CN106172375A - 一种胎盘组织超低温冷冻保存方法 - Google Patents

一种胎盘组织超低温冷冻保存方法 Download PDF

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张正亮
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

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Abstract

本发明公开一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，包括下述步骤：取胎盘组织，离体后置于4℃的含双抗的0.9％生理盐水中保存，先剪成单个胎盘小叶组织块，然后粉碎成组织块；取上述胎盘组织块，按照1:1.2体积比加入保护液；加入保护液后，再用体积分数为10‑20％的专用培养基于4℃培养45‑60min；然后再在4℃，2500rpm离心5‑10min，弃上清液；然后向离心后组织块中加入体积分数为85‑95％冻存液2.5ml，将组织块浸没其中，按一定温降速率降温至‑100℃，最后转移至液氮中保存。本发明通过保护液与冻存液协同保护细胞的活性，防止细胞形成冰晶受到损伤，确保了复苏后的胎盘组织活性，能大幅度减少多肽等活性物质在冷冻过程中的损害。

Description

一种胎盘组织超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种胎盘组织超低温冷冻保存方法。
背景技术
胎盘所含成分较为复杂，包括胎盘球蛋白、胎盘血蛋白、溶菌酶、激肽酶、组胺酶、激素、促生长因子、多肽等活性物质，具有抗感染、增强机体抵抗力、激素样作用、促凝血作用等作用。低温冻存保存是胎盘保存常用的方法，一般能达到2年的保存期限。
尽管低温冷冻技术能够使胎盘长期保存，但是也带来了冷冻损伤的问题，无论采用任何形式的冷冻，在冷冻过程中产生的冻结应力对生物多肽等活性物质都有破坏作用，冷冻过程中产生的冻结应力包括枝状冰晶的形成、离子浓度的增加、pH值的改变、相分离等都会导致多肽及蛋白质等活性物质变性，从而降低了胎盘的药用价值。针对现有冷冻法对胎盘活性物质的损伤，本发明提供一种方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胎盘组织超低温冷冻保存方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，该保存方法包括下述步骤：
取胎盘组织，离体后置于4℃的含双抗的0.9％生理盐水中保存，先剪成单个胎盘小叶组织块，然后粉碎成组织块；
取上述胎盘组织块，按照1:1.2体积比加入保护液；
加入保护液后，再用体积分数为10-20％的专用培养基于4℃培养45-60min；然后再在4℃，2500rpm离心5-10min，弃上清液；
然后向离心后组织块中加入体积分数为85-95％冻存液2.5ml，将组织块浸没其中，按一定温降速率降温至-100℃，最后转移至液氮中保存。
所述的胎盘组织取自健康产妇正常分娩或剖腹产；生理盐水中含200U/ml双抗；保存后，用止血钳和手术剪将胎盘的胎膜和基脱膜剥离，再用含双抗的0.9％生理盐水冲洗至无血色，剪成约5*5cm大小的单个胎盘小叶组织块，然后用粉碎机粉碎成3*3mm大小的组织块。
所述的保存液中含有海藻糖10～20g/l、醋酸酯淀粉5～10g/l、卵磷脂1～2.5g/l、乙烯乙二醇0.6～1.2g/l、聚乙烯吡咯烷酮0.8～1.3g/l、柠檬酸3～6g/l、柠檬酸三钠5～8g/l、聚山梨酯1～1.5g/l。
所述的一定温降速率步骤为：先以2℃/min的速率降至-40℃，然后再以10℃/min的速率降温至-100℃。
所述的冻存液以人自体血清、二甲基亚砜与右旋糖酐40按2:0.5:0.3的体积比配制而成冷冻保护液；所述的专用培养基由DMEM培养基与15％的FBS制成。
本发明的有益效果：本发明通过保护液与冻存液协同保护细胞的活性，防止细胞形成冰晶受到损伤，确保了复苏后的胎盘组织活性，能大幅度减少多肽等活性物质在冷冻过程中的损害。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，取健康产妇正常分娩或剖腹产后的胎盘组织，离体后立即置于4℃的含200U/ml双抗(75U/ml青霉素和125U/ml链霉素)的0.9％生理盐水中保存，用止血钳和手术剪将胎盘的胎膜和基脱膜剥离，再用含双抗的0.9％生理盐水冲洗至无血色，剪成约5*5cm大小的单个胎盘小叶组织块，然后用粉碎机粉碎成3*3mm大小的组织块；
取50g上述3*3mm大小的胎盘组织块，按照1:1.2体积比加入保护液，每升该保存液中含有海藻糖20g、醋酸酯淀粉5g、卵磷脂2.5g、乙烯乙二醇0.6g、聚乙烯吡咯烷酮1.3g、柠檬酸3g、柠檬酸三钠8g、聚山梨酯1g；
加入保护液后，再用体积分数为10-20％的专用培养基于4℃培养45min；然后再在4℃，2500rpm离心5min，弃上清液，然后向组织块中加入体积分数为85-95％冻存液2.5ml，将组织块浸没其中，先以1℃/min的速率降至-40℃，然后再以5℃/min的速率降温至-100℃，最后转移至液氮中保存；
上述冻存液以人自体血清、二甲基亚砜与右旋糖酐40按2:0.5:0.3的体积比配制而成冷冻保护液；上述专用培养基由DMEM培养基与15％的FBS制成；
实施例2
一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，取健康产妇正常分娩或剖腹产后的胎盘组织，离体后立即置于4℃的含200U/ml双抗(75U/ml青霉素和125U/ml链霉素)的0.9％生理盐水中保存，用止血钳和手术剪将胎盘的胎膜和基脱膜剥离，再用含双抗的0.9％生理盐水冲洗至无血色，剪成约5*5cm大小的单个胎盘小叶组织块，然后用粉碎机粉碎成3*3mm大小的组织块；
取50g上述3*3mm大小的胎盘组织块，按照1:1.2体积比加入保护液，每升该保存液中含有海藻糖10g、醋酸酯淀粉10g、卵磷脂1g、乙烯乙二醇1.2g、 聚乙烯吡咯烷酮0.8g、柠檬酸6g、柠檬酸三钠5g、聚山梨酯1.5g；
加入保护液后，再用体积分数为10-20％的专用培养基于4℃培养60min；然后再在4℃，2500rpm离心10min，弃上清液，然后向组织块中加入体积分数为85-95％冻存液2.5ml，将组织块浸没其中，先以1℃/min的速率降至-40℃，然后再以5℃/min的速率降温至-100℃，最后转移至液氮中保存；
上述冻存液以人自体血清、二甲基亚砜与右旋糖酐40按2:0.5:0.3的体积比配制而成冷冻保护液；上述专用培养基由DMEM培养基与15％的FBS制成；
本发明胎盘保存液，能够深入胎盘内部结构，具有降低冰点，减少冰晶形成、平衡细胞内外渗透压、减轻细胞缩水程度、避免多肽失活等作用。本发明胎盘保存液配比简单，使用方便，能大幅度减少多肽等活性物质在冷冻过程中的损害。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (5)

