지만, 정제수, 에탄올 및 벤질 알코올을 들 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 또한 계면활성제, 보습제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이트화제, 완충제, 저급 알코올, 향료, pH 조절제 등을 포함할 수 있다. 이들 분자는 천연 형태로 또는 화학적으로 변형되어 사용될 수 있다. 그러한 구성요소는 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 제약학적 조성물은 병변의 봉합을 촉진하는 데 있어 제약학적 조성물의 효능을 개선하기 위하여 항생제, 항박테리아제 및 항진균제로부터 선택된 하나 이상의 항미생물제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 항생제, 항진균제 및 항박테리아제에는, 한정하는 것은 아니지만, 이온화된 은(Ag+), 이를테면 산화 은, 질화 은, 황화 은, 은 염, 은 제올라이트, 은 설파다이아진(SSD, silver sulfadiazine), 및 은 나노입자(AgNP), 포비돈 요오드, 카덱사머 요오드, 클로르헥시딘 글루코네이트, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, 이를테면 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 페니실린, 이를테면 아목시실린, 다이클록사실린, 세팔로스포린, 이를테면 세팔렉신, 린코사미드, 이를테면 클린다마이신, 테트라사이클린, 이를테면 독시사이클린, EDTA, 트라이메토프림-설파메톡사졸, 스트렙토마이신, 클린다마이신 및 니트로푸라존 및 젠타마이신이 포함된다. 이들 분자는 천연 형태로 또는 화학적으로 변형되어 사용될 수 있다. 그러한 구성요소는 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
상처 봉합을 촉진하는 효능을 개선하기 위하여, 본 발명의 제약학적 조성물은 추가적으로 항염증제를 포함할 수 있다. 적합한 항염증제에는, 한정하는 것은 아니지만, 코르티손, 하이드로코르티손 및 프레드니손과 같은 스테로이드 항염증제, 및 이부프로펜, 나프록센, 다이클로페낙, 살리실산, 인도메타신을 포함한 비스테로이드 항염증제가 포함된다. 그러한 구성요소는 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
추가적으로, 제약학적 조성물은 치료 효과를 개선하기 위하여 성장 인자(growth factor) 및 재생 촉진제(pro-regenerative agent)를 함유할 수 있다. 적합한 성장 인자 및 재생 촉진제에는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 및 섬유모세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)가 포함된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 상처의 pH를 낮추고, 알칼리증을 예방하고, 감염을 예방하며, 상처 봉합을 촉진하기 위해 3.5 내지 7.0, 보다 바람직하게는 4.0 내지 5.0으로 구성된 산성 pH를 가진다.
본 발명의 제약학적 조성물은 표적 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 피부 및 외부 점막 복구의 경우, 제약학적 조성물은 국소적으로 또는 국소 주사에 의해 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우, 제약학적 조성물은 겔, 연고, 크림, 또는 고약으로 제제화될 수 있다. 바람직하게, 제약학적 조성물은 누출 없이 상처에 대한 부착력을 개선하기 위하여 부드러운 점성 텍스처를 가진다.
EV-하이드로겔 전달을 용이하게 하고 시간 경과에 따른 EV 방출을 제어하기 위하여, 제약학적 조성물은 의료 장치, 예컨대 패치, 수술용 실, 거즈와 조합될 수 있다.
투여 용량 및 EV 방출의 속도 및 기간은 다양한 요인, 예컨대 치료될 병태, 환자의 특징 및 병변(들)의 크기에 따라 결정되며, 기술분야에 숙련된 지식을 가진 사람에 의해 그/그녀의 일반적인 지식을 사용함으로써 결정될 수 있다.
바람직하게, 하이드로겔 매트릭스로부터 오렌지 유래 EV의 방출은 적어도 1일(24시간)의 기간 동안, 예를 들어 적어도 2일(48시간), 적어도 3일(72시간), 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일 또는 적어도 8일의 기간 동안 수행된다.
제약학적 조성물이 국소적으로 투여되는 경우, 바람직하게는 상처 표면을 완전히 덮도록 분포되어야 하고, 선택적으로 상처를 깨끗하게 유지하기 위하여 이차 드레싱으로 덮여야 한다.
제약학적 조성물은 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서, 바람직하게는 플라스틱 또는 알루미늄 튜브에 포장될 수 있다. 그러한 튜브는 상처 기저부에 젤의 분배를 허용하는 작은 분출구(spout)가 제공될 수 있다. 제약학적 조성물은 세포 및/또는 조직 복구를 향상시키기 위해 의도된다.
다음의 실시예에서 상세하게 예시되는 바, 본 발명의 제약학적 조성물은 오렌지 유래 혈관신생 촉진 EV 및 하이드로겔의 치료 효과를 조합하여, 놀랍게도 손상된 조직에서 개선된 시너지 재생 효과를 달성한다. 더욱이, 본 발명의 제약학적 조성물은 EV의 병변 부위로의 국소 효율적이고 시간 제어된 방출뿐만 아니라 EV의 안정화 및 보관을 보장한다.
이들 특징은 본 발명의 제약학적 조성물을 피부 및 점막과 같은 손상된 조직의 여러 종류의 병변, 특히 궤양, 피부염, 각막 손상, 눈 질환, 점막 병변 및 감염성 병변의 치료적 치료에 특히 적합하게 만든다. 본 발명은 특히 손상된 조직이 손상된 혈관신생을 나타내거나 혈관신생 촉진이 손상된 조직의 재생을 가속화할 때, 손상된 조직 및 세포 복구에 대한 재생 효과를 촉진하는 치료적 국소 치료제로서 하이드로겔과 조합된 오렌지 유래 EV의 적용 가능성을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 피부, 점막 또는 연조직 병변의 봉합을 위한, 예를 들어 피부 상처의 봉합을 위한 재생 치료 방법에 사용된다.
손상된 조직이 손상된 혈관신생을 보이는 질환 및 병태에는, 한정하는 것은 아니지만, 허혈성 궤양, 예컨대 압력 궤양, 동맥 궤양, 정맥 궤양, 당뇨병성 궤양, 허혈성 궤양, 삼출성 궤양, 대사 이상성 궤양, 외상성 궤양, 및 당뇨병성 병변과 같은 점막 병변이 포함된다.
손상된 조직의 혈관신생의 촉진이 조직 재생을 가속화하는 질환 및 병태에는, 한정하는 것은 아니지만, 화상, 누공, 건선, 각화증, 각막염, 열구, 외상성 궤양, 점막 병변(예컨대 보철물로 인한 외상성 병변 등, 구강 욕창, 생식기 점막 병변), 피부염(여드름, 습진, 지루성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 이한증성 습진, 신경피부염, 포진성 피부염 포함), 전암성 병변(예컨대 광선 각화증)을 치료할 목적의 세포자멸사 촉진제에 의해 유도된 세포 손상이 포함된다.
