CN102764455B - 一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物医用材料技术领域的一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料及其制备方法。此材料为由2～5wt%矿化胶原，5～15wt%万古霉素，20～25wt%二水硫酸钙，余量α型半水硫酸钙组成的复合粉体。本发明通过水热法制备了α型半水硫酸钙，生物矿化法制备了矿化胶原，并将α型半水硫酸钙、矿化胶原、万古霉素和促凝剂二水硫酸钙混合，制备具有一定组份配比的抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。此材料在液/固比为0.5～0.8mL/g时，具有良好的自固化性能，可降解、药物释放缓慢、具有抗感染性。材料具有良好的生物相容性，能促进成骨细胞的黏附、铺展。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料及其制备方法。
背景技术
近年来，因交通事故和建筑工程事故不断增加，创伤后骨髓炎发病率日益增加。创伤性骨髓炎不仅存在骨组织感染，而且多伴有骨折、骨外露、骨缺损等，治疗难度更大。目前，多采用清创、灌注冲洗等方法，待感染治愈后，再行植骨手术，治疗时间长，手术次数多，成功率低，许多患者留有肢体缩短，畸形、关节功能障碍等残疾。
将载药骨材料植入到感染性骨缺损病灶部位，不仅能完全填充骨髓炎等引起的骨缺损，而且能局部释放抗生素药物，同时起到骨修复和抗感染的双重功能。目前载药材料以不可生物降解材料PMMA 较为常用, 并已经作为万古霉素、β-内酰胺类、克林霉素、庆大霉素、妥布霉素等多种药物的载体, 显示了治疗骨髓炎的有效性。然而PMMA具有药珠释放有效药物浓度时间短、生物相容性差、不能降解，需要再次手术取出等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
本发明的目的还在于提供一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料的制备方法。
一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料，此材料为由2~5wt%矿化胶原，5~15wt%万古霉素，20~25wt%二水硫酸钙，余量α型半水硫酸钙组成的复合粉体。
上述材料与去离子水混合成浆体使用，其液/固比为0.5~0.8mL/g；固化后为多孔结构，其孔隙率为30%～40%。
一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料的制备方法，包含步骤如下：
（1）水热法制备α型半水硫酸钙：将CaSO4·2H2O，加入反应釜中，分别取占CaSO4·2H2O 质量0.25%的柠檬酸钠和硫酸铝，加入反应釜中，再加入CaSO4·2H2O质量5.67 倍的去离子水，密闭反应釜，搅拌，温度为120℃，反应6 小时；反应完毕后将反应液趁热抽虑，抽虑后用去离子沸水冲洗滤饼，整个过程中滤液和冲洗液温度在90℃以上；将抽干的滤饼放入干燥箱中100℃干燥过夜，制得α型半水硫酸钙；用研钵研磨，100 目塞子过筛，制得粒径均一的α 型半水硫酸钙粉末；
（2）矿化胶原的制备：将固含量1％的胶原蛋白溶于冰醋酸中，胶原蛋白溶液的浓度为0.67mg/ml , 然后边搅拌边分别滴加含PO4 3+和Ca2+的水溶液，加入PO4 3+的量为每克胶原蛋白0.055mol，加入的Ca2+ 与PO4 3-的摩尔比为1.66：1；调节混合溶液pH值为6～8，矿化胶原在等电点时析出，静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗，冷冻干燥，研磨得到矿化胶原粉末；
（3）将2~5wt%的矿化胶原、5~15wt%的万古霉素，20~25wt%的二水硫酸钙加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，制备抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
本发明的有益效果为：在液/固比为0.5~0.8mL/g时，上述材料具有良好的可注射性和自固化性能，可降解、药物缓慢释放、抗感染。材料具有良好的生物相容性，能促进成骨细胞的黏附铺展。
附图说明
图1抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料的药物释放曲线。
图2抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料的抑菌环直径。
图3 MC3T3-E1细胞在抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料上的伸展电镜图; （a）为MC3T3-E1细胞在矿化胶原-硫酸钙骨修复材料上；（b）为MC3T3-E1细胞在抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料上的铺展情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
