JPS62262993A - 生物活性物質の被包化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素または生きている細胞物質の固定は広く知られてい
る。例えば「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓＪＴ、
Ｍ、Ｓ。

Ｃｈａｎｇ氏他出版、８ｐｒｉｎｇｉ’１ｅｌｄ工１１
１ｎｏｉｓ　（１９７２）に記載されているように活性
な細胞物質をマイクロカプセル中に封入することにより
、できる′だけ大きな表面を保持して区画に分けること
によって物質の生物活性が保持されるかまたは改良され
うる。

西ドイツ特許公開第５，０１２，２３３号（米国特許第
４，３５２，８８３号１ヰ窮４，５９１，９０９号、同
第４．４０ス９５７号および同第４，４９５，２８８号
）には組＃または個々の細胞を被包化する方法が記載さ
れている。この細胞物質は、細胞の正常な代謝機能を保
持するために栄養物質、イオン、酸素および他の低分子
物質が透過しうる膜中に保護された状態で生存能力を保
ったまま封入されるべきである。

被包化されるべき物質は組織に対し一時的な保護包囲を
生ずるために、小滴にゲル化されうる水溶性の物質を含
有する媒体中に懸濁される。

細胞物質の感受性ゆえに、電解質媒体による可逆性ケ゛
ル化には非常に特殊な緩衝媒体のみしか用いられない。

一時的なカプセルの形成にとって好ましい物質は、　　
ａ）条件例えば−の変化、″またはＯａ２＋のような多
価陽イオンの添加に際して寸法的に安定な塊を可逆的に
形成でき、そしてｂ）そのアミン基が酸性多糖類成分と
反応しうるポリ塩基と持続的に複合体形成しうる天然の
多糖類ゴム状樹脂である。持続性の半透過性の膜が形成
されたのち、その物質が液体で存在する条件を創出する
ことにより一時的なカプセルが溶解されうる。

このことは多種類樹脂の多数のイオン基によね細胞生育
または代謝が妨げられる極度に感受性の高い生物活性物
質の場合に特に必要である。

西ドイツ特許公開第３，２０９，１２７号（米国特許第
４，４０９，３３１号）においては代謝産物を得るため
に細胞を前記した方法で被包化する方法が記載されてい
る。

生物活性物質はヨー　ａ　７　Ａ　％許出顯０．１２９
，６１９号に言及されているように実質上中性の正味電
荷を有するタンノ署り膜中にも封入されうる。しかしな
がらその場合１例えば微生物がより容易に汚染されるか
またはタンパク質の再現性がより少ないことによシ惹起
される問題、特に可逆的なゲル／ゾル遷移が可能でない
という事実により惹起される問題が生ずる。

実質的に中性のゲル形成剤としてアガロース。

殿粉またはイナゴマメ穀粉を一時的なカプセルに使用す
る場合は、５０’Ｃ以上のしばしば非生理学的温度に加
熱することによってはじめてゲルの液化が起る。

一時的カプセル形成にこれまで使用されたすべてのゲル
は温度を高めた場合にのみ液化を示し、そしである場合
にはすでに述べたように一般的に非生理学的温度にまで
加熱した場合にのみしか液化を示さない。これまで生物
活性物質の簡単な可逆的被包化法には「逆」の温度挙動
を有するゲル形成剤は何ら使用されていない。「逆」の
温度挙動とはゲル化温度より低い温度でのゲルの液化を
意味する。

今驚くべきことに、逆の温度挙動を有するゲルが生物活
性物質の被包化に非常に好都合に使用されうろことが見
出された。特に非イオン系ゲルの使用が好都合なことが
判明した、何故なら細胞との静電相互作用が回避される
からである。本発明により製造されるカプセルは慣用の
水性培養基中に懸濁され、その場合封じ込まれた物質の
活性は保護されたままでありそして代謝産物が合成され
る。

従って本発明は １）逆の熱可逆性温度挙動を有する多糖類がゲル形成に
使用されることからなる生物活性物質をゲル中に被包化
する方法、 ２）前記１）項により得られる被包化された生物活性物
質、および ３）物質の製造への前記１）項により被包化された生物
活性物質の使用、 に関する。

本発明を以下に詳細に説明する。

生物活性物質とは例えば細胞および酵素を意味する。ゲ
ルカプセルに使用される物質としてはそれらのゲル相が
ゲル相におけるより高い温度で存在する。被包化すべき
物質にとって生理学的に受容できる原則的にすべての多
糖類が使用されうる。ゾル／ゲル遷移は包囲すべき物質
の活性を実質上損わない温度にあるべきである。

