KR101391846B1

KR101391846B1 - 골유도 인산 칼슘

Info

Publication number: KR101391846B1
Application number: KR1020087022635A
Authority: KR
Inventors: 후이핀 유앤; 브뤼즌 주스트 딕 드
Original assignee: 프로젠틱스 오르토바이올로지 비. 브이.
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2014-05-19
Also published as: JP2009526600A; CA2642830A1; US20160067382A1; AU2007215625A1; EP1993624A1; AU2007215625B2; EP1993624B1; JP5201510B2; US20100034865A1; KR20090017470A; US10532131B2; US7942934B2; US20200108180A1; WO2007094672A1; US11590263B2

Abstract

본 발명은 0.1-1.50㎛의 범위의 평균 그레인 크기를 갖고, 0.1-1.50㎛의 크기 범위의 세공만으로 필수적으로 구성되는 공극률을 가지며, 10-40%의 범위의 세공의 표면적 백분율을 갖는 다공성 골유도 인산 칼슘 물질에 관한 것이다.

Description

골유도 인산 칼슘 {Osteoinductive calcium phosphates}

본 발명은 골유도 물질, 상기 물질을 제조하는 방법, 및 상기 방법으로 제조된 물질에 관한 것이다.

환자 자신의 뼈로부터 수확된 자가골은 대형 골 결함을 회복시키는 데 황금 표준(gold standard)의 뼈 대체물이다. 그러나, 한 환자로부터의 수확가능한 자가골의 양은 한정되어 있고 골 추출 자체로서 상당한 건강상의 위험을 내포하며 잔존하는 골조직의 구조적 완전성(structural integrity)의 상실을 가져온다.

조직 공학의 발전은 합성 이식물, 예를 들어 골세포의 부착, 새로운 골조직의 내부성장 및 후속적인 새 골광물(bone minerals)의 침착을 가능하게 하는 골격 물질의 형태로서 합성 이식물을 제공하였다. 상기 합성 물질은 이식 전에 생체 외(ex vivo)로 골세포와 함께 접목되거나 또는 골세포를 주변으로부터 이식 부위로 인도하는 맨 골격으로 이식될 수 있다.

조직 공학의 최근 발전은 다양한 값진 골격 물질을 생성하였다. 수산화인회석(hydroxyapatite, HA; 뼈의 광물상), 이성상 인산 칼슘 (BCP) 및 α- 또는 β-인산삼칼슘 (TCP)와 같은 인산 칼슘은 골전도(osteoconductive)(생활성)뿐만 아니라 골유도 특성을 가지며, 매우 적합한 골격 물질을 제공하는 것으로 알려져 있다. 인산 칼슘의 생활성적인 성질은 골격의 표면에서 새로운 광물질의 침착을 통해 골형성 세포에 의한 새로운 뼈 형성을 위한 주형으로서 기능을 하도록 하며, 또한 골격 물질의 중요한 특징이다. 인산 칼슘의 골유도적 성질은 정성적인 특징, 즉 새로운 골조직의 발달을 유도하는 능력이며, 따라서 새로운 광물의 침착 속도의 향상은 다양한 물질 변수에 의존한다. 골유도는 일반적으로 중배엽 조직이 그 세포적 구조를 골형성적으로 변화되도록 유도하는 기전으로 정의된다.

일반적으로, 다공성 인산 칼슘은 골유도성을 나타내는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 야마사키 등은 Biomaterials 13:308-312(1992)에서, 다공성 수산화인회석 세라믹 과립 주변으로 이소골화(heterotopic ossification)(평소 골화되지 않는 조직에서의 새로운 뼈 형성)가 발생하나 조밀 과립 주변에서는 발생하지 않음을 설명한다. 상기 다공성 과립은 크기가 200 내지 600㎛의 범위 내에 있으며, 공극의 직경이 2 내지 10㎛의 범위인 연속적이고 상호연결된 세공성(microporosity)을 갖는다.