본 발명의 범주 내에는 또한 위에서 정의된 제약학적 조성물의 제조 방법이 있다. 본 발명에 따르면, 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 중합체 겔화제를 미리 결정된 양의 물에 용해시켜서 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계로서, 여기서 미리 결정된 양의 물은 제약학적 조성물의 총 중량의 적어도 10 중량%를 나타내는 것인 단계;
(ii) 상기 정의된 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 단계 (i)에서 얻어진 하이드로겔 매트릭스에 첨가하는 단계; 및
(iii) 상기 오렌지 유래 EV를 하이드로겔 매트릭스와 혼합함으로써, 상기 EV가 하이드로겔 매트릭스에 분산되는 하이드로겔의 형태로 제약학적 조성물을 얻는 단계.
본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 적합한 중합체 겔화제는 제약학적 조성물과 관련하여 위에서 기술된 것과 같다.
바람직하게, 중합체 겔화제는 미리 결정된 양의 물에 물의 총 부피에 대해 1 내지 100 mg/ml의 범위, 보다 바람직하게는 물의 총 부피에 대해 2 내지 50 mg/ml의 범위 내에 포함된 농도로 용해된다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 (ii)에서 오렌지 유래 EV와 하이드로겔 매트릭스의 혼합은 볼텍싱에 의해, 바람직하게는 적어도 30초의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 혼합 후에, 하이드로겔 매트릭스에 분산된 오렌지 유래 EV를 함유하는 조성물을 37℃에서 5 내지 10분의 범위의 시간 동안 유지하는 단계 (iv)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 한 구현예에서, 단계 (i)에서 중합체 겔화제는 물에서 37℃에서 적어도 30분 동안 기계적으로 교반되어 상기 중합체 겔화제의 전반적인 용해가 얻어진다.
또 다른 구현예에서, 하이드로겔 및 오렌지 유래 EV는 혼합 전에 37℃에서 적어도 10분 동안 유지된다.
여전히 또 다른 구현예에서, 단계 (iii)의 혼합 후에, 얻어진 조성물은 37℃에서 적어도 10분 동안 유지된다.
다음의 실험 단락은 순수하게 예시에 의해 제공되며 첨부된 청구범위에서 정의된 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 다음의 실험 단락에서, 첨부된 도면을 참조한다:
도 1은 실험예 1에서 오렌지 유래 EV의 특성화를 도시한다. (A) 나노사이트(NanoSight) 분석 및 투과 전자 현미경 사진의 대표적인 이미지((B) 원래 배율에서 x60,000, 스케일 바 500 nm, 및 (E) x150,000, 스케일 바 200 nm)는 오렌지 유래 EV에 전형적인 직경의 크기를 나타냈다. 막대 그래프(C)는 오렌지 유래 EV의 여러 조제물에 대해 측정된 바, 109 EV의 단백질의 나노그램(ng)으로 표시된 EV의 평균 단백질 함량, 및 (D)는 1010 EV의 나노그램(ng)으로 표시된 RNA 함량을 나타낸다.
도 2는 실험예 2에서 상이한 하이드로겔로부터의 오렌지 유래 EV의 방출을 도시한다. 하이드로겔(카르복시메틸셀룰로스 및 콜라겐)로부터 EV의 방출은 EV의 수(카르복시메틸셀룰로스에 대해 A, 콜라겐에 대해 C) 및 시간 경과에 따라 방출된 단백질 양(카르복시메틸셀룰로스에 대해 B, 콜라겐에 대해 D)으로서 평가되었다. 실험을 수행하기 위하여, 하이드로겔 또는 하이드로겔 및 상이한 용량의 EV(108, 109 및 1010 EV)를 포함하는 제약학적 조성물이 식염수 용액과 직접 접촉하는 24 웰 플레이트에 유지되었다. 식염수 용액은 시간 0(0) 및 30분(30 min), 1시간(1h), 3시간(3h), 6시간(6h), 24시간(24h), 48시간(48h), 72시간(72h) 후 EV의 존재에 대해 분석되었다. EV 및 단백질은 각 시점에서 식염수 용액에서 각각 나노사이트 기구 및 BCA 키트를 사용하여 정량화되었다. 하이드로겔에 의해 방출된 EV의 양은 EV/ml 수치로 표시된 반면, 방출된 단백질의 양은 μg/ml로 표시되었다. 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다.
도 3은 실험예 3에서 표적 세포에서 제약학적 조성물의 오렌지 유래 EV의 혼입을 도시한다. HMEC 표적 세포가 형광 표지된 EV(형광색소(fluorochrome) PKH26) 및 하이드로겔(카르복시메틸셀룰로스, 콜라겐, 에틸셀룰로스, 키토산, 젤라틴, PEG)의 혼합물로 처리되었다. 표적 세포에서 EV 흡수가 상이한 시점: 6시간(6h), 24시간(24h), 48시간(48h) 및 72시간(72h)에 세포형광측정법(Citofluorimetry)에 의해 측정되었다. EV 흡수는 표적 세포 단독(음성 대조군, CTR-)에 비교된 신호 강도의 백분율로서 나타난다. 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 내피 세포. 108, 109 또는 1010 EV: 하이드로겔이 있거나 없이 사용된 오렌지 유래 EV의 용량. 통계적 유의성은 EV 단독 또는 하이드로겔과 조합된 EV의 베지클 흡수를 비교하여 계산되었다. p: *** < 0.005; **** <0.001.
도 4는 실험예 4에서 시험관내에서 내피 세포에 대한 혈관신생을 촉진하는 본 발명의 제약학적 조성물의 능력을 도시한다. 튜브 형성 검정(tube formation assay)은 내피 세포를 오렌지 유래 EV 단독 또는 하이드로겔 단독 또는 EV와 하이드로겔의 조합으로 24, 48 및 72시간 동안 자극함으로써 수행되었다. 히스토그램은 위에서 기술된 것과 같이 수행된 자극시에 마트리겔(Matrigel)에서 형성된 튜브 구조의 총 길이를 보여준다(평균 ± SEM). 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 내피 세포. CTR+: 소 태아 혈청 및 성장 인자가 보충된 배지. EV: 109 오렌지 유래 EV. H1: 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔 단독. H1+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔. H2: 콜라겐 하이드로겔 단독. H2+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 콜라겐 하이드로겔. 통계적 유의성은 각각의 조건을 모든 다른 조건과 비교하여 계산되었다. p: **** <0.0001 대비 CTR-; # <0.0001 대비 H1; § <0.0001 대비 H2; α < 0.05 대비 EV.
도 5는 실험예 4에서 시험관내에서 내피 세포 이동을 촉진하는 본 발명의 제약학적 조성물의 능력을 도시한다. 스크래치 테스트 검정은 내피 세포를 오렌지 유래 EV 단독 또는 하이드로겔 단독 또는 EV와 하이드로겔의 조합으로 24, 48 및 72시간 동안 자극함으로써 수행되었다. 히스토그램은 위에서 기술된 것과 같이 수행된 자극시에 상처 봉합의 백분율(평균 ± SEM)을 보여준다. 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 내피 세포. CTR+: 소 태아 혈청 및 성장 인자가 보충된 배지. EV: 109 오렌지 유래 EV. H1: 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔 단독. H1+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔. H2: 콜라겐 하이드로겔 단독. H2+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 콜라겐 하이드로겔. 통계적 유의성은 각각의 조건을 모든 다른 조건과 비교하여 계산되었다. p: **** <0.0001 대비 CTR-; ** <0.01 대비 CTR-; * <0.05 대비 CTR-; # <0.0001 대비 H1; § <0.0001 대비 H2; α < 0.05 대비 EV.
