CN109402102B - 一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面附有半透保护膜的酶‑磷脂微囊的制备方法，包括以下步骤：步骤一：取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，加入乙醇‑氯仿混合溶液加热至40℃，混合均匀后静置反应10min，将容器中抽真空通入电流，得到微胶囊球水凝胶；步骤二：取酶液和Tris‑HCl缓冲液，搅拌均匀后分别加入海藻酸钠和氯化钙溶液，恒温振荡后加入微胶囊球水凝胶，分散得到酶‑磷脂微囊；步骤三：取壳聚糖颗粒溶解后加入氯仿溶液，将氯仿吹干，加入戊二醛溶液反应，水洗至无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；步骤四：取改性壳聚糖乙醇溶胀，加入酶‑磷脂微囊，真空干燥。
Description
技术领域
本发明属于酶固定技术领域，具体是涉及一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法。
背景技术
微型胶囊，或微囊(Microcapsules)，系指固态或液态药物被囊材包裹而成的药库型微型胶囊。微囊中包载的药物可在特定的部位和介质中释放，具有缓释、控释或靶向释放等不同的释药特征。药物制成微囊(或微球)，可以实现以下作用：掩盖药物的不良气味及口味；提高药物的稳定性；降低药物对消化道的刺激；液体药物固体化，方便其使用；避免复方制剂中药物的配伍变化；制成缓控释制剂和靶向制剂；包裹活细胞或者生物活性物质。药物微囊是一种制剂中间体，可进一步将其加工成片剂、胶囊剂、注射剂、眼用制剂、贴剂、气雾剂和混悬剂等，应用于临床。
微囊技术是运用一定的方法和仪器，使用天然的或合成的高分子材料将固体，液体甚至是气体的微小颗粒包裹在直径为1～500μm的半透性或密封囊膜的微型胶囊内的技术。微胶囊内的物质由于与外界环境相隔离可以免受环境的影响，从而保持稳定。在适当条件下，被包封物质又可以释放出来。通过适当手段，可以达到控释效果，微囊技术在生物、医药、农业等等多方面都有广泛应用前景。
目前，将酶固定于磷脂微囊的方法还不够完善，制得的酶-磷脂微囊具有内表面积小、微囊强度低、酶活性损失大且制备过程繁琐，所以，目前需要一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法。
本发明的技术方案是：一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一：按照质量比2:1的比例取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，将摩尔比为5:1的乙醇-氯仿混合溶液加热至40℃倒入容器中，倒入过程中持续搅拌，混合均匀后静置反应10min，然后将容器中抽真空，通入电流，通过正负电荷的吸引发生瞬时凝胶化，得到微胶囊球水凝胶；
步骤二：取10mL浓度为0.8g/ml酶液，加入10ml 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀后在室温下静置3h，然后分别加入3mL 20mol/L的海藻酸钠和5mL 25mol/L的氯化钙溶液，恒温振荡15min，待冷却至室温后加入步骤一得到的微胶囊球水凝胶150g，用搅拌仪以300r/min的转速持续搅拌10h，分散得到酶-磷脂微囊；
步骤三：取粒径为0.3mm的壳聚糖颗粒充分溶解于2mol/L的盐酸溶液中，中和至中性后喷雾干燥，向干燥后的壳聚糖中加入氯仿溶液至浓度为5％，通入氮气将氯仿吹干，加入10mL 0.03mol/L的戊二醛溶液在35℃的温度下反应12h，然后水洗至溶液中无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；
步骤四：取步骤三中得到的改性壳聚糖用95％浓度的乙醇溶液溶胀，加入步骤二中得到的酶-磷脂微囊，在14-16℃下振荡30min，真空干燥，得到表面附有保护膜的酶-磷脂微囊。
进一步地，所述喜树碱为10-羟基喜树碱，在实验中发现，10-羟基喜树碱毒性较低，且可以增加磷脂微囊内表面积，便于固定酶，相较于喜树碱更为适用于本制备方法。
进一步地，所述步骤二中恒温振荡是以45-50℃的温度，振荡频率为2kHz进行恒温振荡处理，可以形成较为均匀的酶-磷脂微囊。
进一步地，所述步骤二中的分散具体操作为：经容器底部向加入微胶囊球水凝胶的混合溶液中以喷雾进入的形式加入10ml 1mol/L的HEPES溶液，HEPES溶液加入完毕后经容器底部通入二氧化碳气体5min，微胶囊球水凝胶进行团聚絮凝，形成酶-磷脂微囊，以喷雾形式加入分散液，可以获得更好的分散效果，分散得到的酶-磷脂微囊粒径减小，表面效应显著增大。
进一步地，所述步骤三中中和至中性采用的是1mol/L的氢氧化钠溶液。
进一步地，所述步骤四中附在酶-磷脂微囊表面的保护膜为半透膜，在保护酶-磷脂微囊强度的同时，便于酶的活性研究。
进一步地，所述制得的酶-磷脂微囊保存条件为：冷冻干燥后，置于4±1℃的环境保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果提现在以下几点：
