CN102552983B - 预防和治疗骨感染的载生物酶磷酸钙骨水泥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体地说涉及一种具有控释作用的载生物酶磷酸钙骨水泥及其制备方法。本发明公开的制剂组成及其重量百分含量包括磷酸钙骨水泥基质25～90％，生物酶复合物0.001～50％和固化液5～50％。本发明公开的载生物酶磷酸钙骨水泥制剂在刚植入时，具有抗菌作用的生物酶有一突释，而后稳定释放，使其既具有骨缺损填充修复作用，又具有预防和治疗细菌感染效果，可用于慢性骨髓炎治疗、植入部位感染预防以及骨肿瘤切除后的复发预防。

Description

预防和治疗骨感染的载生物酶磷酸钙骨水泥及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂领域，具体地说涉及一种具有控释作用的载生物酶磷酸钙骨水泥及其制备方法。

背景技术

由于外伤、肿瘤等原因引起的骨缺损是临床治疗的棘手问题。而植入部位的无菌状态是植骨成功的前提和关键。临床研究表明：若待植入部位感染，则治疗效果不佳，尤其是对于骨科大中型手术，一旦发生感染，病人的死亡率提高、住院时间延长和住院费用大幅增加。由于抗生素的不合理应用，耐药菌在临床上逐渐增多。近几年来，国内外新型抗菌药物的研究热点已开始转向具有独特杀菌活性的生物工程酶类如溶葡萄球菌酶和溶菌酶。溶葡萄球菌酶是Staphylococus Simulans葡萄球菌分泌于胞外的蛋白产物，分子量为27kDa，含246个氨基酸，是一种肽链内切酶，等电点为10.4～11.4，生理条件下带正电荷。该酶可切断葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽键桥结构，从而达到迅速溶解并杀死细菌的目的。即使是耐药性金黄色葡萄球菌，MRSA及“超级细菌”，溶葡萄球菌酶也同样有很强的杀菌作用，而且不容易诱导产生耐药菌株，且具有良好的生物相容性。溶菌酶(lysozyme)是一类能使细菌、酰胺酵母菌或霉菌细胞壁溶解，导致微生物死亡的溶菌因子，等电点为10.7-11.0。革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖(Peptidoglycan)等多糖和小分子肽蛋白组成，在细胞壁的网状结构中糖苷键和肽键是其主要的连接键。溶菌酶可通过水解细胞壁和外膜层中肽聚糖的糖苷键(N-乙酰胞壁酸C-1与N-乙酰葡萄糖胺C-4之间的β-1，4糖苷键、肽键如D-Ala与Lys间肽键等)和酰胺键(如N-乙酰壁酸与Ala间酰胺键等)，使细菌细胞壁网状结构破坏，细胞壁溶解而死亡。

磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是一种可生物降解的载体材料，也是目前唯一能自固化并能产生骨再生效果的骨修复植入材料。它是一类以各种磷酸钙盐为主要成份，使用时加入固化液，在生理条件下具有自固化能力、降解活性及成骨活性的无机材料。亦有报道将其作为生物大分子多肽药物缓释载体携载如重组骨形态发生蛋白2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)以促进骨再生及愈合。但是若将大分子的生物酶直接加入CPC中，发现由于CPC降解过慢，同时与生物酶具有高度的亲和力，使得生物酶的释放速度相当缓慢，不利于生物酶抑杀菌活性发挥。因此寻找一种可以充分释放药物，具有前期快速后期持久释放生物酶的具有控释作用的载生物酶磷酸钙骨水泥制剂是本发明需要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种可以控制释放的载生物酶磷酸钙骨水泥，以克服现有的磷酸钙骨水泥制剂的缺陷。

本发明需要解决的技术问题之二是提供上述栽生物酶磷酸钙骨水泥的制备方法。

本发明的构思是这样的：

若将生物酶直接或与其他材料复合后加入磷酸钙骨水泥中，其释放速率非常慢，达不到其有效杀菌浓度，而且在磷酸钙骨水泥固化过程中会导致生物酶的酶活性大量损失。因此将生物酶以真空吸附的方式载入固化后的磷酸钙骨水泥可以避免生物酶的失活。但是单独的生物酶被吸附后非常容易从骨水泥中泄露出来，无法在骨水泥植入部位起到持续的抑杀菌作用。

海藻酸钠是来源于褐藻的亲水性胶态阴离子多聚糖，是由不同数量的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸以不同组成形成的线性高分子聚合物，具有与多价阳离子形成凝胶的特性，能使药物、生长因子、细胞等与其顺利结合并可较好地保持它们的生物活性，为一种理想的组织工程支架材料。它可在体内缓慢吸收，具有化学稳定性、低毒性、低热源性和免疫性等。

本发明将以含钙离子的溶液作为固化液，制备磷酸钙骨水泥，将带正电荷的溶葡萄球菌酶和溶菌酶与带有阴离子的海藻酸钠经正负电荷相互作用形成海藻酸钠-生物酶复合物并以真空吸附方式吸入骨水泥中，其中的海藻酸钠可与骨水泥中的游离态钙离子相互作用使得海藻酸钠-生物酶结合在骨水泥的孔隙中，从而得到一种刚植入时有一突释，而后稳定释放，起长效控释杀菌效果的载生物酶磷酸钙骨水泥，使其既具有骨缺损填充修复作用，又具有预防和治疗细菌感染效果，可用于慢性骨髓炎治疗、植入部位感染预防以及骨肿瘤切除后的复发预防。