미국 특허 제6,511,510호는 야마사키 등의 다공성 수산화인회석 과립보다 개선된 골유도성을 나타내는 생체적합적이고 생물분해적인 인산 칼슘을 기술한다. 상기 생물분해적 인산 칼슘은 총 공극률이 20 내지 90%이며, 크기가 0.1 내지 1.5mm의 범위인 대공(macropores) 뿐 아니라 크기가 0.05 내지 20㎛의 범위인 세공(micropores)을 포괄한다. 상기 생물분해적 인산 칼슘 물질은 몰드 캐스팅을 통해 제조되며 블럭들은 후속적으로 과립화되거나 더 작은 크기의 입자로 잘라질 수 있다. 상기 물질은 이식 시, (임시적으로) 뼈의 대체물로서의 기능을 하는 데 적합 하다.

상기 물질들이 이용가능함에도 불구하고, 생조직과 관련하여 사용되는 생체물질(biomaterials)이 더 우수한 골유도적 특성, 즉 보다 빠르고 보다 심도 깊은 골형성을 초래하는 특성으로 제공될 수 있으면 유리할 것이다. 또한 그러한 골유도성 물질이 포유동물의 체내로 쉽게 도입될 수 있고, 가장 바람직하게는, 골화 및 비골화 부위 모두에서 새로운 뼈의 생성을 위한 쉽게 이식가능하고 효과적인 골격 물질을 제공하도록 하는 것이 유리하다. 그러한 물질은 후속적으로 대형 골결함을 회복시키는 데 골 대체물로 사용될 수 있는 자가골의 신규(de novo) 생성에 매우 유용할 것이다.

본 발명은 우수한 골유도성 특성을 갖는 인산 칼슘 물질을 제공한다.

본 발명의 제1양태에 있어서, 본 발명은 0.1-1.50㎛의 범위의 평균 그레인 크기, 0.1-1.50㎛의 크기 범위의 세공을 포함하는 공극률을 갖고, 10-40%의 범위의 세공의 표면적 백분율을 갖는 다공성 골유도성 인산 칼슘 물질을 제공한다.

바람직한 일 구현예에 있어서, 세공의 표면적 백분율은 40% 미만, 가장 바람직하게는 10-25%의 범위 내에 있다.

본 발명의 다공성 인산 칼슘은 바람직하게는, 25ppm의 아지드 나트륨(NaN₃)의 존재 하에서 3ml의 1% 우태아혈청(FBS) 수용액으로부터 1ml의 상기 인산 칼슘에 의하여 37℃에서 24시간 후 흡수된 단백질의 비율로 표현되는 단백질 흡착도가 40% 이상이다.

바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 인산 칼슘 물질의 공극률은 특정 크기의 범위 내에 있는 세공들로만 필수적으로 구성되며, 대공(macropores)이 없다.

본 발명의 다공성 인산 칼슘은 바람직하게는 약 50 내지 약 1500㎛의 범위, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 300㎛, 가장 바람직하게는 212-300㎛의 입자 크기를 갖는 미세입자의 형태로 존재한다.

본 발명의 물질은 생조직에서 우수한 골유도 양태를 보인다. 본 발명의 물질의 표면에서의 골조직의 형성은 상기 물질로 제조된 이식물의 호의적 수용을 보조한다. 또한, 상기 골조직의 형성은 골 구조의 임의의 손상의 회복을 가속화하며, 이는 이식물을 적용하는 데에 근거를 형성한다.

미세입자 형태로서의 본 발명에 따른 물질의 이점은 우수한 흐름성이 있다는 것이다. 미세입자성 물질의 모래 유사 구성은 추가적 유동 운반체 없이 주입될 수 있도록 한다. 따라서, 이러한 일 구현예에서의 물질은 주입가능물로 사용될 수 있는 한편, 예를 들어 액체 운반체와 혼합하여 사용될 수도 있다.