(1)本发明通过将天然活性成分10-羟基喜树碱与溶血磷脂通过真空电解的方式形成微胶囊球水凝胶，可以有效的提高微胶囊球水凝胶的强度，增大磷脂微囊内表面积；
(2)通过底部喷雾分散液的形式进行酶-磷脂微囊分散，可以获得更好的分散效果，分散得到的酶-磷脂微囊粒径减小，表面效应显著增大；
(3)利用壳聚糖与戊二醛在一定条件下形成的改性壳聚糖，在酶-磷脂微囊表面形成一层半透保护膜，在保护酶-磷脂微囊强度的同时，便于酶的活性研究。
具体实施方式
为便于对本发明技术方案的理解，下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明，实施例并不构成对发明保护范围的限定。
实施例1
一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一：按照质量比2:1的比例取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，将摩尔比为5:1的乙醇-氯仿混合溶液加热至40℃倒入容器中，倒入过程中持续搅拌，混合均匀后静置反应10min，然后将容器中抽真空，通入电流，通过正负电荷的吸引发生瞬时凝胶化，得到微胶囊球水凝胶；
喜树碱为10-羟基喜树碱，在实验中发现，10-羟基喜树碱毒性较低，且可以增加磷脂微囊内表面积，便于固定酶，相较于喜树碱更为适用于本制备方法
步骤二：取10mL浓度为0.8g/ml酶液，加入10ml 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀后在室温下静置3h，然后分别加入3mL 20mol/L的海藻酸钠和5mL 25mol/L的氯化钙溶液，以45℃的温度，振荡频率为2kHz进行恒温振荡处理15min，待冷却至室温后加入步骤一得到的微胶囊球水凝胶150g，用搅拌仪以300r/min的转速持续搅拌10h，经容器底部向加入微胶囊球水凝胶的混合溶液中以喷雾进入的形式加入10ml 1mol/L的HEPES溶液，HEPES溶液加入完毕后经容器底部通入二氧化碳气体5min，微胶囊球水凝胶进行团聚絮凝，形成酶-磷脂微囊，以喷雾形式加入分散液，可以获得更好的分散效果，分散得到的酶-磷脂微囊粒径减小，表面效应显著增大；
步骤三：取粒径为0.3mm的壳聚糖颗粒充分溶解于2mol/L的盐酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性后喷雾干燥，向干燥后的壳聚糖中加入氯仿溶液至浓度为5％，通入氮气将氯仿吹干，加入10mL 0.03mol/L的戊二醛溶液在35℃的温度下反应12h，然后水洗至溶液中无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；
步骤四：取步骤三中得到的改性壳聚糖用95％浓度的乙醇溶液溶胀，加入步骤二中得到的酶-磷脂微囊，在14℃下振荡30min，真空干燥，得到表面附有保护膜的酶-磷脂微囊，保护膜为半透膜，在保护酶-磷脂微囊强度的同时，便于酶的活性研究，冷冻干燥后，置于3℃的环境保存。
实施例2
一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一：按照质量比2:1的比例取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，将摩尔比为5:1的乙醇-氯仿混合溶液加热至40℃倒入容器中，倒入过程中持续搅拌，混合均匀后静置反应10min，然后将容器中抽真空，通入电流，通过正负电荷的吸引发生瞬时凝胶化，得到微胶囊球水凝胶；
喜树碱为10-羟基喜树碱，在实验中发现，10-羟基喜树碱毒性较低，且可以增加磷脂微囊内表面积，便于固定酶，相较于喜树碱更为适用于本制备方法
步骤二：取10mL浓度为0.8g/ml酶液，加入10ml 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀后在室温下静置3h，然后分别加入3mL 20mol/L的海藻酸钠和5mL 25mol/L的氯化钙溶液，以45℃的温度，振荡频率为2kHz进行恒温振荡处理15min，待冷却至室温后加入步骤一得到的微胶囊球水凝胶150g，用搅拌仪以300r/min的转速持续搅拌10h，经容器底部向加入微胶囊球水凝胶的混合溶液中以喷雾进入的形式加入10ml 1mol/L的HEPES溶液，HEPES溶液加入完毕后经容器底部通入二氧化碳气体5min，微胶囊球水凝胶进行团聚絮凝，形成酶-磷脂微囊，以喷雾形式加入分散液，可以获得更好的分散效果，分散得到的酶-磷脂微囊粒径减小，表面效应显著增大；
步骤三：取粒径为0.3mm的壳聚糖颗粒充分溶解于2mol/L的盐酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性后喷雾干燥，向干燥后的壳聚糖中加入氯仿溶液至浓度为5％，通入氮气将氯仿吹干，加入10mL 0.03mol/L的戊二醛溶液在35℃的温度下反应12h，然后水洗至溶液中无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；
