CN103965510B - 可控释放大分子蛋白的骨水泥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可控释放大分子蛋白的骨水泥及其制备方法，包括如下重量百分比的组分：（1）固体粉末10～50%，（2）活性蛋白0.001～5%，液体固化剂45～85%，本发明的骨水泥可以缓释大部分蛋白，从而能够达到治疗的目的。

Description

可控释放大分子蛋白的骨水泥及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种载蛋白并且可控释放大分子蛋白的骨水泥及其制备方法，具体涉及一种载蛋白并且可控释放大分子蛋白的羟基磷灰石/壳聚糖骨水泥及其制备方法。

背景技术

由于外伤、肿瘤等原因引起的骨缺损是临床治疗的棘手问题。由于自体骨和异体骨替代都存在各种各样的问题。骨水泥治疗上述骨缺损成为了目前研究的主要内容。骨水泥是一种可生物降解的载体材料，也是能自固化并能产生骨再生效果的骨修复植入材料。它是一类以各种钙盐为主要成份，使用时加入液体固化剂，在生理条件下具有自固化能力、降解活性及成骨活性的材料。

以骨水泥为药物的控制释放载体是一新兴的研究领域，已在医学、生物、领域广泛研究。它的应用解决了传统的周期性给药方式所产生的受药体系内药物浓度忽高忽低、易产生毒副作用、药物半衰期短和利用效率低等问题,使药物在受药体系内长期维持有效浓度。

但是由于药物被置于骨水泥固化环境中，它有可能直接参与水化反应从而对固化过程产生影响，因此这类体系仅限于对固化过程和材料性能的影响小并在固化环境中能保持活性的药物，如消炎痛(indomethacin)[Otsuka M，Matsuda Y，Wang Z，et a1．Effect ofsodium bicarbonate amount on in vitro indomethacin release from self-settingcarbonated-apatite cement．Pharm Res，1997，14(4),，P:444—449]、万古霉素(vancomycin)[ChowLC.Development of self-setting calcium phosphatecements.Journal of the Ceramic Society of Japan.1991,99(10)P:954]等。依据文献报道，载药2%和5%吲哚美辛的磷酸钙骨水泥，释放95%药物时间分别是170h和390h，含1%万古霉素的磷酸钙骨水泥在磷酸盐缓冲液中的药物有效释放持续2周，而含5%万古霉素的磷酸钙骨水泥药物有效释放持续9周。

而载入的药物对固化过程和材料性能影响较大的，则可以通过把药物粉末压片后包埋在材料浆体中，形成非均相的骨水泥结构。这种方法对所使用的药物的条件相对不太苛刻，这使得那些对骨水泥固化产生不利影响的药物的包埋成为可能，比如巯嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)[Otsuka M,Matsuda Y,Suwa Y,et al.A novel skeletal drugdelivery system using a self-setting calcium phosphate cement.5.Drug releasebehavior from a heterogeneous drug-loaded cement containing an anticancerdrug.J Pharm Sci.1994,83(11),P:1565-1568.]、阿司匹林(aspirin)[Otsuka M,MatsudaY,Suwa Y,et al.A novel skeletal drug-delivery system using self-settingcalcium phosphate cement.4.Effects of the mixing solution volume on the drug-release rate of heterogeneous aspirin-loaded cement.J Pharm Sci.1994,83(2),P:259-263.]。据文献报道，5%巯基嘌呤在50h和570h时分别释放了28%mg和68%mg。，载药5%阿司匹林的磷酸钙骨水泥，其释放50%药物时间为45~70h。