바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인산 칼슘은 인산 팔칼슘, 수산화인회석 및 탄산 인회석과 같은 인회석, β-인산삼칼슘 및 α-인산삼칼슘과 같은 휘트록카이트(whitlockite), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인산 칼슘이다. 보다 바람직하게는 상기 인산 칼슘은 재흡수가능한 이상성(biphasic) 인산 칼슘 (BCP) 또는 재흡수가능한 인산 삼칼슘, 바람직하게는 β-인산삼칼슘이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 의료 이식 물질 또는 조직 골격으로서의 용도를 위한 본 발명의 다공성 인산 칼슘에 관한 것이다.

본 발명의 물질은 종래 기술의 물질에 비해 개선된 골유도성 특성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 상기 물질이 세공성(공극<5㎛), 바람직하게는 상호연결된 세공성을 보인다는 것이 상기 물질의 특징이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 물질은 대공이 실질적으로 없다 (대공의 크기는 0.1 내지 1.5mm의 범위 내).

본 발명의 다공성 인산 칼슘은 비골성 부위에서의 자가골 생성을 위한, 단독의 또는 성장 인자 또는/및 세포와 조합된 이식 물질로서, 살아있는 생물의 골조직의 형성을 유도하는 데, 또는 단독의 또는 성장 인자 또는/및 세포와 조합된 의료 이식물 또는 장치를 제조하는 데 적절하게 사용할 수 있다.

본 발명의 다공성 인산 칼슘은 치과 수술에서 적절하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 다공성 골유도 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 물 중에 1.0-8.0㎛, 바람직하게는 2.0-4.0㎛의 입자 크기를 갖는 인산 칼슘 분말, 기포제 및 선택적으로 공극형성제의 수성 슬러리를 제공하는 단계; 상기 슬러리가 기포화를 유발하는 조건으로 슬러리를 처리하는 단계; 얻어진 기포화된 슬러리를 건조시키고 선택적으로 상기 공극형성제를 제거하여 다공성 성형체(green body)를 제공하고, 상기 다공성 성형체를 1050℃ 내지 1150℃의 온도에서 소결하여 다공성 소결 인산 칼슘을 제공하는 단계; 및 선택적으로 상기 소결된 인산 칼슘을 분쇄(milling)하여 입자로 하고, 약 50 내지 약 1500㎛의 범위의 입자 크기를 갖는 상기 입자를 수집하는 단계를 포함한다.

바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 소결된 인산 칼슘을 입자로 분쇄하는 단계를 더 포함하며, 상기 입자는 체, 가장 바람직하게는 212㎛와 300㎛의 체를 사용하여 수집되어 212-300㎛의 미세입자 분획을 제공한다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 인산 칼슘 분말은 0.01 내지 1.0㎛, 바람직하게는 0.05 내지 0.5㎛의 결정 크기를 갖는 결정으로 구성된다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 기포제는 과산화수소이다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 공극형성제는 나프탈렌 입자를 포함하며, 상기 공극형성제는 80-110℃에서의 증발에 의해 제거된다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 슬러리의 기포화를 유발하는 상기 조건은 상기 슬러리를 약 50-70℃로 가열하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 건조 및 기포화된 슬러리는 TCP의 경우 1050-1100℃의 온도, 보다 바람직하게는 1050-1075℃의 온도, 또는 HA 및/또는 BCP의 경우 1100-1150℃의 온도에서 소결된다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인산 칼슘 분말은 TCP 또는 BCP 분말이다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 소결된 인산 칼슘의 분쇄 이후에 수집된 미세입자는 후속적으로 아세톤, 에탄올 및/또는 물로 초음파를 통해 세척되고, 선택적으로 건조 및 멸균된다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인산 칼슘 분말은 입자가 불규칙적 형태를 갖는 오븐 건조된 분쇄된 분말이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 방법에 따라 수득된 다공성 골유도 인산 칼슘에 관한 것이다.

용어 "입자(particle)"는 본 명세서에서 과립성 또는 분말성 물질(입자의 절대 크기에 의존하는 용어)을 나타내기 위해 사용된다. 미세입자(microparticle)란 1mm 미만의 크기를 갖는 입자 (즉, 수 마이크로미터 내지 수백 마이크로미터)이다.