도 6은 실험예 4에서 시험관내에서 섬유모세포 이동을 촉진하는 본 발명의 제약학적 조성물의 능력을 도시한다. 스크래치 테스트 검정은 섬유모세포를 오렌지 유래 EV 단독 또는 하이드로겔 단독 또는 EV와 하이드로겔의 조합으로 24, 48 및 72시간 동안 자극함으로써 수행되었다. 히스토그램은 위에서 기술된 것과 같이 수행된 자극시에 상처 봉합의 백분율(평균 ± SEM)을 보여준다. 각 데이터 세트에 대해 N=4회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 섬유모세포. CTR+: 10% 소 태아 혈청으로 보충된 배지. EV: 109 오렌지 유래 EV. H1: 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔 단독. H1+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔. H2: 콜라겐 하이드로겔 단독. H2+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 콜라겐 하이드로겔. 통계적 유의성은 각각의 조건을 모든 다른 조건과 비교하여 계산되었다. p: **** <0.0001 대비 CTR-; *** <0.001 대비 CTR-; # <0.0001 대비 H1; § <0.0001 대비 H2; α < 0.05 대비 EV.
도 7은 실험예 4에서 시험관내에서 상이한 유형의 하이드로겔의 내피 세포 및 섬유모세포에 대한 독성의 부재를 도시한다. 내피 세포 및 섬유모세포는 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔(H1) 또는 콜라겐 하이드로겔(H2)로 자극되었고 독성은, 음성 대조군에 비교하여, BrdU 증식 검정에 의해 평가된 증식 속도의 감소로서 측정되었다. 그래프는 섬유모세포(상부-좌측) 및 내피 세포(상부-우측)에 대한 증식 백분율(평균 ± SEM)을 보여준다. 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 세포. CTR+: 섬유모세포에 대해 10%의 소 태아 혈청이 보충된 배지, 또는 내피 세포에 대해 소 태아 혈청 및 성장 인자가 보충된 배지(Endogro). H1: 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔 단독. H2: 콜라겐 하이드로겔 단독. 통계적 유의성은 각 조건을 CTR-과 비교하여 계산되었다. p: **** <0.0001; ** <0.01.
더욱이, 도 7은 실험예 4에서 시험관내에서 내피 세포 증식을 촉진하는 능력을 도시한다. 내피 세포는 오렌지 유래 EV 단독 또는 하이드로겔 단독, 또는 EV와 하이드로겔의 조합으로 24, 48 및 72시간 동안 자극되었다. 도면의 하부 부분의 그래프는 위에서 기술된 것과 같이 24시간 동안 수행된 자극시에 백분율(평균 ± SEM)로서 표시된 내피 세포 증식을 나타낸다. 각 데이터 세트에 대해 N=3회 실험이 수행되었다. CTR-: 비자극 세포. CTR+: 섬유모세포에 대해 10%의 소 태아 혈청이 보충된 배지, 또는 내피 세포에 대해 소 태아 혈청 및 성장 인자가 보충된 배지(Endogro). EV: 109 오렌지 유래 EV. H1: 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔 단독. H1+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔. H2: 콜라겐 하이드로겔 단독. H2+EV: 109 오렌지 유래 EV가 있는 콜라겐 하이드로겔. 통계적 유의성은 각각의 조건을 모든 다른 조건과 비교하여 계산되었다. p: *** <0.001 대비 CTR-; # <0.05 대비 H1; § <0.001 대비 H2; α < 0.05 대비 EV.
도 8은 본 발명의 제약학적 조성물이 실험예 5에서 궤양의 생체내 모델에서 조직 재생을 가속화하는 것을 도시한다. 궤양은 마우스에서 유도되었고 카르복시메틸셀룰로스(H1), 109 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스(H1+EV), 키토산(H2), 109 EV가 있는 키토산(H2+EV)으로 치료되었다. 대조군으로서, 미치료 궤양이 사용되었다(CTR-). 상처 영역, 즉 상처가 여전히 개방된 영역이 치료 후 6일 후에 측정되고, 시간 0의 원래 상처 영역과 비교하여 백분율로서 기록된다. 치료된 상처의 대표적인 이미지는 그래프 아래에 도시된다. 각 데이터 세트에 대해 N=5마리 동물이 사용되었다. CTR-: 미치료 상처. 통계적 유의성은 상이한 치료의 효과를 미치료 그룹(CTR-)과 비교하여 계산되었다: p: * < 0.05; **** <0.001. 통계적 유의성은 각 하이드로겔의 효과를 EV가 있는 동일한 것과 비교함으로써 계산되었다(H1 대비 H1+EV, 또는 H2 대비 H2+EV): p: $<0.05.
도 9는 본 발명의 제약학적 조성물이 실험예 5에서 궤양의 당뇨병 생체내 모델에서 조직 재생을 가속화하는 것을 도시한다. 궤양은 마우스에서 유도되었고 카르복시메틸셀룰로스(하이드로겔), 109 EV가 있는 카르복시메틸셀룰로스(하이드로겔+EV)로 치료되었다. 대조군으로서, 미치료 궤양이 사용되었다(CTR-). (A) 상처 영역, 즉 상처가 여전히 개방된 영역은 치료 후 3, 6, 10 및 14일 후에 측정되고, 시간 0의 원래 상처 영역과 비교하여 백분율로서 기록된다. 각 데이터 세트에 대해 N=5마리 동물이 사용되었다. CTR-: 미치료 상처. 통계적 유의성은 상이한 치료의 효과를 비교하여 계산되었다: p: * < 0.05; ** < 0.01; ***< 0.005; **** <0.001. (B, C, D) 치료 후 14일 후의 상처 조직의 조직학적 분석의 결과. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 (B) 상처 크기(μm)로서 의도된 상처 폭, (C) 원래의 상처 크기에 비교하여 상처의 새롭게 형성된 상피세포의 백분율로서 재상피화의 백분율, (D) 상처의 상피 두께(μm)가 측정되었다. 하이드로겔과 EV의 조합으로의 치료는 하이드로겔 단독(하이드로겔) 및 미치료 상처(CTR-)와 비교되었다. 각 데이터 세트에 대해 N=5마리 동물이 사용되었다. CTR-: 미처리 상처. 통계적 유의성은 상이한 치료의 효과를 비교하여 계산되었다: p: ***< 0.005; **** <0.001.
물질 및 방법
세포외 소포 분리
세포외 소포는 오렌지 주스로부터 분리되었다. 시트러스 시넨시스 식물의 과일이 압착되고 섬유질을 제거하기 위해 기공의 내림차순을 사용하여 주스가 순차적으로 여과되었다. 그런 후 EV는 분별 초원심분리(differential ultracentrifugation ) 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)로 정제되었다. 분별 초원심분리의 경우, 주스가 1,500 g에서 30분 동안 원심분리되어 파편 및 다른 오염물이 제거되었다. 그런 후, EV는 10,000 g에서 제1 초원심분리된 후 100,000 g에서 1시간 동안 4℃에서 초원심분리됨으로써 정제되었다(Beckman Coulter Optima L-90K, Fullerton, CA, USA). 최종 펠릿은 1% DMSO가 첨가된 인산염 완충 식염수로 재현탁되고 0.22 마이크로미터 필터로 여과되어 멸균되었다.