亦有报道将骨水泥作为生物大分子蛋白、多肽药物的缓释载体，如重组骨形态发生蛋白2(BMP-2)[RuhePQ，Kroese-De utman HC，Wolke JG，et a1．Bone inductiveproperties ofrhBMP-2loaded porous calcium phosphate cement implants incranial defects in rabbits.Biormterials，2004，25(11)，P:2123-2132]、血管内皮生长因子(VEGF)[卢向东，张建平，刘强等，.珊瑚羟基磷灰石结合血管内皮细胞生长因子修复兔骨缺损的实验研究，中国药物与临床，2005，5(2)，P:95-97.]等，据文献报道，BMP-2在4周内累积释放了9.7±0.9%，VEGF在10周内累积释放15.3%。蛋白大分子可以在很长的一段时间内缓释，以促进骨再生及愈合。但是羟基磷灰石与蛋白具有极高的亲和力，加之骨水泥降解缓慢，这就使得蛋白类药物难以释放，不利于蛋白类大分子药物活性作用的发挥，同时将大分子的蛋白类药物直接加入骨水泥中固化成型，由于骨水泥的固化对蛋白活性产生影响。近年来国内外研究者以解决上述问题开发的可缓释蛋白类大分子的骨水泥，大都采用各种高分子材料对蛋白类药物进行包覆，如用PLGA包覆BMP-2[P.Q.Ruhe,E.L.Hedberg,N.T.Padron,P.H.Spauwen,J.A.Jansen,A.G.Mikos,rhBMP-2release from injectablepoly(DL-lactic-co-glycolic acid)/calcium-phosphate cement composites,J.BoneJt.Surg.2003，85，P:75-82].，包覆后的颗粒再加入骨水泥中进行固化。这种方法的确解决了固化过程对蛋白活性的影响问题，但蛋白类药物难以缓释的问题仍难以解决。如上述文献中报道的，将PLGA包覆的BMP-2载入骨水泥中，28天累积释放了3.1%。

本发明的研究者倾向用壳聚糖包覆在羟基磷灰石表面，以降低羟基磷灰石与蛋白之间的相互作用力，以提高蛋白的释放速度。羟基磷灰石(HA)是组成骨矿物质的主要成分，是骨修复与重建的良好载体，植入体内后可与周围骨组织发生骨整合。壳聚糖(CS)具有良好的生物相容性，植入体内很少引发异物反应，能促进创伤愈合，并具有一定的降解性能和抗菌性能。在我们的先期研究和查阅以往文献，可以通过共沉淀法合成了纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-羟基磷灰石/壳聚糖)复合材料，其中n-HA是类骨磷灰石的弱结晶纳米晶体，晶格中有少量壳聚糖存在，复合材料中两相间分散均匀，结合牢固,可满足作为骨水泥原料的要求。

目前已有许多研究证实，利用羟基磷灰石/壳聚糖复合材料作为填充物应用在骨组织中是可行的。同时研究表明天然的羟基磷灰石颗粒表面具有较高的生物活性，与壳聚糖复合后植入体内更有利于其活性基团与生物自体组织相互作用，并且在缺损区形成一个高钙、磷离子浓度的环境，促进蛋白、骨组织细胞等在材料表面附着，有诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化并促进其增殖的潜能，有利于新骨的形成和改建。

例如袁华等人[天然羟基磷灰石-壳聚糖复合材料修复骨缺损的实验研究，口腔医学，2005，25(2)，P:65-67]使用ZnO作为碱性剂与固化羟基磷灰石混合，壳聚糖与酸性液体固化剂混合制备含壳聚糖的羟基磷灰石复合材料植入兔胫骨缺损处，复合材料在植入区固位稳定，交界处可见肉芽组织。术后4～8周，复合材料与自体骨的结合更为紧密，切开可见复合材料与骨之间有骨痂形成。复合材料植入后8～12周，可见包裹的结缔组织逐渐变薄，骨组织由四周边缘进一步长入，部分区域已形成骨性连接。在材料与骨髓相邻一侧可见成骨细胞，并有条带状类骨质形成。对照组的骨缺损区缩小但仍被纤维结缔组织充满。许勇等人[可注射性纳米羟基磷灰石、壳聚糖复合材料修复骨缺损的实验研究中国临床解剖学杂志,2009,27(6),P:712-715]，使用共沉淀法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖颗粒，且将颗粒的悬浊液注射进入新西兰大白兔的骨缺损中；实验发现颗粒组成的胶状物具有良好的骨传导作用，良好的成骨作用和骨诱导作用。同时，材料植入后4周,新骨新生的同时，即有材料的部分降解，植入后12周后，扫描电镜观察到材料已绝大部分降解，骨缺损部位完全被板层骨所替代。显示出了该材料在骨修复过程中其降解时间和新生骨的形成时间之间存在良好的匹配。刘阳等人[可注射性n-HA/CS-BMSCs复合物修复兔股骨缺损的实验研究,中国临床解剖学杂志,2010,28(4),P：421-416]在许勇等人的实验基础上把成骨细胞添加在羟基磷灰石/壳聚糖的悬浊液中，进行骨缺损填充实验。其结果同样证明了这种复合材料的良好的成骨性和生物相容性。