例、ｔ　ハアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセ
ルロースまたはヒドロキシアルキル殿粉のような疎水性
置換された多糖類が適当である。

メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース
、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブ
チルメチルセルロースおヨヒエチルヒドロキシエチルセ
ルロースのよウナセルロースエーテルが好ましい。ヒド
ロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシブチルメチ
ルセルロースが使用されるのが特に好ましい。

本発明によるゲルカプセル物質はＣＬＯ５〜１゜電ｆ＃
％、好ましくはｃＬ１〜３重ｆｉｉ優の濃度で水溶液中
に溶解される。ゾルからゲルへの遷移温度は水中で１０
〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃である。イオン強度
を変更することにより、すなわち例えば塩の添加により
遷移がより低い方の温範囲の物質依存性比例定数を有す
るイオン強度ニ比例する（ヒドロキシプロピルセルロー
スの実施例でのゾル−ゲル遷移についての図面参照）。

この目的には例えば水性培養基に添加される塩、％に燐
酸塩、硫酸塩および塩化物が適当である。

被包化すべき生物活性物質を生理学的に適当な温度およ
び適当な…値で本発明により製造されたカプセル物質の
水溶液中に懸濁させる。個個の条件は実質的にその生物
学的物質の如偶によるものであって当業者に知られてい
るかまたは簡単な予備実験により決定されうる。例えば
温度範囲２０〜５０℃およびｐＨ３〜９の準位が適当で
ある。この水溶液は塩および場合により抜根包囲される
物質の培養に必要である栄養物質を゛含有するのが好ま
しい。

生物活性物質は例えば一時的安定化のために多糖類ブロ
ック中に封入されるか、または球中に固定されることが
でき、このことは後程のインキュベーションにとって好
ましい。球の形成には懸濁液をカニユーレに無理に通す
。約１ｏ。

〜２０００μｍの寸法を有する出てぐる液滴が生物活性
物質にとって適当な組成を有する水溶液中に落下される
。この溶液の温度がゾル／ゲル遷移温度より高い場合は
、ゲル形成が直ちに起り。

従って個々のケ゛ル球が溶液中に存在する。カプセルは
別の相として媒体中に集まり、これを済過により分離し
うる。

温度に対する感受性または使用の如何に応じ。

封入された生物活性物質は直接インキュベーションに使
用されるか、または例えば使用される多糖類がゲル状態
で存在する温度が生物学的物質にとって高すぎておりそ
してそれにより活性が損われる場合は１次の操作段階で
半透過性膜を多糖類カプセルの表面に適用しうる。

このことは例えば、電荷を適用しそして次にゲルまたは
ゾル状態のいずれかで存在しうる多糖類のまわりに多価
電解質複合物膜を形成させることにより水溶液中で行わ
れる。この目的にはゲル球またはゾルを、その疎水性基
が置換多糖類の疎水性領域のまわりに集合する荷電され
た両親媒物の溶液に攪拌下に移す。多糖類に電荷を付着
させると、それにより反対に荷電された多価電解質が静
電気により結合されうる。電荷の如何に応じポリ塩基ま
たはポリ酸が複合される。実際の膜形成はカプセルを水
溶液中で洗浄したのち１次に反対の荷電を有するポリ塩
基またはポリ酸と複合物形戊することによシ起る。

そのあとまたは同時に、カプセルを含有する媒体の温度
を冷却すゐことによシゲルがゾル状態に変換される。

適当な両親媒物質（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ　ｓｕ’ｂ
ｓｔａｎｃｅ）は細胞受容性でなければならない。陽性
に荷電したセチルアンモニウムブロマイドまたは負に荷
電したホスファチド酸が使用されるのが好ましい。適当
なポリ酸の例をあげればカラゲエニン。

カルボキシメチルセルロース、アルギネートおよびポリ
アクリル酸であり、これらのうち最初にあげた２つの化
合物が好ましい。適当なポリ塩基の例をあげればキトサ
ン、ポリエチレンイミンまたはポリリジンがあげられ、
あとの化合物が好ましい。

表面に荷電を付与するための代替法は、多糖類カプセル
を調整する場合に物質に負に荷電した重合体１例えばカ
ルボキシメチルセルロースを混合し、それ罠より負の表
面荷電を得ることにある。

多糖類カプセルが、堅牢な複合性の被膜覆を形成したの
ちに溶解される場合は、カプセルを含有する媒体が冷却
、しかもゾル／ゲル遷移温度よυ下の温度まで冷却され
ねばならない。その場合、膜透過性を変えるために場合
によりゾル／ゲル遷移における容量変化が利用されうる
。

