CN108575985A - 一种胎盘超低温冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胎盘超低温冷冻保存方法，包括以下操作步骤：（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗，将其剪成组织块；（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡；（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存。本发明提供的一种胎盘超低温冷冻保存方法，在保存的过程中，对胎盘组织细胞的伤害较小，胎盘组织活细胞的比例较高，并且复苏后组织块的细胞生长较新鲜组织块滞后的时间较短，不耽误治疗的进度。

Description

一种胎盘超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘超低温冷冻保存方法。
背景技术
随着生物技术的发展，许多发达国家已经开展为保障未来健康,储存个体发育不同阶段所遗弃的脐带、胎盘、脐血,以及自身的外周血、骨髓,为将来实现个体化的基因治疗及细胞治疗提供丰富的细胞和组织资源储备。将来可利用于细胞的分离、定向诱导等技术,使之形成相应的细胞和组织,进行自体治疗,这不存在免疫排斥反应和伦理学问题，还可为他人的健康服务。目前胎盘组织是医学界常用来保存的离体组织之一，超低温冷冻保存技术和冷冻保护剂的发展，为胎盘的保存提供了强有力的技术支持。玻璃化低温保存方法是目前市场上较理想的低温保存途径，它是指液体转变为非晶态玻璃态的固化过程。玻璃化低温保存方法和常见的液体转变为晶体或部分结晶的固体冷冻过程不同,玻璃态固体分子之间与液相分子间无明显变化,而一般的晶体分子之间的关系和液态相差甚远，玻璃化比冻结固化方法引起的结果变化要小。但是使溶液玻璃化，除了需要有较高的溶液浓度外，还需要有较快的降温速度，现有技术是将装有离体组织的冻存管直接放入液氮中，其降温速度一般只有105K/S，达不到将其玻璃化所需的冷却速度（107K/S），为了解决这个问题，现有技术采用在降温的过程中进行加压处理，但是此种方法，会对细胞造成较大的伤害，而且复苏后的组织块的细胞生长较新鲜组织块滞后的时间较长，严重影响了治疗的效率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种对细胞伤害小、且不影响治疗进程的胎盘超低温保存方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种胎盘超低温冷冻保存方法，包括以下操作步骤：
（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗3-5次后，将其剪成2mm×2mm的组织块；
（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理15-20min，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有2-3ml的冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡5-7min；
（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心1-2min后，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存，其中湘仪离心机的转速为600-800r/min，离心温度为14-16℃；
其中上述冷冻保存液由以下重量份的组分制成：甲基丙烯磺酸钠6-9份、凯迪奥铵盐1-3份、二甲基亚砜26-32份、尿苷-5'-二磷酸三钠盐4-6份、乙酰胺15-17份、PBS缓冲液12-15份。
具体地，上述PBS缓冲液采用以下方法制成：准确量取16-18ml的0.2M NaH2PO4和82-84ml的0.2M Na2HPO4，混合均匀后，制得PBS缓冲液。
具体地，上述超声波处理时，超声波的频率为33-38KHz。
具体地，上述步骤（2）中，生物安全柜的进口风速设置为105-107FPM，层流风速设置为70-73FPM。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种胎盘超低温冷冻保存方法，在保存的过程中，对胎盘组织细胞的伤害较小，胎盘组织活细胞的比例较高，并且复苏后组织块的细胞生长较新鲜组织块滞后的时间较短，不耽误治疗的进度。其中，对配制好的冷冻保护剂采用超声处理，能消除冷冻保护剂中不同组分间的差异带来的溶液粘度过大的影响，能提升冷冻保护剂的稳定性；由常规的技术常识可知，在冷冻前进行离心，会使得冷冻保护剂发生一些沉淀，而且会使得胎盘组织细胞出现浓缩现象，这样增加了胎盘组织细胞在冷冻时的死亡率，但是本发明采用低速离心的方式，并且由于冷冻保护液在使用前进行了超声处理，能够有效的避免冷冻保护剂发生一些沉淀，并且在实际操作过程中还发现，低速离心处理并不会使得胎盘组织细胞出现浓缩现象，相反，离心处理后，提升了冷冻保护液在胎盘组织细胞内的渗透效果，进而提升了其对细胞的保护效果，提升了胎盘组织活细胞的比例；冷冻保存液中的甲基丙烯磺酸钠和凯迪奥铵盐协同作用后，能有效的降低胎盘细胞内水分的含量，并且其能提升冷冻保护液玻璃化效果，使得玻璃化进程不需要在加压的情况下进行；由于本发明提供的冷冻保护液为渗透型的，尿苷-5'-二磷酸三钠盐能有效的降低冷冻保护剂对细胞可能产生的毒害作用，能有效的保证胎盘组织细胞在复苏后具有较高的活性，进而缩短复苏后组织块的细胞生长较新鲜组织块滞后的时间。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种胎盘超低温冷冻保存方法，包括以下操作步骤：
（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗3次后，将其剪成2mm×2mm的组织块；
（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理15min，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有2ml的冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡5min；
（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心1min后，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存，其中湘仪离心机的转速为600r/min，离心温度为14℃；
其中上述冷冻保存液由以下重量份的组分制成：甲基丙烯磺酸钠6份、凯迪奥铵盐1份、二甲基亚砜26份、尿苷-5'-二磷酸三钠盐4份、乙酰胺15份、PBS缓冲液12份。
具体地，上述PBS缓冲液采用以下方法制成：准确量取16ml的0.2M NaH2PO4和82ml的0.2M Na2HPO4，混合均匀后，制得PBS缓冲液。
具体地，上述超声波处理时，超声波的频率为33KHz。
具体地，上述步骤（2）中，生物安全柜的进口风速设置为105FPM，层流风速设置为70FPM。
实施例2
一种胎盘超低温冷冻保存方法，包括以下操作步骤：
（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗4次后，将其剪成2mm×2mm的组织块；
（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理17min，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有2ml的冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡6min；
（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心1min后，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存，其中湘仪离心机的转速为700r/min，离心温度为15℃；
其中上述冷冻保存液由以下重量份的组分制成：甲基丙烯磺酸钠8份、凯迪奥铵盐2份、二甲基亚砜28份、尿苷-5'-二磷酸三钠盐5份、乙酰胺16份、PBS缓冲液13份。
具体地，上述PBS缓冲液采用以下方法制成：准确量取17ml的0.2M NaH2PO4和83ml的0.2M Na2HPO4，混合均匀后，制得PBS缓冲液。
具体地，上述超声波处理时，超声波的频率为35KHz。
具体地，上述步骤（2）中，生物安全柜的进口风速设置为106FPM，层流风速设置为72FPM。
实施例3
一种胎盘超低温冷冻保存方法，包括以下操作步骤：
（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗5次后，将其剪成2mm×2mm的组织块；
（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理20min，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有3ml的冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡7min；
（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心2min后，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存，其中湘仪离心机的转速为800r/min，离心温度为16℃；
其中上述冷冻保存液由以下重量份的组分制成：甲基丙烯磺酸钠9份、凯迪奥铵盐3份、二甲基亚砜32份、尿苷-5'-二磷酸三钠盐6份、乙酰胺17份、PBS缓冲液15份。
具体地，上述PBS缓冲液采用以下方法制成：准确量取18ml的0.2M NaH2PO4和84ml的0.2M Na2HPO4，混合均匀后，制得PBS缓冲液。
具体地，上述超声波处理时，超声波的频率为38KHz。
具体地，上述步骤（2）中，生物安全柜的进口风速设置为107FPM，层流风速设置为73FPM。
对比例1
对比例1中，胎盘组织块平衡后，不进行离心处理，直接放入液氮中，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
对比例2中，冷冻保护液采用常规的冷冻保护剂，其余的操作步骤与实施例2完全相同。
为了验证本发明的效果，分别用各实施例和对比例中的技术手段对同一胎盘上的组织块进行超低温冷冻保存试验，试验结果如表1所示：
表1 胎盘不同超低温冷冻保存方法效果比较
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (4)