但是上述文章中提到的骨修复材料仍有这样那样的问题，例如，如果用袁华等人制备的人工骨作为蛋白载体，固化过程会使蛋白失活，不能释放出具有活性的蛋白；许勇和刘洋等人制备的填充物是悬浊液或凝胶不经过固化直接使用，由于没有固化过程，蛋白可以直接释放，基本没有缓释效果，这种悬浊液也不适合作为蛋白的载体。因此开发一种可以充分释放蛋白类大分子药物，且具有缓释、控释作用的载生物蛋白骨水泥制剂，是本领域迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种可控释放大分子蛋白的骨水泥及其制备方法，以克服现有的骨水泥制剂难以缓释大分子蛋白的缺陷。

本发明所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥，包括如下重量百分比的组分：

（1）固体粉末 10～50%

（2）活性蛋白 0.001～5%

（3）液体固化剂 45～85%

其中：

（1）所述的固体粉末包括如下重量百分比的组分：

骨水泥基质 50～90％

固体固化助剂 10～50%

所述的骨水泥基质为共沉淀法制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖粉末；

其中：

所述的共沉淀法，可参见张利等人[纳米羟基磷灰石／壳聚糖复合骨修复材料的制备及其性能表征,功能材料，2005,36（3），P:441-445]的文献的报道；

羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为90:10～50:50；

所述的固体固化助剂为氢氧化钙或氧化钙中的一种以上；

所述的固体粉末中还可以加入占固体粉末总重量1~10%发泡剂以制备大孔径骨水泥；

所述的发泡剂为碳酸盐或碳酸氢盐中的一种以上，优选碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾；

所述固体粉末是由骨水泥基质和固体固化助剂等按比例混合后，经过粉碎、过筛的步骤制备得到；

（2）所述的活性蛋白为大分子蛋白药物。例如生长因子类药物：BMP系列，VEGF等；肿瘤抑制类药物：凋亡素，trail蛋白等；细菌抑制类药物：溶菌酶，溶葡萄球菌酶等；

（3）所述液体固化剂由如下重量百分比的组分组成：

有机酸 1～20%

液体固化助剂 0.5～10%

水 余量。

所述有机酸包括醋酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸或草酸中的一种以上；

所述的液体固化助剂是可溶性磷酸氢二盐或可溶性钙盐，包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸氢二钙或氯化钙中的一种以上；

所述的液体固化剂还可以加入占液体固化剂总重量0.1~1%的辅助发泡剂，以加强发泡效果，以制备孔径均匀的大孔径骨水泥；

所述的辅助发泡剂是非离子型表面活性剂，包括聚山梨酯(Tween)，长链脂肪酸酯，脂肪醇酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA),聚维酮(PVP)中的一种以上。

所述的液体固化剂中还可加入加入占液体固化剂总重量0.1~1%功能助剂，以增加骨水泥的韧性或利于细胞贴附生长；

所述的功能助剂是人体或动物骨骼中的蛋白或多糖，包括明胶、胶原蛋白、硫酸软骨素或壳聚糖及其衍生物中的一种以上；

所述液体固化剂的制备方法，为简单的物理混合方法，将各个组分混合即可；

所述可控释放大分子蛋白的骨水泥的制备方法，包括如下步骤：

1）固体粉末的制备

（a）羟基磷灰石/壳聚糖复合材料粉末的制备，可参见吕彩霞等人[羟基磷灰石／壳聚糖复合材料研究进展，化工进展，2006，25(7),P:755-760]或王新等人[纳米羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架的研究,中国修复重建外科杂志,2007,21(2),P:120-126]或张利等人[纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨修复材料的制备及其性能表征,功能材料，2005,36（3），P:441-445]的文献报道。其中羟基磷灰石与壳聚糖的重量比为1∶1～9:1；

（b）羟基磷灰石/壳聚糖粉末、固体固化助剂等按比例混合后，经过粉碎、过筛得到固体粉末。

2）液体固化剂的制备

将有机酸、液体固化助剂等分别溶于水中，按比例混合，得到液体固化剂。

3）载蛋白骨水泥的制备：

将固体粉末与活性蛋白混合，在使用时加入液体固化剂，搅拌混合，即可获得所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥；