何故なら多糖類の膨潤によシ膜透過性が高められるから
である。

第２の膜を用いて多糖類カプセルを包囲するもう一つの
可能な方法は非水溶液から形成させることである。多糖
類カプセルは例えば生物活性物質が線温されているゾル
をカプセルが溶解しない有機溶媒または溶媒混合物中に
滴下することにより形成される。はげしく攪拌すること
により多糖類球の選択された溶媒中における分散が達成
され、その場合多ｍ類は温度の如何に応じゾルまたはゲ
ルのいずれかの状態で存在しつる。溶媒の選択は生物学
的物質の性質の如何による。その東件の一つは生物学的
活性がその溶媒により持続的に損われないということで
ある。しかしながらこれは予備実験で容易に調査されう
る。適当な溶媒は高分子量の極性の少ない液体例えばフ
タル酸アルキルエステル、ジイソアミルエーテル、ドデ
カン、デカリンまたはデカノールである。

外側の膜の形成用重合体としては、物質の生物学的活性
を持続的に減少させない同様の化合物例えばアセチルセ
ルロース、酪酸セルロース。

エチルセルロースまたは、ポリアクリル酸またはポリメ
タクリル酸の誘導体のような慣用のセルロース誘導体が
用いられる。これらは多糖類ゾル中に不溶性であるがし
かし前記した有機溶媒中には一部溶解する。多糖類ゾル
またはゲルの周りに膜を形成させることは相分離により
行われる。膜形成性重合体は有機溶媒−中に添加されて
前記した分散物である溶媒／多糖類分散液を生ずる。こ
の有機溶媒も同様に、それが生物活性物質にとって生理
学的に受容されねばならないことおよび多糖類がそれに
不溶であるという要件に合致しなければならない。もと
もと分散液中にすでに含有されておりそして重合体がそ
の中に部分的にしか溶解しない溶媒を使用するのが好ま
しい。重合体は相界面で沈殿することにより多糖類の周
囲にゾル状態またはゲル状態の膜を形成する。分散液へ
の添加にとって重合体が完全に溶解する溶媒が使用され
るならば、沈殿および膜の形成は分散液を混合すること
により直ちに、または重合体の溶解度を低下させる生理
学的に受容される沈殿剤１例えば水または適当な有機媒
体を添加することによってはじめて惹起されうる。

本発明を以下の実施例により詳細に説明する。

優記載は別に断わりなければ重量によるものとする。

実施例　１ ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ■Ｍ。

分子ｉｆ　８００．０００．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ　工ｎｃ
、）をジュルベツコの燐酸塩緩衝液（Ｐｌｏｖ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｔｅｓ　ｌ　）中に３７℃で１％溶解させ
る。この緩衝液は下記組成を有する。

Ｃ！ａｃｊ１２・Ｈ２０１３５，５＋１１９／Ｊ２Ｋｅ
ｎ　　　　　　　　　　　　２０α０岬／βＫＨ２ＰＯ
４２０αＯＩ ＭｇＣβ２・６Ｈ２０１０１１０＃ ＮａＣｎ　　　　　　　　　　　８００α０ＩＮａ２Ｈ
ＰＯ４１１５［１０１ Ｈ７ ハイブリドーマ細胞をこの溶液中に攪拌しながら３７℃
で懸濁させる。この懸濁液を使い捨て注射器からカニエ
ーレ（直径ＣＬ　４　ｔｘｍ　）に無理に通す。出てき
た液滴（２日）は４２℃に加温されている前記組成の緩
衝溶液中に落下する。

直ちにゲル形成が行われて１個々のゲル球が温かい溶液
中に存在する。

実施例　２ 実施例１により得られたゲル球をα１ｃ！Ｊセチルアン
モニウムブロマイド水溶液中に刃口え、その中で１５分
間おいた。ダルベツコの緩衝溶液で洗ったのちこれをα
２％λ−カラゲエニン溶液（Ｓｉｇｍａ社製）中に１０
分間で加える。再び洗ったのち球を１チキトサン溶液（
１３１ｇｍａ社ｆＭ）中に移し、その中で５７℃まで冷
却する。球が１５分後にその本来の大きさ２ｍａに再び
到達すると。

それらをキトサン溶液からとり出しそして洗浄後封入さ
れた物質をインキュベーションするためにウシ胎児崩清
を添加したダルベツコ緩衝液中に移す。マイクロカプセ
ル中に平均５０〜１５０個のハイプリドーマ細胞が存在
し、その生育をロールビン中で３０日間にわたり追跡す
る。細胞密度的ｌＸ１０’／ｍｆｆ１において５００　
μｇ／ｍｅのモノクローナル抗体の合成能力が見られる
。