세포외 소포는 사용되거나 -80℃에서 장기간 보관되었다. 접선 유동 여과의 경우, 처음에 주스는 섬유질 및 파편을 배제하기 위해 깊이 필터 시트 디스크 (depth filter sheet discs) Supracap 50(Pall)을 사용한 여과에 의해 정화되었다. 그런 후, 여과된 주스는 접선 유동 여과 카세트 TFF Omega(Pall Cadence)를 사용하여 농축 및 투석여과에 의해 정제되었다. 마지막으로, 접선 유동 여과로부터의 보전물(retentate)은 0.2 nm 필터로 여과함으로써 살균되었다.
나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)
EV 치수를 직경 및 프로파일로 정의하기 위해 450 nm 레이저 및 NTA 3.1 분석 소프트웨어가 장착된 NanoSight LM10 시스템(NanoSight Ltd., Amesbury, UK)을 사용하여 나노입자 추적 분석(NTA)이 사용되었다. 레이저 광원에 적용된 샘플에 존재하는 EV의 브라운 운동이 카메라에 의해 기록되고 NTA에 의해 스톡스-아인슈타인(Stokes-Einstein) 방정식을 통해 크기 및 농도 매개변수로 전환되었다. 카메라 수준은 16에서 모든 획득에 대한 것이었고 각 샘플에 대해 30초 길이의 5개 비디오가 기록되었다. 간단히 설명하면, 정제된 EV는 1 ml 무베지클 (vesicle-free) 식염수 용액(Fresenius Kabi, Runcorn, UK)에서 1:2000으로 희석되었다. NTA 획득 후 세팅은 최적화되어 모든 샘플 중에서 일정하게 유지되었고, 각 비디오는 그런 후에 분석되어 EV 평균, 모드 및 농도가 측정되었다.
투과 전자 현미경검사(TEM)
EV의 투과 전자 현미경검사는 200 메시 니켈 포름바르(formvar) 탄소 코팅 그리드(Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) 상에 EV를 20분 동안 로딩함으로써 수행되었다. 그런 후 EV는 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 수크로스를 함유한 용액으로 고정되었고 증류수에서 반복 세척된 후, 샘플은 NanoVan(나노프로브, Yaphank, NK, USA)으로 음성 염색되고 Jeol JEM 1010 전자 현미경에 의해 조사되었다.
단백질 추출 및 정량화
단백질은 EV로부터 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)의 칵테일로 보충된 RIPA 완충액(150 nM NaCl, 20 nM Tris-HCl, 0.1% 도데실 황산 나트륨, 1% 데옥시콜레이트, 1% Triton X-100, pH 7.8)에 의해 추출되었다. 단백질 함량은 BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)에 의해 제조사의 프로토콜을 따라 정량화되었다. 간단하게 설명하면, 10 μl의 샘플이 96 웰 플레이트의 웰에 분배되고 총 단백질 농도가 소 혈청 알부민(BSA)으로 확립된 선형 표준 곡선을 사용하여 측정되었다.
RNA 추출 및 정량화
총 RNA가 miRNeasy 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 따라 EV 및 세포로부터 분리되었다. 샘플의 RNA 농도는 분광광도계(mySPEC, VWR, Radnor, PA, USA)를 사용하여 정량화되었다.
하이드로겔 준비
하이드로겔은 물 또는 식염수 용액에서 하이드로겔에 재현탁됨으로써 제조되었다. 사용된 하이드로겔에는 카르복시메틸셀룰로스, 콜라겐, 에틸셀룰로스, 키토산, 젤라틴 및 PEG(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)가 포함되었다. 광범위한 혼합 후에 하이드로겔은 필터 0.22 μm로 여과함으로써 멸균되었고 사용할 준비가 되었다. 하이드로겔을 오렌지 유래 EV와 조합하기 위하여, 하이드로겔은 상이한 용량의 EV(108, 109, 1010 EV)와 혼합되었다.
세포 배양
인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)는 일차 인간 피부 미세혈관 내피 세포를 유인원 바이러스 40으로 불멸화함으로써 얻어졌다. HMEC는 불렛 키트 및 1 ml Mycozap CL(Lonza)이 보충된 내피 기저 배지(Endothelial Basal Medium)(EBM, Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양되었다. 정상인 피부 섬유모세포(Normal Human Dermal Fibroblasts, NHDF)는 일차 성인 섬유모세포(Lonza)이다. NHDF는 불렛 키트 및 1 ml Mycozap PR(Lonza)이 보충된 FGM-2 성장 배지(Lonza)에서 배양되었다.
세포외 소포 흡수
오렌지 유래 EV의 세포에의 흡수를 평가하기 위하여, EV는 PKH-26 염료(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)로 30분 동안 37℃에서 표지되고 초원심분리에 의해 100,000 g에서 2시간 동안 4℃에서 10 mL 폴리카보네이트 튜브를 사용하여(SW 90 Ti 로터, Beckman Coulter Optima L-90 K 초원심분리) 세척되었다. 흡수 실험에 대해, 25,000 HMEC 세포/웰이 24 웰 플레이트에 플레이팅되고 식염수(CTR-), 하이드로겔 또는 하이드로겔과 EV의 조합을 함유한 0.4 μm의 기공을 가진 트랜스웰로 배양되었다. 각 시점(6, 24, 48 및 72시간) 후에 트랜스웰은 제거되었고, 세포는 광범위하게 세척되고, 트립신으로 탈착되고 형광이 FACS에 의해 CytExpert 소프트웨어가 있는 CytoFLEX 유세포 분석기(Beckman Coulter Optima L-90K, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 측정되었다.
시험관내 튜브 형성 검정
튜브 또는 모세관 유사 구조의 시험관내 형성이 24 웰 플레이트에서 성장 인자 감소 마트리겔(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) 상에서 연구되었다. HMEC(25,000 세포/웰)가 DMEM 단독(미치료 대조군) 또는 EndoGRO MV-VEGF 배지(양성 대조군)에서, 또는 DMEM에서 하이드로겔 단독 또는 하이드로겔 함유 EV(용량 109 EV)의 존재 하에 마트리겔 코팅 웰 상에 시딩되었다. 각각의 조건은 세 번 반복수행되었다. 24시간 동안 인큐베이션 후에, 5개의 랜덤 필드 위상차 이미지(배율, ×10)가 각 웰에 대해 기록되었다. 튜브 구조의 네트워크의 총 길이가 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었다. 결과는 각 조건당 총 길이의 평균으로서 표시된다. 테스트는 24, 48 및 72시간에 수집된 적응용 배지(conditioned medium)로 반복되었다.