本发明可以载入抑菌蛋白用于骨感染的预防和治疗；可以载入抑制肿瘤的蛋白用于植入部位肿瘤的治疗；可以载入生长因子进行骨填充治疗等。使用时需要根据不同蛋白的需求计量确定加入蛋白的重量。可控释放大分子蛋白的骨水泥可以直接填补在骨缺损部位，也可以按照一定的形状以模具固化后再填入；大孔径可控释放大分子蛋白的骨水泥可以直接用注射器注射到缺损部位。

本发明以羟基磷灰石/壳聚糖复合材料为原料，并选用合适的固体、液体固化剂，按照适当的固液比进行调和，制备的一种在空气、生理盐水、血液或体液中均可快速固化，同时可控释放大分子蛋白的羟基磷灰石/壳聚糖复合骨水泥，以克服现有的骨水泥制剂难以缓释大分子蛋白的缺陷，同时提供上述载蛋白骨水泥的制备方法。

本发明的构思是这样的：

若将蛋白直接或由其他材料包覆后加入骨水泥中，其释放速度非常缓慢，而且在骨水泥固化过程中会导致蛋白活性损失。因此选择恰当的骨水泥的组成成分以增加蛋白的释放速度和选择恰当的骨水泥的固化方式以避免蛋白失活是本发明的关键。

骨水泥的成份主要分为固体粉末，活性蛋白和液体固化剂。固体粉末包括：骨水泥基质和固体固化助剂等；液体固化剂是包括有机酸，液体固化助剂等的混合溶液。本发明的骨水泥基质选择共沉淀法合成的纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HA/CS)复合材料，其中纳米羟基磷灰石是类骨磷灰石的弱结晶纳米晶体，晶格中有少量壳聚糖存在，复合材料中两相间分散均匀，结合牢固,可满足作为骨水泥原料的要求。同时，由共沉淀法合成的纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料可以把壳聚糖包覆在羟基磷灰石表面，以降低羟基磷灰石与蛋白之间的相互作用力，使载蛋白的骨水泥在固化后仍有较快的释放速度。骨水泥的固体固化助剂选择CaO、Ca(OH)2粉末，CaO、Ca(OH)₂是碱性化合物，微溶于水，其在水中的溶解度低，在高聚物中具有较好的分散性。与酸性液体固化剂中的氢离子发生较缓慢的中和反应，反应强度低，不易发热容易保证蛋白活性。在骨水泥基质与固体固化助剂的混合粉末中加入一定量液体固化剂并进行调和时，弱碱性的固体固化助剂会与酸性液体固化剂发生中和反应，但由于其反应速度较慢，不会在短时间内抢夺大量的氢离子，这样发泡剂可以在酸性条件下发泡，而且复合材料中的一部分壳聚糖会溶解形成高粘度混合物流体，使材料在一定时间内具有可任意塑型。这使得骨水泥填充骨缺损，尤其是不规则的骨缺损以及粉碎性骨折提供了可能。随着时间的延长，混合体中的固体固化助剂会继续与液体固化剂中的氢离子反应，直到氢离子耗尽，随着调和物的PH值不断上升，混合体中溶解的壳聚糖析出，壳聚糖鳌合二价金属阳离子。含Ca²+与壳聚糖的氨基发生螯合反应，以壳聚糖与Ca²+的配位体形式存在，形成稳定的网格结构，材料由塑性体转变为弹性体。这时的骨水泥初凝，外形不能随意变换。最终酸碱反应结束后，整体骨水泥呈碱性，液体固化助剂与固体固化助剂在碱性条件下缓慢反应形成羟基磷灰石等固体，最终形成结合牢固的骨水泥。这种骨水泥可以缓释大部分蛋白，从而可以达到极好的治疗效果。

附图说明

图1是载各种蛋白的骨水泥累计释放曲线。

图2是载葡萄球菌酶骨水泥累计释放曲线。

图3是样品5MTS测定MC3T3细胞增殖结果。

具体实施方式

实施例中，如无特别说明，均为重量百分比。

实施例1纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备

纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备：

按照羟基磷灰石的化学计量比Ca/P=1.67称取Ca(OH)₂和H₃PO₄，并将Ca(OH)₂溶于乙醇中配成5wt％的悬浮液，简称A液；

将浓磷酸稀释为10wt％的水溶液；然后称取壳聚糖粉末，并将其溶于2wt％的醋酸水溶液中．连续搅拌5个小时，过滤得到完全透明的3wt％壳聚糖溶液。将配好的磷酸溶液倾入CS溶液中，搅拌，得到B液；