水热法制备α型半水硫酸钙：将CaSO4·2H2O，加入反应釜中，分别取占CaSO4·2H2O 质量0.25%的柠檬酸钠和硫酸铝，加入反应釜中，再加入CaSO4·2H2O质量5.67 倍的去离子水，密闭反应釜，搅拌，温度为120℃，反应6 小时；反应完毕后将反应液趁热抽虑，抽虑后用去离子沸水冲洗滤饼，整过程中滤液和冲洗液温度在90℃以上；将抽干的滤饼放入干燥箱中100℃干燥过夜，制得α型半水硫酸钙；用研钵研磨，100 目塞子过筛，制得粒径均一的α型半水硫酸钙粉末。
矿化胶原的制备：将固含量1％的胶原蛋白溶于冰醋酸中，胶原蛋白溶液的浓度为0.67mg/ml , 然后边搅拌边分别滴加含PO4 3+和Ca2+的水溶液，加入PO4 3+的量为每克胶原蛋白0.055mol，加入的Ca2+ 与PO4 3-的摩尔比为1.66：1；滴加NaOH溶液至pH值为6～8， pH计测定，在pH值为5～6时开始出现沉淀, pH值为7时出现白色悬浊液；静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复清洗三次后，放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉即得矿化胶原。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按2wt%、5 wt %、20 wt%的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例2
矿化胶原和α型半水硫酸钙的制备同实施例1。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按2 wt %、10 wt %、20 wt %的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例3
矿化胶原和α型半水硫酸钙的制备同实施例1。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按2 wt %、15 wt %、20 wt %的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例4
矿化胶原和α型半水硫酸钙的制备同实施例1。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按5 wt %、5 wt %、25wt %的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例5
矿化胶原和α型半水硫酸钙的制备同实施例1。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按5 wt %、10 wt %、25 wt %的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例6
矿化胶原和α型半水硫酸钙的制备同实施例1。
将矿化胶原、万古霉素、二水硫酸钙分别按5 wt %、15 wt %、25 wt %的配比加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，得到抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
实施例7
取实施例6制备的抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料作为样品进行如下实验：
1、凝固时间的测定：
将去离子水与上述抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料按不同液/固比（0.5~0.8）mL/g混合均匀成浆体，注入高度为40mm，直径为6mm 的具内，用维卡仪按照ISO9597-1989E 测试材料终凝时间。当维卡仪的重针(350 g, Ø 2.0 mm) 自动释放，没有在水泥上留下明显可见的印记时，定义为终凝。记录终凝时间。经检测材料的终凝时间为15min~20min。
2、抗压强度的测定：
将去离子水与上述抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料按液/固比0.5mL/g混合均匀成浆体，注入高度为20mm，直径为10mm 的特氟隆模具内。将模具中固化的样品取出，制备成直径为10毫米，高度为20毫米的柱状体，置于万能材料试验机(Zwick/roell)下，进行压缩实验，压缩速率为0.5 mm/min，测试材料的抗压强度。重复测试三个试样，测试结果为平均值±标准偏差，结果如表1所示。
表1 抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料
3、体外释放实验：
将去离子水与上述抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料按液/固比0.5mL/g混合均匀成浆体，注入高度为20mm，直径为10mm 的特氟隆模具内。将模具中固化的样品取出，制备成直径为10毫米，高度为20毫米的柱状体样品。将制备的样品放入带盖的洗提瓶中，用一定体积 pH7.2 的PBS在37℃下洗提（或恒温振荡），每隔2d将洗提液取出放在-70℃下保存，并更换新鲜洗提液，测试时间点： 2d, 3d, 6d,9d, 13d, 17d。采用TU-1901双光束紫外可见分光光度计，进行溶液的定量测定，结果如图1所示，在释放第17天药物浓度为12μg/mL，高于最低抑菌浓度。