시험관내 스크래치 테스트 검정
내피 세포(HMEC) 및 섬유모세포(NHDF)가 적절한 배양 배지의 24 웰 플레이트에 ~50x103 세포/웰의 밀도로 시딩되었다. 세포가 완전 컨플루언스(confluence)에 도달되었을 때, 상처를 모방하기 위해 멸균 팁으로 스크래치가 생성되었다. 자극 전(t=0)에, 웰의 현미경 사진이 Leica 카메라(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 얻어졌다. 그런 후 세포는 DMEM 단독(음성 대조군)으로, 또는 양성 대조군으로서 HMEC의 경우 Endogro(Lonza)로 또는 NHDF의 경우 10% FBS가 있는 DMEM으로 또는 EV(용량 109 EV)를 함유한 DMEM 또는 하이드로겔 단독 또는 하이드로겔 함유 EV(용량 109 EV)의 존재 하에 DMEM으로 자극되었다. '상처 봉합' 현상은 24시간 동안 모니터링되었고, Leica 카메라를 사용하여 사진이 촬영되었다. 이미지는 상처 영역을 측정하는 ImageJ 소프트웨어(Bethesda, MD, USA)에 의해 분석되었다. 결과는 t0에서 상처 영역을 100%로서 간주하고 24시간 째에 세포가 차지한 상응하는 영역을 계산하여 상처 봉합의 백분율로서 표시된다. 테스트는 24, 48 및 72시간에 수집된 적응용 배지로 반복되었다.
시험관내 증식 검정
내피 세포(HMEC) 및 섬유모세포(NHDF)는 96 웰 플레이트에 2,000개 세포/웰의 밀도로 시딩되어 부착되도록 방치되었다. 배양 배지는 DMEM으로 대체되어 밤새 방치되었다. 그런 후, 세포는 DMEM 단독(음성 대조군)으로, 또는 양성 대조군으로서 HMEC의 경우 Endogro(Lonza)로 또는 NHDF의 경우 10% FBS가 있는 DMEM으로 또는 하이드로겔 단독 또는 하이드로겔 함유 EV(용량 109 EV)의 존재 하에 DMEM으로 72시간 동안 자극되었다. 각각의 조건은 사 회 반복수행되었다. 그런 후 10 μl의 BrdU 표지화 용액(BrdU 열량측정 검정, Roche)이 각 웰에 첨가되고 플레이트는 밤새 인큐베이션되었다. 자극의 효과는 24시간 인큐베이션 후에 분석되었다. 검정의 전개는 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 흡광도는 ELISA 판독기에 의해 370 nm에서 측정되었다. 각 조건에 대한 평균 흡광도가 계산되었다. 흡광도는 증식 속도에 정비례한다. 모든 평균 흡광도는 참조 샘플로서 사용된 미치료 대조군(CTR-)의 평균에 대해 표준화되었다. 결과는, 1에 상응하는, 음성 대조군과 비교하여 상대적인 증식 속도로 나타낸다.
생체내 실험
생후 9주령의 정상 수컷(BALB) 또는 당뇨병 NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS) 수컷 마우스가 마취되고 등쪽 피부 털이 전기 면도기에 의해 제거되었다. 당뇨병은 4일 동안 스트렙토조토신(40 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS) 마우스에서 유도되었고 동물은 > 200의 당혈증(glycemia)으로 측정된 당뇨병의 약 20일 후에 치료되었다. 4개의 6 mm 직경 전체 두께 피부 상처가 일회용 생검 펀치(disposable Biopsy Punch, PMD Medical)를 사용하여 중앙선의 양 측면에 생성되었다. 각 동물은 각 상처에 대해 상이한 치료를 받았다. 상처를 입은 날을 0일로 계산하였다. 동물은 상이한 시점(정상 마우스에 대해 0, 3, 6일; 및 당뇨병 마우스에 대해 0, 3, 6, 10, 및 14일)에 상처 측정에 의해 모니터링되었다. 매번, 상처는 새로운 치료를 적용받았다. 마지막 시점에서, 마우스는 희생되었고 등 피부 상처는 조직학적 분석을 위해 수집되었다. 조직학적 분석은 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 수행되었고 Imagej 소프트웨어를 사용하여 상처 폭, 상처에서 새롭게 형성된 상피의 백분율로서 재상피화 백분율, 상처의 상피 두께를 측정하기 위해 사용되었다.
통계적 분석
데이터 분석은 소프트웨어 Graph Pad 8, 데모 버전으로 수행되었다. 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로서 표시된다. 일원 분산 분석(ANOVA)이 사용되어 그룹 간의 통계적 차이가 입증된 한편, 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)가 두 샘플 간 비교에 사용되었다. 본 발명자들은 유의성의 최소 수준으로서 p < 0.05를 사용하였다.
결과/실시예
실시예 1
실험을 위해, 본 발명자들은 오렌지 유래 EV를 사용하였다. EV를 분별 초원심분리 또는 접선 유동 여과에 의해 분리하였다. 두 방법으로 얻어진 EV의 특성화로부터의 결과는 동일하였다. 오렌지 유래 EV는 나노사이트 분석에 의해 25-400 nm 범위의 직경의 크기를 나타냈고, 직경의 평균 크기는 대략 200 nm였다(도 1A). 오렌지 유래 EV는 투과 전자 현미경검사(TEM) 분석에 의해 입증되는 바 전자 밀도 막에 의해 구분되는 둥근 형태를 보였다(도 1B 및 1E). TEM 분석은 EV의 직경의 평균 크기가 대략 200 nm인 것을 확인시켜주었다.
오렌지 유래 EV의 함량을 조사하기 위하여, EV의 단백질 및 RNA 함량을 측정하였다. 단백질 농도는 도 1C에 도시되어 있고 109 EV의 경우 평균 600 ng의 단백질의 이질적인 단백질 함량을 입증한다. RNA 농도는 도 1D에 도시되어 있고 1010 EV의 경우 평균 22 ng의 RNA의 가변적인 RNA 함량을 입증한다.
추가 분석은 오렌지 유래 EV가 소포에 특징적인 단백질, 예컨대 HSP70, HSP80, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, G3PD) 및 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 6(fructose-bisphosphate aldolase 6, FBA6); 및 식물 단백질, 예컨대 파텔린-3-유사(Patellin-3-like) 및 클라트린 중쇄를 함유하는 것을 입증하였다.
더불어, 오렌지 유래 EV의 지질 함량은 24-프로필리덴 콜레스테롤, 베타 시토스테롤, 글리시돌 스테아레이트, 다이팔미틴, 캄페스테롤, 에이코사놀, 에이코산, 헥사데칸, 헥사데칸올, 옥타데칸, 옥타데칸올, 테트라데칸, 테트라데센, 발렌센 및 스테아레이트를 포함한 지질의 운반물을 나타냈다.
실시예 2
본 발명자들은 하이드로겔이 오렌지 유래 EV를 제어된 방식으로 보존하고 방출하는 것을 평가하기 위하여 실험을 수행하였다. 이 목적을 위해, 제약학적 조성물 주변의 미세환경에서 방출된 EV 및 EV 단백질의 양을 시간 경과에 따라 측정하였다(도 2). 간단히 설명하면, 본 발명의 제약학적 조성물을 식염수 용액과 접촉시키고 시간 경과 시점에서 EV의 방출을 식염수 용액에서 측정하였다. 이 분석은 분명하게 카르복시메틸셀룰로스 또는 콜라겐으로 구성된 하이드로겔이 이미 30분 후에 입자로서 EV의 방출을 허용한 것을 입증하였다(도 2 A, C). 더욱이, 단백질의 정량화는 EV가 이미 30분 후에 하이드로겔로부터 방출되는 것을 확인시켜주었다(도 2 B, D). EV 방출은 이미 30분 후에 검출 가능하였고, 시간이 24 내지 48시간으로 경과함에 따라 증가하였으며, 72시간 후에도 여전히 존재하였다. 유사한 데이터를 다른 하이드로겔(에틸셀룰로스, 키토산, 젤라틴, PEG)로도 얻었다. 함께 취합하면, 이들 결과는 모든 하이드로겔이 오렌지 유래 EV를 보존하고 세포 또는 피부 표면과 접촉할 때, 이미 치료 후 30분 후에 시작하여 적어도 최대 3일까지 시간 경과에 따른 제어된 방출을 허용하는 것을 입증하였다.