制备羟基磷灰石和壳聚糖重量比分别为80/20（样品1），70/30（样品2），60/40（样品3），50/50（样品4），的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。整个反应在室温下进行，在搅拌条件下将B液滴入A液中，滴加速度4ml/min．加入重量浓度为10%的氨水，控制过程pH值维持在10左右。

滴加完毕，继续搅拌24小时，所得浆料于室温下陈化一天．将沉淀过滤，洗涤，于80℃真空烘干，并研磨成粉，获得羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。

实施例2纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备

纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备：

按照羟基磷灰石的化学计量比Ca/P=1.67称取Ca(NO₃)₂和Na₃PO₄，并将Ca(NO₃)₂溶于水中配成5wt％的溶液，简称A液；

然后称取CS粉末，并将其溶于1wt％的醋酸水溶液中．搅拌、过滤得到完全透明的2wt％CS溶液。将配好的溶液A倾入CS溶液中，搅拌，得到B液。

将磷酸钠溶解在水中配成10wt％的水溶液，简称C液；

制备羟基磷灰石与CS重量比为80/20（样品5）的纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。

整个反应在65℃下进行，在搅拌条件下将B液滴入C液中，采用加入重量浓度为10%的氨水的方法，控制PH值，使PH值=9。

滴加完毕，保温搅拌16小时，所得浆料于65℃下水化24小时。过滤、洗涤，沉淀置于65℃真空烘干，并研磨成粉，获得羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。

实施例3骨水泥的制备

固体粉末的制备：

羟基磷灰石/壳聚糖粉末1g，加入0.14g氧化钙粉末，混合、研磨、过80目筛得到固体粉末。

液体固化剂的制备：

称取柠檬酸、醋酸、氯化钙、磷酸二氢钠，分别溶于水中，使柠檬酸、醋酸、磷酸二氢钠的重量浓度控制在10％，氯化钙重量浓度为5％，再按照体积比4∶4∶1∶1加以混合，可以得到液体固化剂。