步骤四：取步骤三中得到的改性壳聚糖用95％浓度的乙醇溶液溶胀，加入步骤二中得到的酶-磷脂微囊，在15℃下振荡30min，真空干燥，得到表面附有保护膜的酶-磷脂微囊，保护膜为半透膜，在保护酶-磷脂微囊强度的同时，便于酶的活性研究，冷冻干燥后，置于4℃的环境保存。
实施例3
一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一：按照质量比2:1的比例取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，将摩尔比为5:1的乙醇-氯仿混合溶液加热至40℃倒入容器中，倒入过程中持续搅拌，混合均匀后静置反应10min，然后将容器中抽真空，通入电流，通过正负电荷的吸引发生瞬时凝胶化，得到微胶囊球水凝胶；
喜树碱为10-羟基喜树碱，在实验中发现，10-羟基喜树碱毒性较低，且可以增加磷脂微囊内表面积，便于固定酶，相较于喜树碱更为适用于本制备方法
步骤二：取10mL浓度为0.8g/ml酶液，加入10ml 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀后在室温下静置3h，然后分别加入3mL 20mol/L的海藻酸钠和5mL 25mol/L的氯化钙溶液，以50℃的温度，振荡频率为2kHz进行恒温振荡处理15min，待冷却至室温后加入步骤一得到的微胶囊球水凝胶150g，用搅拌仪以300r/min的转速持续搅拌10h，经容器底部向加入微胶囊球水凝胶的混合溶液中以喷雾进入的形式加入10ml 1mol/L的HEPES溶液，HEPES溶液加入完毕后经容器底部通入二氧化碳气体5min，微胶囊球水凝胶进行团聚絮凝，形成酶-磷脂微囊，以喷雾形式加入分散液，可以获得更好的分散效果，分散得到的酶-磷脂微囊粒径减小，表面效应显著增大；
步骤三：取粒径为0.3mm的壳聚糖颗粒充分溶解于2mol/L的盐酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性后喷雾干燥，向干燥后的壳聚糖中加入氯仿溶液至浓度为5％，通入氮气将氯仿吹干，加入10mL 0.03mol/L的戊二醛溶液在35℃的温度下反应12h，然后水洗至溶液中无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；
步骤四：取步骤三中得到的改性壳聚糖用95％浓度的乙醇溶液溶胀，加入步骤二中得到的酶-磷脂微囊，在16℃下振荡30min，真空干燥，得到表面附有保护膜的酶-磷脂微囊，保护膜为半透膜，在保护酶-磷脂微囊强度的同时，便于酶的活性研究，冷冻干燥后，置于5℃的环境保存。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
步骤一：按照质量比2:1的比例取溶血磷脂和喜树碱至容器中混合，将摩尔比为5:1的乙醇-氯仿混合溶液加热至40℃倒入容器中，倒入过程中持续搅拌，混合均匀后静置反应10min，然后将容器中抽真空，通入电流，通过正负电荷的吸引发生瞬时凝胶化，得到微胶囊球水凝胶；
步骤二：取10mL浓度为0.8g/ml酶液，加入10ml 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀后在室温下静置3h，然后分别加入3mL 20mol/L的海藻酸钠和5mL 25mol/L的氯化钙溶液，恒温振荡15min，待冷却至室温后加入步骤一得到的微胶囊球水凝胶150g，用搅拌仪以300r/min的转速持续搅拌10h，分散得到酶-磷脂微囊；
步骤三：取粒径为0.3mm的壳聚糖颗粒充分溶解于2mol/L的盐酸溶液中，中和至中性后喷雾干燥，向干燥后的壳聚糖中加入氯仿溶液至浓度为5％，通入氮气将氯仿吹干，加入10mL 0.03mol/L的戊二醛溶液在35℃的温度下反应12h，然后水洗至溶液中无戊二醛残留，喷雾干燥得到改性壳聚糖；
步骤四：取步骤三中得到的改性壳聚糖用95％浓度的乙醇溶液溶胀，加入步骤二中得到的酶-磷脂微囊，在14-16℃下振荡30min，真空干燥，得到表面附有保护膜的酶-磷脂微囊；
所述步骤二中的分散具体操作为：经容器底部向加入微胶囊球水凝胶的混合溶液中以喷雾进入的形式加入10ml 1mol/L的HEPES溶液，HEPES溶液加入完毕后经容器底部通入二氧化碳气体5min，微胶囊球水凝胶进行团聚絮凝，形成酶-磷脂微囊，以喷雾形式加入分散液，可以获得更好的分散效果；
所述喜树碱为10-羟基喜树碱；
所述步骤二中恒温振荡是以45-50℃的温度，振荡频率为2kHz进行恒温振荡处理。
2.根据权利要求1所述的一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，其特征在于，所述步骤三中中和至中性采用的是1mol/L的氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，其特征在于，所述步骤四中附在酶-磷脂微囊表面的保护膜为半透膜。
4.根据权利要求1所述的一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法，其特征在于，所述制得的酶-磷脂微囊保存条件为：冷冻干燥后，置于4±1℃的环境保存。
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