본 발명의 물질은 실질적으로 개방적 다공성 구조를 가지며, 각개의 공극은 개구부 또는 공동으로 연결되어 있다. 인산 칼슘 기질 그 자체의 구조는 현미경적 관찰에 따르면 매끄럽지 않고 거칠며, 상기 구조적 물질은 구조적으로 공극에 의해 간격지어진 꽉 찬 그레인의 형태로 배열되어 있다. 용어 "그레인(grain)"은 다공성 인산 칼슘의 연속적인 기질을 형성하는 개별적으로 인식가능한 "입자", 즉 SEM 현미경사진에 보이는 바와 같이 다른 그레인에 구조적으로 연결되어 있는 세라믹 물질에 함입된 결정을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "그레인"과 "결정"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 한편, 용어 "그레인"은 기질 내에서의 가장 작은 개별적으로 인식가능한 구조적 "요소"의 구형 성질을 더 잘 나타낸다. 따라서 용어 "그레인"은 물질의 과립적 또는 미립적 형태와 연관되지 않고, 내부 구조를 나타낸다.

용어 "불규칙적 형태를 갖는 입자"란 (그 자체로 그레인성 구조를 가질 수 있는) 인산 칼슘 분말의 입자가 구형이 아니라는 것을 의미한다.

용어 "세공"(micropore)이란 당해 기술에서 인식가능한 형태로 사용되며, 50㎛ 미만, 바람직하게는 10㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 1.5㎛ 미만의 크기를 갖는 다공성 물질 내의 공극을 나타낸다. 다공성 인산 칼슘에서의 세공의 크기를 결정하기 위해, SEM 현미경사진으로 보이는 바와 같은 10개 이상의 가장 큰 세공들의 평균 직경이 결정된다;

용어 "세공의 표면적 백분율"이란 세공과 관련된 다공성 인산 칼슘의 단면도의 표면적을 세공 및 조밀한 물질 모두와 관련된 총 표면적의 비율로서 나타낸 것을 가리킨다.

용어 "단백질 흡착도"는 25ppm NaN₃를 함유하는 3ml 부피의 1% 우태아혈청(FBS) 수용액에 담갔을 때 37℃에서 24시간 동안 1ml 부피의 다공성 인산 칼슘에 의해 흡수된 단백질의 양을 가리키며, 상기 흡수량은 100%에서 용액에 남아 있는 비율을 뺀 값이며, 상기 단백질 함량은 인산 칼슘과의 접촉 전과 후에 결정된다.

본 발명의 양태에서의 다공성 인산 칼슘 물질은, 저온에서 수용액으로부터의 침전, 또는 고온(열적) 방법을 통해 수득된 CaP와 같은 임의의 인산 칼슘(CaP)에 기초할 수 있다. 매우 바람직한 인산 칼슘은 오르토인산 칼슘이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "오르토인산 칼슘(calcium orthophosphate)"은 일군의 화합물을 나타내며, 각각은 칼슘 양이온, Ca² ⁺, 및 인산 음이온, PO₄ ³ ^-을 포함한다. 상기 정의 하에는 오르토인산 일칼슘 (일염기성), 오르토인산 이칼슘(이염기성), 오르토인산 삼칼슘(3염기성), 및 수산화인회석(삼인산 오칼슘)를 포함한 다수의 오르토인산 칼슘이 있다.

비록 본 발명은 주로 오르토인산 칼슘 위주로 설명되나, 본 명세서에서 유용한 다른 적절한 물질은 예를 들어 피로인산 칼슘(예: 이인산 이칼슘(Ca₂P₂O₇, 동의어: 피로인산 칼슘), 피로인산 칼슘 이수화물(CPPD, Ca₂P₂O₇.2H₂O), 및 이수소 이인산 칼슘(CaH₂P₂O₇; 동의어: 산 피로인산 칼슘, 이수소 피로인산 일칼슘)), 및 폴리인산((CaP₂O₆)_n, n≥2; 동의어: 메타인산 칼슘, 폴리메타인산 칼슘), 및 다양한 인산들의 조합을 포함한다.