载溶菌酶骨水泥的制备：

称取固体粉末粉末1g，加入溶菌酶100mg(20000u/mg)，混合均匀，再加入1.6mL液体固化剂，搅拌混匀后加入模具后固化成型。

实施例4可注射骨水泥的制备

固体粉末的制备：

羟基磷灰石/壳聚糖粉末1g，加入0.18g氢氧化钙、0.05g碳酸氢钠粉末，混合、研磨、过80目筛，得到固体粉末

液体固化剂的制备：

配置柠檬浓度4％，醋酸浓度4.5％，磷酸二氢钠浓度2％，氯化钙浓度1％，泊洛沙姆浓度0.5％，壳聚糖浓度0.25％，的液体固化剂溶液，溶剂为蒸馏水。

载溶葡萄球菌酶骨水泥的制备：

称取固体粉末1g，加入溶葡萄球菌酶2mg(500U/mg)，混合均匀后加入液体固化剂1.6mL，搅拌混匀后加入模具后固化成型。

可注射骨水泥的制备：

稀释液体固化剂1.5倍，调整加入的液体固化剂为2.4mL，制备方法同上，制得骨水泥可通过16#针头注射。

实施例5载BMP-2蛋白骨水泥的制备

固体粉末的制备：

羟基磷灰石/壳聚糖粉末1g，加入0.43g氢氧化钙、0.05g碳酸氢钠、0.05g碳酸钠、0.05g碳酸钙粉末，混合、研磨、过80目筛，得到固体粉末。

液体固化剂的制备：

配置柠檬浓度4％，醋酸浓度8.5％，磷酸二氢钠浓度2％，氯化钙浓度1％，聚乙烯醇浓度0.25％，明胶浓度1％，的液体固化剂溶液，溶剂为蒸馏水。

载溶BMP-2水泥的制备：

称取固体粉末1g，加入BMP-210mg，混合均匀后加入液体固化剂2mL，搅拌混匀后加入模具后固化成型。

可注射骨水泥的制备：

稀释液体固化剂1.2倍，调整加入的液体固化剂为2.4mL，制备方法同上，制得骨水泥可通过16#针头注射。

实施例6载蛋白骨水泥的制备

固体粉末的制备：

称取羟基磷灰石/壳聚糖粉末1g，加入氢氧化钙0.5g、碳酸钠粉末0.1g，混合、研磨、过80目筛，得到固体粉末。

液体固化剂的制备：

配置柠檬浓度8％，醋酸浓度8.5％，磷酸二氢钠浓度1％，氯化钙浓度1％，聚乙烯醇浓度0.5％的液体固化剂溶液，溶剂为蒸馏水。

载蛋白骨水泥的制备：

称取固体粉末1g和活性蛋白1mg，混合均匀后加入1.6mL液体固化剂，搅拌混匀加入模具后固化成型。

加入的活性蛋白包括，生长因子类蛋白：BMP-2（样品6）、VEGF（样品7）、酪蛋白（样品8）；肿瘤抑制类蛋白：凋亡素（样品9）、TRAIL蛋白（样品10）；细菌抑制蛋白：溶菌酶（样品11）。

实施例7载蛋白骨水泥的缓释测试

将骨水泥样品6-11置于模拟体液中，一定的时间段之后分别取上清液进行HPLC检测，记录溶液的吸光值，换算得到蛋白释放的速度和释放总量。各种蛋白浓度-吸光度标准曲线由HPLC检测，HPLC检测的精密度、准确性、回收率在相关文献中查询。得到的累积释放曲线见图1（图1载各种蛋白的骨水泥累计释放曲线）。

实施例8骨水泥测试样品的制备

以实施例1、实施例2中制备的羟基磷灰石/壳聚糖粉末为骨水泥基质，以实施例4的方法制备骨水泥(样品1-5)，进行以下测试。

实施例9骨水泥材料的初凝时间与终凝时间的测定

为了能够在实际中应用骨水泥材料，骨水泥的固化时间对与其在手术中的应用有着非常重要的意义。固化时间不能太快，否则无法完成接入骨手术，因此需要保证其固化时间在10min到60min之间。由于至今尚未出现针对骨水泥材料测定凝固时间的仪器，因此我们采用测定水泥固化时间的仪器——维卡仪进行初凝和终凝时间的测定。

其结果如下

实施例10骨水泥材料扫描电镜的观察

将实施例8合成的骨水泥材料（样品1-5）制成薄片，充分干燥后，使用针孔试样表面处理机对试样的表面进行喷金处理，然后用扫描电镜对样品的表面进行形貌的观察。

其结果显示样品1-4中骨水泥致密，孔隙率较低；样品5所形成的骨水泥有较大的孔隙率，同时形成的CS-Ca²⁺螯合物，柠檬酸钙等结晶也更加明显。

实施例11骨水泥材料孔隙率的测定

首先称量充满无水乙醇(至刻度线)的烧瓶重W₁,再称干燥样品的重W_S,然后放入充分饱和了无水乙醇的样品,用枪将溢出刻度线的无水乙醇吸出后称重W₂,最后称量取出骨水泥后烧瓶重W₃。

样品的体积：Vs=[W1-(W2-WS)]/ρ乙醇

隙的体积：Vp=[W2-(W3+WS)]/ρ乙醇

骨水泥的孔隙率ε=（W2-W3-WS）/(W1-W3)

因此实施例8合成的骨水泥的孔隙率其结果如下：

实施例12载溶葡萄球菌酶骨水泥体外释放的测定：

溶葡萄球菌酶的定量检测采用比色法，以偶联KNR艳蓝染料的金黄色葡萄球菌菌体死细胞为色源底物，根据酶作用过程中定量释放的带有KNR染色基团的小分子可溶性片段产物，在除去未反应的不溶性底物后，对反应的上清液进行OD595nm测定，以测得酶的活性。

配置酶标准溶液：精确称取2.0mgsigma公司供应的溶葡萄球菌酶标准品（720ug/mg）于无菌、干燥的Eppendorf管中，经0.05mol/L Tris-HCl稀释液二次稀释，配置成0.02mg/ml溶葡萄球菌酶标准样品溶液，分装待用。

制作标准曲线：取干燥的Eppendorf管6只，分别编号并加入130μLKNR—PG底物，然后加入不同量的0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液，37℃恒温水浴2min；然后按照序号加入对应的溶葡萄球菌标准样品溶液，置于37℃恒温水浴20min。最后取出离心管，每管加入300μL95%的乙醇终止，并在10000rpm条件下离心10min。