실시예 3
생물학적 작용을 수행하기 위하여, 오렌지 유래 EV는 하이드로겔에 의해 방출되어야 하고 표적 세포로 유입되어야 한다. 제약학적 조성물에 혼입된 EV의 기능성을 평가하기 위하여, 상이한 시점(6, 24, 48, 및 72시간)에 이들 소포의 표적 세포에 유입(흡수)되는 능력을 분석하기 위한 실험을 수행하였다(도 3). 이 유형의 실험을 위해, 형광색소로 표지된 증가하는 용량의 오렌지 유래 EV(108 EV, 109 EV, 1010 EV)를 제약학적 조성물에 포함시켰다.
조성물을 표적 세포와 접촉시키고 표적 세포(내피 세포)에서 EV 흡수를 유세포분석 분석에 의해 정량화하였다. 흡수율은, 본 발명의 제약학적 조성물을 EV 단독(하이드로겔 없음) 및 표적 세포 단독(음성 대조군, CTR-)과 비교함으로써 평가하였다. 도 3에 도시된 결과는 제약학적 조성물에 포함된 EV 및 EV 단독이 모두 표적 세포에 유입된 것을 입증한다. 흥미롭게도, EV 단독의 흡수는 하이드로겔에 포함된 EV와 비교하여 치료 후 6 및 24시간 후에 상당히 더 높았다. 그러나, 시간 경과 후, 즉 48 및 72시간에, 경향은 반전되었고 EV와 하이드로겔의 조합이 표적 세포에서 상당히 더 높은 흡수를 허용하였다. 이 효과는 시간에 따라 증가하여 72시간째에 최대 피크에 도달하였다. 함께 취합하면 이들 데이터는 하이드로겔이 분해로부터 EV를 보존하고 EV 단독에 비교하여, 이미 24시간 후에, 표적 세포에의 흡수뿐만 아니라 이들 소포의 보다 효율적이고 연장된 방출을 허용할 수 있음을 입증한다. 유사한 데이터를 상이한 하이드로겔(카르복시메틸셀룰로스, 콜라겐, 에틸셀룰로스, 키토산, 젤라틴, PEG)을 사용하여 얻었다.
실시예 4
본 발명의 제약학적 조성물의 치료 잠재력을 조사하기 위하여, 시험관내 기능 테스트를 수행하였다. 특히, 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔을 포함하는 제약학적 조성물의 내피 세포 혈관신생 및 이동, 뿐만 아니라 섬유모세포 이동을 촉진하는 능력을 시험관내에서 테스트하였다.
하이드로겔 및 오렌지 유래 EV를 함유하는 제약학적 조성물을 사용하여 시험관내에서 세포를 24, 48 및 72시간 동안 자극하였다. 여기서 제시된 결과는 두 종류의 하이드로겔, 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔(H1) 및 콜라겐 하이드로겔(H2)을 사용하여 얻어진 것이다. 유사한 결과를 젤라틴, 키토산, PEG 및 에틸셀룰로스를 포함한 다른 유형의 하이드로겔에서 얻었다.
EV 혈관신생 촉진 능력을 튜브 형성 검정에 의해, 내피 세포를 하이드로겔 및 오렌지 유래 EV 또는 하이드로겔 단독 또는 EV 단독을 함유하는 제약학적 조성물이 있는 마트리겔 상에 시딩하고(도 4), 24, 48 및 72시간 동안 인큐베이션하여 테스트하였다. 내피 세포를 오렌지 유래 EV 단독(EV), 하이드로겔 단독(H1, H2)으로, 또는 하이드로겔 및 오렌지 유래 EV를 포함하는 제약학적 조성물(H1+EV, H2+EV)로 자극하였다. 모든 조건을 24, 48, 또는 72시간 동안 EV 방출 후 테스트하였다. 총 튜브 길이에서 상당한 증가를 미치료 대조군(CTR-)과 비교하여 EV 단독(EV)으로, 및 하이드로겔 단독(H1 및 H2)과 비교하여 하이드로겔 및 EV(H1+EV, H2+EV)를 포함하는 조성물로 관찰하였다. 더욱이, 하이드로겔 및 EV(H1+EV, H2+EV)를 포함하는 조성물은 EV 단독(EV) 및 하이드로겔 단독(H1, H2)보다 혈관신생을 촉진하는데 상당히 더 효과적인 것으로 나타났다. 그러한 결과는 각 시점(24, 48 및 72시간)에서 관찰되었다. 이것은 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔을 포함하는 조성물이 내피 세포에서 혈관신생을 촉진하는데 시너지 효과를 가지며 그러한 제약학적 조성물은 이미 치료 후 1일(24시간) 후에 하이드로겔 단독 또는 오렌지 유래 EV 단독보다 상당히 더 효과적인 것을 입증한다. 상기 효과는 치료 후 적어도 3일 동안 유지된다.
본 발명의 제약학적 조성물의 내피 세포 및 섬유모세포 이동에 미치는 효과를 세포 단층에서 스크래치를 수행하고 24시간 후 세포 이동을 측정함으로써 평가하였다. 하이드로겔 및 오렌지 유래 EV를 함유하는 제약학적 조성물을 사용하여 시험관내에서 24, 48 및 72시간 동안 세포를 자극하였다.
제시된 결과는 두 종류의 하이드로겔, 즉 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔(H1) 및 콜라겐 하이드로겔(H2)을 사용하여 얻어진 것이다. 유사한 결과를 젤라틴, 키토산, PEG 및 에틸셀룰로스를 포함하는 다른 유형의 하이드로겔에서 얻었다.
본 발명자들은 또한 세포 이동을 촉진하는데에 효과적이었지만 통계적으로 유의한 더 낮은 정도인 EV 단독(EV), 및 효과적이지 않으며 미치료 대조군과 비슷한 하이드로겔 단독(H1 및 H2)과 비교하여 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔(H1+EV 및 H2+EV)의 조합을 사용하는 내피 세포(도 5) 및 섬유모세포(도 6)의 상당히 더 높은 이동 속도를 관찰하였다. 모든 조건을 24, 48 또는 72시간 동안 EV 방출 후에 두 종류의 세포 모두에 대해 테스트하였다. 실험은 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔이 새로운 혈관의 형성에서뿐만 아니라 내피 세포의 이동을 촉진하는데에 시너지 효과를 가지며 그러한 제약학적 조성물은 치료 후 1일(24시간) 후에 이미 하이드로겔 단독 또는 오렌지 유래 EV 단독보다 상당히 더 효과적인 것을 입증한다. 상기 효과는 치료의 적어도 3일 동안 유지된다(도 5). 실제로, 내피 세포의 이동은 새로운 혈관의 형성(혈관신생)에 기여하며 이 데이터는 본 발명의 제약학적 조성물의 혈관신생 촉진 활성을 지지한다.