본 발명의 양태에 있어서 사용가능한 인산 칼슘 화합물의 비제한적인 예는 다음과 같다:

- α-인산 삼칼슘 (α-TCP, α-Ca₃(PO₄)₂, 동의어:휘트록카이트, 인산 삼칼슘, 인산 칼슘 3염기), 무수 또는 수화물;

- β-인산 삼칼슘 (β-TCP, β-Ca₃(PO₄)₂, 동의어:휘트록카이트, 인산 삼칼슘, 인산 칼슘 3염기), 무수 또는 수화물;

- 비정질 인산 칼슘 (ACP, Ca₃(PO₄)₂.nH₂O, n=3-4.5 Ca/P 비율 = 1.5)

- 인회석 (플루오로-인산 칼슘, Ca₅(F, Cl, OH)(PO₄)₃)

- 이수소 인산 칼슘 (Ca(H₂PO₄)₂;

- 이수소 인산 칼슘 수화물 (Ca(H₂PO₄)_2.2H₂O);

- 무수 수소 인산 칼슘 (CaHPO₄)

- 칼슘결핍 수산화인회석 또는 침전된 수산화인회석 (PHA) Ca₁₀ _-x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x(OH)_2-x;(O≤x≤1), Ca/P 비율은 1.5 내지 1.67에서 변동

- 탄산 인회석 ( Ca₅(PO₄ _,CO₃)₃F)

- 무수인산 이칼슘 (DCPA, CaHPO₄)

- 이수화 인산 이칼슘 (DCPD, CaHPO₄.2H₂O);

- 플루오로인회석 (FA, Ca₅(PO₄)₃F);

- 수산화인회석 (HA, Ca₅(PO₄)₃OH, 동의어: 삼인산 (오)칼슘);

- 무수 인산 일칼슘 (MCPA, Ca(H₂PO₄)₂);

- 일수화 인산 일칼슘 (MCPM, Ca(H₂PO₄)₂.H₂O)

- 인산 팔칼슘 (OCP, Ca₈H₂(PO₄)₂.6.5H₂O);

- 산화인회석 (Ca₁₀(PO₄)₆.O);

- 인산 사칼슘 (TTCP, Ca₄(PO₄)₂O);

- MCPM 또는 MCPA와 α-인산 삼칼슘 또는 β-인산 삼칼슘과 같은 다른 Ca/P의 혼합물과 같은 상기 중 둘 이상의 혼합물, 및

- β-TCP와 수산화인회석 (Ca/P - 1.67)의 복합체와 같은 상기 중 둘 이상의 복합체 (composite), 예를 들어 이상성 인산 칼슘 (BCP).

상기 인산 칼슘들은, 특히 천연적 원천으로부터 유래된 경우, 사용 전에 소성될 수 있다. 본 발명의 골유도 물질은 바람직하게 생조직 내의 이식물로서 사용되므로, 상기 인산 칼슘은 합성(synthetic)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 골유도 물질은 생조직 내의 이식물로서 사용을 위해 충분히 적합하고 충분히 생물분해될 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 골유도 물질이 기초하는 인산 칼슘은 바람직하게 (생물)재흡수가능하며, 이는 포유동물체에 삽입하였을 때 화학적 용해와 세포매개 재흡수를 보인다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 골유도 물질은 바람직하게는 HA, α-TCP, β-TCP, 인산 팔칼슘, 또는 BCP와 같은 그의 조합을 바탕으로 한다. 본 발명에 따른 골유도 물질은 가장 바람직하게는 BCP 또는 TCP를 바탕으로 한다.

본 발명의 물질은 다공적이다. 상기 물질의 공극률은 대공 및 세공 모두를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 0.1-3.0㎛, 바람직하게는 0.1-2㎛, 더 바람직하게는 0.1-1.5㎛, 더욱 바람직하게는 0.5-1.5㎛ 크기 범위의 세공으로 필수적으로 구성된다. 총 공극률은 20 내지 90%, 바람직하게는 40 내지 70%의 범위에 있다.