1.一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，该保存方法包括下述步骤：
取胎盘组织，离体后置于4℃的含双抗的0.9％生理盐水中保存，先剪成单个胎盘小叶组织块，然后粉碎成组织块；
取上述胎盘组织块，按照1:1.2体积比加入保护液；
加入保护液后，再用体积分数为10-20％的专用培养基于4℃培养45-60min；然后再在4℃，2500rpm离心5-10min，弃上清液；
然后向离心后组织块中加入体积分数为85-95％冻存液2.5ml，将组织块浸没其中，按一定温降速率降温至-100℃，最后转移至液氮中保存。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述的胎盘组织取自健康产妇正常分娩或剖腹产；生理盐水中含200U/ml双抗；保存后，用止血钳和手术剪将胎盘的胎膜和基脱膜剥离，再用含双抗的0.9％生理盐水冲洗至无血色，剪成约5*5cm大小的单个胎盘小叶组织块，然后用粉碎机粉碎成3*3mm大小的组织块。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述的保存液中含有海藻糖10～20g/l、醋酸酯淀粉5～10g/l、卵磷脂1～2.5g/l、乙烯乙二醇0.6～1.2g/l、聚乙烯吡咯烷酮0.8～1.3g/l、柠檬酸3～6g/l、柠檬酸三钠5～8g/l、聚山梨酯1～1.5g/l。
4.根据权利要求1所述的一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述的一定温降速率步骤为：先以2℃/min的速率降至-40℃，然后再以10℃/min的速率降温至-100℃。
5.根据权利要求1所述的一种胎盘组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述的冻存液以人自体血清、二甲基亚砜与右旋糖酐40按2:0.5:0.3的体积比配制而成冷冻保护液；所述的专用培养基由DMEM培养基与15％的FBS制成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108575985A (zh) * 2018-04-20 2018-09-28 吴礼高 一种胎盘超低温冷冻保存方法

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CN105532641A (zh) * 2015-12-28 2016-05-04 贵州泰邦生物制品有限公司 一种胎盘保存液及其使用方法

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