実施例　３ 実施例１の記載に従って操作するがしかしヒドロキシプ
ロピルセルロースにカルボキシメチル七ルロースを１：
１の比率で混合する。球を０２憾キトサン溶液中に移す
。緩衝液で洗ったのちｇｔさらに安定化させるために１
％カルボキシメチルセルロース溶液に移す。以後の操作
経過は実施例２に記載されたとおりである。

実施例　４ １％のジメチルアミンエチルメタクリレート共重合体（
ｌｉｍｄｒａｇ　ｉｔ”Ｋ　、Ｒ８ｈｍ社製、ダルムシ
ュタット）を含有するジブチル７タレート２０飄の調製
ずみ混合物中に１俤のヒドロキシプロピルセルロース（
Ｋｌｕｃｅｌ　Ｍ社製〕およびα８憾のＮａ２８０４を
含有する水溶液な５誠中にノ・イブリドーマ細胞も懸濁
したものを実施例１の記載と同様にしてカニユーレによ
り攪拌下に滴下させる。

分散液を４２℃に加温すると共重合体により封入された
ゲル球の直径が約４（約８００μｍ）に減少する。有機
媒体をデカンテーションして除きそしてゲル球を４２℃
で水性緩衝媒体（−１４の燐酸塩緩衝液）を用いて洗い
、３７℃のジュルベツコの栄養培地に移しそして実施例
２の記載に従ってインキュベーションして同じ結果を得
る。

実施例　５ （Ｌ８％のヒドロキシブチルメチルセルロース（Ｍｅｔ
ｈｏｃｅＩＨＢ、　Ｄｏｔ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏｒｐ、社製
）およびｌｌＢチのＩＪａ２ＳＯ４を含有する水溶液１
０ｍｊｌＶｃ２５℃で比活性６３単位／■を有するペプ
シン（ＳｅｒｖａＦｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｃａ社製
）１０町を加える。比活性をＤＩＢｔ５１ｒｍａｎｎ氏
他（Ｈｏｐｐａ−８ｅｙｌｅｒ’ａ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏ
ｌＯｈｅｍ、３５０　３８０（１９６９））の方法に従
い標準ヘモグロビン試験で測定する。

この溶液をα８優Ｎａ２ＳＯ４水溶液５０峨中に４６℃
で注ぎ入れる。安定化された酵素を中に包みこんだ形成
されたゲル塊を２４時間後にデカンテーションによシ分
離しそして生理食塩済液１０謔中に２５℃で再懸濁する
。その際ゾルから遊離されるペプシンの比活性は７７単
位／ｇ９である０

【図面の簡単な説明】

添付の図面は塩の添加によシゾル／ゲル遷移温度が低い
方にシフトされる例をヒドロキシプロピルセルローステ
示ス。 特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名 温度 Ｃ イオン強度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）逆の熱可性温度挙動を有する多糖類がカプセル形成
   に使用されることからなる生物活性物質をゲル中に被包
   化する方法。 ２）疎水性置換された多糖類が使用されることからなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）セルロースエーテルが多糖類として使用されること
   からなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシブ
   チルメチルセルロースがセルロースエーテルとして使用
   されることからなる特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５）ゲルまたはゾル状態の多糖類の周囲に半透過性膜を
   形成させることからなる特許請求の範囲第１〜４項のい
   ずれか１項記載の方法。 ６）半透過性膜の形成前または形成後に多糖類のゾル／
   ゲル遷移が行われることからなる特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７）ゾル／ゲル遷移が１０〜７０℃で行われることから
   なる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）ゾル／ゲル遷移が２０℃〜５０℃で行われることか
   らなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９）水溶液中に半透過性膜を形成させるためにａ）ゲル
   またはゾル状態の多糖類上に両親媒物質を用いて荷電さ
   せ、そして ｂ）ポリ酸またはポリ塩基を用いて多価電解質複合膜を
   形成させる、 ことからなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０）封入される物質の生物活性を持続的に低下させな
   い重合体を有機溶液から多糖類−ゾルまたは−ゲルとの
   相界面で沈殿させそしてその多糖類の周囲に膜を形成さ
   せることからなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 １１）特許請求の範囲第１〜１０項のいずれか１項記載
   の方法により得られる生物活性物質。 １２）物質の製造への特許請求の範囲第１１項記載の被
   包化された生物活性物質の使用。