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 골유도 물질을 제조하는 방법과 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 골유도 물질에 관한 것이다.

인산 칼슘을 바탕으로 한 골유도 물질을 제조하기 위한 본 발명의 방법은, 물 중에 인산 칼슘 분말, 기포제 및 선택적으로 공극형성제의 수성 슬러리를 제공하는 단계; 상기 슬러리가 기포화를 유발하는 조건으로 슬러리를 처리하는 단계; 얻어진 기포화된 슬러리를 건조시키고 선택적으로 공극형성제를 제거하고, 상기 건조 및 기포화된 슬러리를 소결하여 다공성 소결 인산 칼슘 세라믹을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 선택적으로 상기 소결된 인산 칼슘 세라믹을 분쇄(milling)하여 입자로 하고, 바람직한 입자 크기를 갖는 입자를 수집하는 단계로 이어질 수 있다.

성형체의 제조는 적절하게는 인산 칼슘(CaP)의 슬러리 형성을 포함하는데, 상기 CaP는 바람직하게는 기포제를 함유하는 용액 내에 현탁된 분말의 형태로 있다. 상기 기포제 용액 내의 기포제 (예: H₂O₂)의 농도는 적절하게는 0.1% 내지 10.0%의 범위 내에 있으며, 용매는 적절하게는 물이다. 슬러리를 형성하기 위해 기포제 용액 (예: H₂O₂, 물 중 0.1-10.0%)과 인산 칼슘이 혼합되는 비율은 적절하게, 100g의 CaP 당 10 내지 300ml의 기포제 용액이다. 100g의 CaP 당 사용된 공극형성제(예: 나프탈렌 입자, <1400㎛)의 양은 적절하게는 0-150g 이다. 그런 다음 상기 슬러리는 기포화(예: H₂O₂를 사용하는 경우 50-70℃에서일 수 있다)되고 예를 들어 80-110℃에서 건조되어 다공성 성형체를 형성할 수 있으며, 이것은 소결되고, 선택적으로 분쇄되어 본 발명의 미세입자를 형성할 수 있다.

본 발명의 골유도 물질을 제조하기 위해, 인산 칼슘 바탕의 물질이 상기 조건 하에서 소결되고, 이로써 전술된 골유도 물질이 얻어진다.

바람직하게는 본 발명의 인산 칼슘은 800 내지 1300℃의 온도에서, 선택적으로 압력 하에서 다공성 성형체의 소결이 관여되는 방법에 의해 형성된다. 최종 산물의 특성은 온도, 압력, 및 인산 칼슘 시작 물질의 특정 조합을 선택함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 순수 HA는 Ca/P 비율이 1.67인 인회석을 사용함으로써 형성될 수 있는 한편, TCP는 Ca/P 비율이 1.5인 인회석을 사용함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어 다양한 Ca/P 비율을 가진 인회석이 소결되는 경우, 다양한 양의 HA와 TCP가 최종 세라믹에 형성되어, 이상성 인산 칼슘(BCP)을 생성한다. 소결 변수에 의해 결정되는 또 다른 인자는 잔존 세공성이다. 세라믹의 세공성은 그 제조 방법의 몇몇 구현예에서 소결된 입자 간에 주어진 간격으로 인한 것일 수 있으며, 이는 -차례로- 사용된 CaP의 결정화에 의해 영향을 받는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 다공성 인산 칼슘 세라믹은 결정(즉, 그레인)으로 이루어져 있다. 바람직하게는, 상기 결정의 크기는 세공의 크기와 유사하다. 따라서, 상기 결정의 크기는 바람직하게 0.1 내지 3㎛, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2㎛, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1.5㎛, 그리고 더더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5㎛ 사이에 존재한다.