PBS溶液的配置：依次将8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO4•12H2O、0.2 g KH2PO4溶于800 mL三蒸水中，搅拌溶解，用1mol/L HCl或NaOH液调节pH值至7.0~7.2， 定容至1000 mL容量瓶中。
4、抑菌实验：
将去离子水与上述抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料按液/固比0.5mL/g混合均匀成浆体，注入高度为3mm，直径为5mm 的模具内。取金黄色葡萄球菌（S. aureus，ATCC 6538，美国）接种于培养基中，37℃培养20h后将菌液稀释为107cfu/ml，接种于培养板表面。将灭菌后样品（Ф5mm×3mm）倒置于培养板中，样品表面与细菌接触，并测量所用细菌培养板中出现的抑菌环（Zone of inhibition，ZOI）直径。结果表明材料对金黄色葡萄球菌作用5h抑菌率大于99.8%，培养18h抑菌环直径为18mm，如图2所示。
5、细胞试验：
MC3T3-E1细胞用含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素、DMEM培养基的完全培养基，置于37℃，5%CO2 孵化箱进行培养。将去离子水与上述抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料按液/固比0.5mL/g混合均匀成浆体，制成能放置到96孔板中的直径5mm和厚2mm的样品片，用60Coγ辐照灭菌，剂量16 kGy。将细胞密度调整到以1×105mL-1，每孔100μl细胞悬浮液种到96孔培养板中的已灭菌材料上。将96孔板置于37℃，5%CO2 孵化箱进行培养，每两天换一次培养液。
在37℃，5%CO2 细胞培养箱中培养24h时，在扫描电镜下观察细胞状态。 PBS冲洗2次，除去样品表面未贴壁细胞，将样品放入24孔板中，加4℃预冷的2.5%戊二醛，在4℃固定2h，吸出固定剂，然后将样品用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃预冷的1%锇酸，4℃固定1 h，PBS浸洗2次，每次10min。依次乙醇系列梯度脱水(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)、每次10min，CO2临界点干燥、喷金后，在扫描电镜SEM(LEO 1530) 10.0 kV 电压下进行观察其形貌，如图3所示，（a）为MC3T3-E1细胞在矿化胶原-硫酸钙骨修复材料上的铺展情况；（b）为MC3T3-E1细胞在抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料上的铺展情况。
Claims (2)
1.一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料，其特征在于，此材料为由2～5wt％矿化胶原，5～15wt％万古霉素，20～25wt％二水硫酸钙，余量α型半水硫酸钙组成的复合粉体；此材料与去离子水混合成浆体使用，其液/固比为0.5～0.8mL/g；固化后为多孔结构，其孔隙率为30％～40％。
2.权利要求1所述的一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料的制备方法，其特征在于，包含步骤如下：
(1)水热法制备α型半水硫酸钙：将CaSO4·2H2O，加入反应釜中，分别取占CaSO4·2H2O质量0.25％的柠檬酸钠和硫酸铝，加入反应釜中，再加入CaSO4·2H2O质量5.67倍的去离子水，密闭反应釜，搅拌，温度为120℃，反应6小时；反应完毕后将反应液趁热抽滤，抽滤后用去离子沸水冲洗滤饼，整个过程中滤液和冲洗液温度在90℃以上；将抽干的滤饼放入干燥箱中100℃干燥过夜，制得α型半水硫酸钙；用研钵研磨，100目筛子过筛，制得粒径均一的α型半水硫酸钙粉末；
(2)矿化胶原的制备：将固含量1％的胶原蛋白溶于冰醋酸中，胶原蛋白溶液的浓度为0.67mg/mL,然后边搅拌边分别滴加含PO4 3-和Ca2+的水溶液，加入PO4 3-的量为每克胶原蛋白0.055mol，加入的Ca2+与PO4 3-的摩尔比为1.66：1；调节混合溶液pH值为6～8，矿化胶原在等电点时析出，静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗，冷冻干燥，研磨得到矿化胶原粉末；
(3)将2～5wt％的矿化胶原、5～15wt％的万古霉素，20～25wt％的二水硫酸钙加入余量α型半水硫酸钙中混合均匀，制备抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料。
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