1.一种胎盘超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
（1）将胎盘剪去包膜后，采用含有双抗的PBS缓冲液冲洗3-5次后，将其剪成2mm×2mm的组织块；
（2）将配制好的冷冻保护剂采用超声波处理15-20min，然后将其分装至冻存管中，每个冻存管装有2-3ml的冷冻保护剂，再向冻存管中加入单个胎盘组织块，在生物安全柜中平衡5-7min；
（3）将步骤（2）中处理好的冻存管放入离心管中，采用湘仪离心机离心1-2min后，取出冻存管，立即将其放入液氮中保存，其中湘仪离心机的转速为600-800r/min，离心温度为14-16℃；
其中上述冷冻保存液由以下重量份的组分制成：甲基丙烯磺酸钠6-9份、凯迪奥铵盐1-3份、二甲基亚砜26-32份、尿苷-5'-二磷酸三钠盐4-6份、乙酰胺15-17份、PBS缓冲液12-15份。
2.根据权利要求1中所述的一种胎盘超低温冷冻保存方法，其特征在于，上述PBS缓冲液采用以下方法制成：准确量取16-18ml的0.2M NaH2PO4和82-84ml的0.2M Na2HPO4，混合均匀后，制得PBS缓冲液。
3.根据权利要求1中所述的一种胎盘超低温冷冻保存方法，其特征在于，上述超声波处理时，超声波的频率为33-38KHz。
4.根据权利要求1中所述的一种胎盘超低温冷冻保存方法，其特征在于，上述步骤（2）中，生物安全柜的进口风速设置为105-107FPM，层流风速设置为70-73FPM。
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