유사한 결과를 섬유모세포에 대해 얻었고(도 6), 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔을 포함하는 제약학적 조성물이 또한 병변에 존재하는 다른 세포 유형을 촉진함으로서 치료 효과를 이용하는 것을 입증한다. 실제로, 섬유모세포는 재생 과정에 관여하며 이것의 이동 촉진은 상처 봉합을 가속화하는 것에 기여한다. 본 발명의 제약학적 조성물이 병변 부위의 다중 세포에 작용할 수 있다는 사실은 조직 재생 및 상처 봉합을 가속화하는데 미치는 유익한 효과를 지지한다.
더불어, 내피 세포 및 섬유모세포 상에서 상이한 유형의 하이드로겔의 독성의 부재를 시험관내에서 증식 검정에 의해 평가하였다(도 7). 본 발명자들은 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔(H1) 또는 콜라겐 하이드로겔(H2)이 섬유모세포(도 7, 우측의 상부 패널) 및 내피 세포(도 7, 좌측의 상부 패널)에 영향을 미치지 않으며 증식 속도를 감소시키지 않는 것을 관찰하였다. 유사한 결과를 또한 젤라틴, 키토산, 에틸셀룰로스 및 PEG를 포함한 상이한 유형의 하이드로겔에서 얻었다. 화합물의 독성은 세포 증식의 감소에 의해 나타난다. H1 또는 H2로 자극된 섬유모세포 및 내피 세포의 증식의 백분율은 기본 조건(미자극 대조군, CTR-)과 비슷하다. 이 데이터는 하이드로겔이 독성이 없으며 치료 목적에 대해 오렌지 유래 EV와 조합하여 사용될 수 있음을 입증한다.
더불어, 본 발명자들은 하이드로겔로부터 방출된 오렌지 유래 EV(H1+EV 및 H2+EV)가 오렌지 유래 EV 단독(EV) 또는 하이드로겔 단독(H1 및 H2)과 비교하여 내피 세포의 증식을 상당히 증가시킨 것을 관찰하였다(도 7, 아래 패널). 본 발명의 조성물에서, 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔은 미치료 대조군(CTR-)과 비교하여 내피 세포의 증식을 촉진하는데 시너지 효과를 가지며, 상기 조성물은 하이드로겔 단독 또는 오렌지 유래 EV 단독보다 상당히 더 효과적이다. 제시된 결과는 두 종류의 하이드로겔, 카르복시메틸셀룰로스 하이드로겔(H1) 및 콜라겐 하이드로겔(H2)을 사용함으로써 얻어진다. 유사한 결과를 젤라틴, 키토산 및 에틸셀룰로스를 포함한 다른 유형의 하이드로겔에서 얻었다.
실시예 4에서 예시된 모든 실험은 EV가 하이드로겔로부터 점차적으로 방출될 수 있고 각 시점(24, 48, 및 72시간)에서 그것의 생물학적 효과를 유지할 수 있는 것을 확인시켜준다. 본 발명의 제약학적 조성물은 이미 치료 후 수시간(6시간) 후에 하이드로겔 및 EV 둘 다의 생물학적 활성을 개선시킨다. 상기 효과는 치료의 적어도 3일 동안 유지된다. 실제로, 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔을 함유하는 제약학적 조성물은 이미 치료의 수시간 후에 효과적이며 여러 날 동안 유효성을 유지하고 EV의 수령 세포에의 점진적인 분포를 보장한다.
실험예 4에서 제시된 모든 결과는 오렌지 유래 EV 및 하이드로겔을 포함하는 제약학적 조성물의 치료 활성이 주로 그것의 혈관신생 촉진 활성에 의해 매개되는 것을 입증한다. 실제로, EV와 하이드로겔의 조합은 내피 세포의 증식 및 이동을 촉진하며, 새로운 혈관의 더 높은 형성을 유도한다. 더욱이, EV와 하이드로겔의 조합은 또한 병변 재생에 관여하고 병변에 존재하는 다른 세포 유형, 예컨대 섬유모세포에도 작용한다. 섬유모세포의 이동을 촉진함으로서, EV와 하이드로겔의 조합은 섬유모세포가 병변 부위로 이동하여 콜라겐을 침착시키는 것을 허용하여 상처 봉합을 촉진하는데 기여한다.
실시예 5
제약학적 조성물의 치료 효과를 평가하기 위하여, 상이한 하이드로겔을 오렌지 유래 EV와 조합하고 그것의 활성을 궤양의 생체내 모델에서 테스트하였다(도 8). 궤양을 마우스 모델에서 유도하고 카르복시메틸셀룰로스(H1), 카르복시메틸셀룰로스 및 EV(H1+EV), 키토산(H2), 키토산 및 EV(H2+EV)로 치료하였다. 3일 후 약물치료를 변경하고 치료 효과를 치료의 6일 후에 평가하였다. 효과를 치료 전 0시간의 초기 상처 영역과 비교하여 상처 영역의 백분율로서 측정하였다. 데이터는 두 하이드로겔 단독(카르복시메틸셀룰로스 및 키토산)이 모두 미치료 상처(CTR-)와 비교하여 상처 영역을 약간 감소시킬 수 있었음을 분명하게 입증하였다(도 8). 중요하게, 각각의 하이드로겔과 오렌지 유래 EV의 조합은 그것의 치료 효과를 상당히 증가시켰다(H1+EV 대비 H1, 및 H2+EV 대비 H2). 결과는 하이드로겔 및 오렌지 유래 EV를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효능을 확인시켜준다. 보다 구체적으로, 이 실험은 하이드로겔과 EV의 조합이 하이드로겔 단독보다 상처 봉합을 가속화하는 데 더 효율적인 것을 입증한다. 이런 이유로, 본 발명의 제약학적 조성물은 혈관신생이 유리하고 치료 과정을 가속화하는 여러 종류의 병변, 예컨대 화상, 누공, 건선, 각화증, 각막염, 열구, 외상성 궤양, 점막 병변(예컨대 보철물로 인한 외상성 병변 등, 구강, 욕창, 생식기 점막 병변), 피부염(여드름, 습진, 지루성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 이한증성 습진, 신경피부염, 포진성 피부염 포함), 전암성 병변(예컨대 광선 각화증)을 치료할 목적의 세포자멸사 촉진제에 의해 유도된 세포 손상의 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 제약학적 조성물의 치료 활성을 추가로 분석할 목적으로, 상기 조성물의 재생 효과를 당뇨병성 궤양의 생체내 마우스 모델에서 평가하였다(도 9). 당뇨병성 궤양은, 실제로, 조직 재생 능력을 손상시키는 당뇨병성 병태로 인해 정상 궤양보다 봉합하는 것이 더 어렵다. 상처 영역을 치료 전 시간 0에서의 원래 영역과 관련하여 상처 영역의 백분율로서 표시하였다(도 9A). 당뇨병 마우스에서 상처를 수행하였고 약물치료를 3일마다 변경하였다. 상처 영역 측정을 시간 0 및 3, 6, 10 및 14일 후에 수행하였다. 분석은 본 발명의 제약학적 조성물로의 치료가 각 시점에서 미치료 상처(CTR-) 및 하이드로겔 단독(하이드로겔)에 비교하여 상처 봉합을 가속화하는데 가장 효과적이었음을 분명하게 입증하였다(도 9A).