本发明的技术方案如下：

一种预防和治疗骨感染的载生物酶磷酸钙骨水泥，以重量百分比计，其组分包括磷酸钙骨水泥基质25～90％，生物酶复合物0.001～50％和固化液5～50％。

所述的磷酸钙骨水泥基质为致密磷酸钙骨水泥基质或多孔磷酸钙骨水泥基质中的一种。

所述的生物酶复合物为海藻酸钠与生物酶复合形成的微粒，海藻酸钠与生物酶的重量比为0.03∶(0.001～0.5)；生物酶为溶葡萄球菌酶和/或溶菌酶。

所述的固化液为含有游离钙离子的水溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液中的一种或以上。

所述的致密磷酸钙骨水泥基质为磷酸钙、磷酸四钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、羟基磷灰石、氟磷灰石、焦磷酸钙中的一种或以上。

为了增加骨水泥的韧性和利于成骨细胞贴附生长，所述的致密磷酸钙骨水泥基质中还可含有0～50％的生物材料，所述的生物材料为明胶、胶原蛋白、硫酸软骨素、海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物中的一种或以上。

所述的多孔磷酸钙骨水泥基质由致密磷酸钙骨水泥基质和致孔剂组成，其重量比为100∶(0.1～100)。所述的致孔剂包括固体石蜡或发泡剂，发泡剂为碱式盐碳酸氢钠、碳酸钠和酸式盐柠檬酸、酒石酸中的一种或以上。

一种载生物酶磷酸钙骨水泥的制备方法包括如下步骤：

1)海藻酸钠-生物酶复合物混悬液的制备

取生物酶加水溶解，另取海藻酸钠加水溶解。两者混合，得海藻酸钠-生物酶复合物混悬液。

2)磷酸钙骨水泥的制备

(1)致密磷酸钙骨水泥制备：将配方量的骨水泥基质混合，加入固化液，调和，将所得糊状物置于模具中，脱模后固化，得到致密磷酸钙骨水泥。

(2)多孔磷酸钙骨水泥制备：将配方量的骨水泥基质混合，加入固化液，调和，将所得糊状物置于模具中，脱模后固化，放入有机溶剂中，取出干燥得到多孔磷酸钙骨水泥。

3)载生物酶磷酸钙骨水泥的制备

将磷酸钙骨水泥浸泡入海藻酸钠-生物酶复合物混悬液中，吸附，干燥，得到载生物酶磷酸钙骨水泥。

具体实施方式

实施例1载溶葡萄球菌酶磷酸钙骨水泥的制备

1)海藻酸钠-溶葡萄球菌酶复合物混悬液的制备

取溶葡萄球菌酶0.1g加1ml水溶解。另取海藻酸钠0.1g加入10ml水溶解。1ml的溶葡萄球菌酶溶液与1ml的海藻酸钠溶液混合搅拌，得海藻酸钠-溶葡萄球菌酶复合物混悬液。

2)磷酸钙骨水泥的制备

将57mg磷酸三钙与43mg磷酸氢钙粉末均匀混合，并加入30μl氯化钙水溶液(10％)，调和搅拌均匀，将所得糊状物置于模具中，脱模后，置于37℃，100％相对湿度下充分固化24h，得到磷酸钙骨水泥。

3)载溶葡萄球菌酶磷酸钙骨水泥的制备

将步骤2)所得磷酸钙骨水泥浸泡入步骤1)的海藻酸钠-溶葡萄球菌酶复合物混悬液中，真空吸附，冷冻干燥，得到载溶葡萄球菌酶磷酸钙骨水泥。

实施例2载溶菌酶磷酸钙骨水泥的制备

1)海藻酸钠-溶菌酶复合物混悬液的制备取溶菌酶0.1g加1ml水溶解。另取海藻酸钠0.1g加入10ml水溶解。1ml的溶葡萄球菌酶溶液与1ml的海藻酸钠溶液混合搅拌，得海藻酸钠-溶菌酶复合物混悬液。

2)多孔磷酸钙骨水泥的制备

将57mg磷酸三钙，43mg磷酸氢钙粉末和10mg固体石蜡(过40目筛)均匀混合，并加入30μl氯化钙水溶液(10％)，调和搅拌均匀，将所得糊状物置于模具中，脱模后，置于37℃，100％相对湿度下充分固化24h，放入无水乙醇中12h，70℃，不断更换无水乙醇，取出放在烘箱中干燥得到多孔磷酸钙骨水泥。

3)载溶菌酶磷酸钙骨水泥

将步骤2)所得多孔磷酸钙骨水泥浸泡入步骤1)所得海藻酸钠-溶菌酶复合物混悬液中，真空吸附，冷冻干燥，得到载溶菌酶磷酸钙骨水泥。

Claims (2)

1.一种预防和治疗骨感染的载生物酶磷酸钙骨水泥，其特征在于，以重量百分比计，其组成包括磷酸钙骨水泥基质25～90％，生物酶复合物0.001～50％和固化液5～50％；

所述的磷酸钙骨水泥基质为多孔磷酸钙骨水泥基质中的一种，所述的生物酶复合物为海藻酸钠与生物酶复合形成的微粒，海藻酸钠与生物酶的重量比为0.03∶(0.001～0.5)；生物酶为溶葡萄球菌酶和/或溶菌酶；

所述的多孔磷酸钙骨水泥基质由致密磷酸钙骨水泥基质和致孔剂组成，其重量比为100∶(0.1～100)，所述的致孔剂为固体石蜡。

2.如权利要求1所述的载生物酶磷酸钙骨水泥，其特征在于，所述的固化液为含有游离钙离子的水溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液中的一种或以上。