根据测得的吸光度A值及对应的标准酶浓度C（U/ml）,绘制标准曲线A=KC+B。

其中K为标准曲线的斜率，B为标准曲线的截距，A为吸光度，C为酶的浓度（U/ml）

将实施例8合成的含有溶葡萄球菌酶的骨水泥置于模拟体液中，在一定的时间段分别取上清液进行溶葡萄球菌酶比色法活性检测，记录溶液的吸光值，换算得到酶释放的速度和释放总量。释放取下如图2（图2载葡萄球菌酶骨水泥累计释放曲线）。

实施例13细胞相容性检测测定

a)以0.2g/1ml实施例8合成的骨水泥浸提液稀释4倍与MC3T3-E1细胞共同孵育后，MTS试剂盒检测细胞存活率Cell viabilty=ODsample/ODcontrol×100。结果显示，稀释的浸提液可促进MC3T3-E1细胞的增殖。

b)将20μl1×10⁶细胞/mlMC3T3细胞接种于已预置培养基中浸泡过夜的骨水泥材料后，细胞生长状态观察：MC3T3细胞接种于骨水泥材料后，在骨水泥周围细胞生长状态良好。

c)将20μl1×10⁶细胞/mlMC3T3细胞接种于已预置培养基中浸泡过夜的骨水泥材料后三天，加入MTT试剂观察结果如图3（图3MC3T3细胞接种于骨水泥MTT结果）MTT试剂结果所示材料具有良好的生物相容性。

d)将20μl1×10⁶细胞/mlMC3T3细胞接种于已预置培养基中浸泡过夜的骨水泥材料后1天，将骨水泥固定，脱水，临界点干燥后SEM观察结果显示，MC3T3细胞接种于骨水泥上生长状态良好，细胞在骨水泥上贴壁良好。具体参见图3。

实施例14小动物相容性检测测定

皮下试验，局部注射样品5后24、48及72h实验侧及对照侧各注射点均无红肿&溃烂及渗液等情况出现#未见明显皮肤刺激症状，证明材料浸提液与生理盐水相似无刺激性。

术后动物生活良好无感染，处死动物时伤口愈合好，无红肿、溃烂及坏死形成。组织切片检查，组织结构正常无炎性细胞浸润。说明骨水泥材料与组织之间无排斥反应存在二者之间有较好的相容性。

Claims (4)

1.可控释放大分子蛋白的骨水泥，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

(1)固体粉末 10～50％

(2)活性蛋白 0.001～5％

(3)液体固化剂 45～85％

其中：

(1)所述的固体粉末包括如下重量百分比的组分：

骨水泥基质 50～90％

固体固化助剂 10～50％

所述的骨水泥基质为共沉淀法制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖粉末；

羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为90:10～50:50；

所述的固体固化助剂为氢氧化钙或氧化钙中的一种以上

所述液体固化剂由如下重量百分比的组分组成：

有机酸 1～20％

液体固化助剂 0.5～10％

水 余量

所述有机酸选自醋酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸或草酸中的一种以上；

所述液体固化助剂选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸氢二钙或氯化钙中的一种以上；

所述的液体固化剂还包括占液体固化剂总重量0.1～1％的辅助发泡剂；

所述的辅助发泡剂是非离子型表面活性剂，包括聚山梨酯，长链脂肪酸酯，脂肪醇酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚维酮中的一种以上；

所述的液体固化剂中还包括占液体固化剂总重量0.1～1％功能助剂；

所述的功能助剂是人体或动物骨骼中的蛋白或多糖；

所述活性蛋白为生长因子类药物、肿瘤抑制类药物或细菌抑制类药物。

2.根据权利要求1所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥，其特征在于，所述的固体粉末中还包括占固体粉末总重量1～10％发泡剂。

3.根据权利要求2所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥，其特征在于，所述的发泡剂为碳酸盐或碳酸氢盐中的一种以上。

4.根据权利要求1所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)固体粉末的制备，将羟基磷灰石/壳聚糖粉末、固体固化助剂按比例混合后，经过粉碎、过筛得到固体粉末；

2)液体固化剂的制备

将有机酸、液体固化助剂分别溶于水中，按比例混合，得到液体固化剂；

3)载蛋白骨水泥的制备：

将固体粉末与活性蛋白混合，在使用时加入液体固化剂，搅拌混合，即可获得所述的可控释放大分子蛋白的骨水泥。