더욱이, 하이드로겔 및 EV의 조합으로의 치료만이 치료의 3일 후에 이미 상처 영역의 상당한 감소를 유도할 수 있었다(도 9A). 조직의 병리학적 분석은 하이드로겔 단독 및 미치료 상처(CTR-)과 비교하여 본 발명의 조성물의 더 높은 치료 효과를 확인시켜 주었다(도 9 B, C, D). 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 조직 섹션을 사용하여 상처 폭(도 9B), 재상피화의 백분율(도 9C) 및 상피 두께(도 9D)를 측정하였다.
상처 폭은 하이드로겔 단독 또는 미치료 대조군으로의 치료와 비교하여 하이드로겔 및 EV의 조합으로의 치료시 상당히 감소하였다(도 9B).
재상피화의 백분율의 분석은 하이드로겔 및 EV의 조합으로의 치료가 하이드로겔 단독 치료 또는 미치료 대조군과 비교하여 상처에서 새로운 상피의 상당히 더 높은 형성을 유도한 것을 입증하였다(도 9C). 새로운 상피는 상처 봉합에 필수적이다.
마지막으로, 하이드로겔 및 EV의 조합으로의 치료에 적용된 조직 섹션은 하이드로겔 단독 치료 또는 미치료 대조군과 비교하여 더 높은 상피 두께를 나타냈고(도 9D), 재생이 보다 효율적이며 정상적인 더 높은 상피 두께의 복원을 허용한 것을 보여주었다.
함께 취합하면, 모든 데이터는 당뇨병성 궤양의 상처 봉합을 가속화하는데 하이드로겔 단독으로의 치료와 비교하여, 이미 치료의 3일 후에 본 발명의 제약학적 조성물의 더 높은 치료 효과를 확인시켜준다. 이것은 그러한 제약학적 조성물이 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병성 점막 궤양, 대사 이상성 궤양의 경우에서와 같이, 또는 허혈성 궤양, 예컨대 압력 궤양, 동맥 궤양, 정맥 궤양, 허혈성 궤양, 삼출성 궤양, 외상성 궤양, 및 기타 점막 병변을 포함한 허혈성 손상의 존재에서처럼, 자연적인 혈관신생 과정이 상해를 입거나 손상된 여러 종류의 병변의 치료에 특히 유용한 것을 입증한다.

Claims (15)

  1. 조직 복구 및/또는 재생 치료 방법에 사용하기 위한, 하이드로겔 형태의 제약학적 조성물로서,
    (i) 오렌지 유래 세포외 소포(EV);
    (ii) 중합체 겔화제;
    (iii) 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 10 중량%의 양의 물; 및
    (iv) 선택적으로, 제약학적으로 허용 가능한 비히클, 부형제, 및/또는 희석제를 포함하며,
    상기 오렌지 유래 세포외 소포(EV)는 지질 이중층 막에 의해 둘러싸이고 광산란 기반 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 측정되는 10 내지 500 nm의 범위의 직경을 가지고, 혈관신생 촉진 활성을 가지는 것을 특징으로 하며,
    상기 중합체 겔화제 및 물은 오렌지 유래 EV가 분산되는 하이드로겔 매트릭스를 형성하고, 상기 오렌지 유래 EV는 하이드로겔 매트릭스로부터 방출 가능한 것인, 제약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 오렌지 유래 EV는 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis) 종의 하나 이상의 식물 및/또는 상기 하나 이상의 시트러스 시넨시스 식물의 하나 이상의 과일로부터 유래되는 것인 제약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 오렌지 유래 EV의 양은 조성물의 총 부피에 대해 1010 내지 1012 EV/ml의 범위인 것인 제약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 오렌지 유래 EV 단백질의 양은 조성물의 총 부피에 대해 5 μg 내지 500 μg/ml의 범위인 것인 제약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 오렌지 유래 EV의 단백질 함량은 1 내지 1 x103 ng/109 EV의 범위인 것인 제약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 오렌지 유래 EV의 RNA 함량은 10 내지 60 ng/1010 EV의 범위인 것인 제약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 겔화제는, 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 셀룰로스 검, 콜라겐, 가수분해된 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 히알루론산(HA), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리황화 글리코사미노글리칸(PSGAG), 글리세린, 프로필렌 글리콜, 알긴산 칼슘, 및 이것들의 임의의 조합을 포함하는 셀룰로스 및 셀룰로스 기반 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제, 항박테리아제, 항진균제, 항염증제, 성장 인자, 재생 촉진제, 및 이것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료제를 추가로 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 3.5 내지 7.0의 pH로 구성된 pH를 가지는 것인 제약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 병변의 봉합을 위한 재생 치료 방법에 사용하기 위한 것인 제약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 궤양, 예컨대 압력 궤양, 동맥 궤양, 정맥 궤양, 당뇨병성 궤양, 허혈성 궤양, 삼출성 궤양, 대사 이상성 궤양, 외상성 궤양, 당뇨병성 병변과 같은 점막 병변, 화상, 누공, 건선, 각화증, 각막염, 열구, 외상성 궤양, 보철물로 인한 외상성 병변 및 구강, 욕창, 생식기 점막 병변을 포함한 점막 병변, 여드름, 습진, 지루성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 이한증성 습진, 신경피부염, 포진성 피부염을 포함한 피부염, 및 광선 각화증을 포함한 전암성 병변을 치료할 목적의 세포자멸사 촉진 약물에 의해 유도된 세포 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료적 치료에 사용하기 위한 것인 제약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 투여에 또는 주사에 의한 투여에 적합한 것인 제약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 치료는 적어도 1일의 기간 동안 하이드로겔 매트릭스로부터의 오렌지 유래 EV의 방출을 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 하이드로겔 매트릭스로부터 오렌지 유래 EV의 방출은 적어도 7일의 기간 동안 수행되는 것인 제약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 제약학적 조성물의 제조 방법으로서,
    (i) 중합체 겔화제를 미리 결정된 양의 물에 용해시켜서 하이드로겔 매트릭스를 얻는 단계로서, 상기 미리 결정된 양의 물은 제약학적 조성물의 총 중량의 적어도 10 중량%를 나타내는 것인 단계;
    (ii) 제1, 2, 3, 4, 5 또는 6항 중 어느 한 항에서 정의된 오렌지 유래 세포외 소포(EV)를 단계 (i)에서 얻어진 하이드로겔 매트릭스에 첨가하는 단계; 및
    (iii) 상기 오렌지 유래 EV를 하이드로겔 매트릭스와 혼합함으로써, 상기 EV가 하이드로겔 매트릭스에 분산되는 하이드로겔의 형태로 제약학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는 제약학적 조성물의 제조 방법.
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