조밀하고 다공성인 인산 칼슘 세라믹은 일반적으로 서로 다른 소결 기법에 의해 제조된다. 조밀한 세라믹은 고압력 하에서 압밀을 통해 생성되어, 흔히 "성형(green)" 상태로 얻어지며, 상기 압밀 과정(compaction process) 후에 소결된다. 본 발명의 다공성 인산 칼슘은 예를 들어 인산 칼슘 시작 물질의 수성 슬러리 내에 포함된 공극형성제로서 적절한 크기의 나프탈렌 입자를 사용함으로써 생성될 수 있다. 고압 하에서의 압밀 후, 나프탈렌의 제거는 승화를 통해 달성되며, 다공성 성형 상태로 남겨진다. 이 다공성 성형 상태의 완전성은 소결 단계에 걸쳐 유지된다. 나프탈렌 입자의 사용은 예를 들어 Moore 등 (2001) Australian and New Zealand Journal of Surgery 71:354-361 및 Li et al (2003) Journal of the American Ceramic Society 86:65-72에 기재돼 있다.

다공성 세라믹을 제조하는 또 다른 방법은 예를 들어 공극으로 채워진 구조를 생성하기 위한 과산화수소의 분해에 의존한다. 이러한 경우, 상기 과산화수소는 기포제로서 작용하여, 이탈하는 기체가 공백을 생성하여 결과적으로 공극을 형성한다. 당업자는 건조될 때, 소결되어 요구되는 공극률을 갖는 인산 칼슘계 물질이 생성될 수 있는 다공성 성형체를 제조하기 위해 다른 기포제가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 슬러리 내의 인산 칼슘의 농도는 추가적인 안정제 또는 증점제가 필요하지 않도록 하는 것이 바람직하다.

TCP를 바탕으로 하는 본 발명의 다공성 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법은 하기와 같이 기술될 수 있다 (당업자는 다른 인산 칼슘 시작 물질에 대해서 이와 유사한 절차가 수행된다는 것을 이해할 것이다): TCP 분말 (입자 크기가 D(v.0.5)에서 2.82㎛인 불규칙적인 형태의 TCP 분말)은 수성 H₂O₂ 용액 (0.1-5.0 wt%; 보통 2wt%) 및 나프탈렌 입자 (시그마 알드리치 케미컬로부터 상업적으로 구입한 입자는 1400㎛ 크기의 메쉬를 통해 체질 될 수 있으며, <1400㎛의 분획이 적절하게 사용된다.)와 혼합되어 100-250ml H₂O₂ 용액 중에 100g의 TCP 분말의 슬러리를 얻는다. 그 후, 상기 슬러리를 교반 없이 오븐에 보통 밤새 50-70℃의 온도에서 둠으로써 기포화된다. 그런 다음, 상기 기포화된 슬러리는 80-110℃의 온도에서 오븐에서 건조되어 다공성 성형체를 얻는다. 그런 다음 상기 다공성 성형체는 약 1050-1100℃의 온도에서 소결된다. 그 후 상기 소결된 물질은 적절하게 분쇄되어 세라믹 입자를 제공하며 212-300㎛ (세라믹 미세입자), 또는 1-3mm (세라믹 입자)의 적절한 분획이 체를 이용하여 수집될 수 있다. 상기 세라믹 입자는 그 후 사용을 위해 세척되고 멸균될 수 있다. 소결된 다공성 인산 칼슘이 분쇄 없이 사용될 수도 있고, 특히 상기 슬러리는 형틀에 성형, 건조, 소결되고 골격으로 직접 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

전술한 바와 같이, 공극의 크기는 시작 물질의 인산 칼슘 분말의 입자 크기, 기포제의 유형 및 양, 기포화된 "성형체"를 수득하기 위해 시작 물질의 슬러리가 처하는 조건, 선택적인 공극형성제의 유형, 입자 크기 및 양, 및 소결 온도에 의해 조절된다. 바람직하게는, 상기 소결은 800℃ 내지 1250℃의 온도, 가장 바람직하게는 1050℃ 내지 1150℃에서 수행된다. 상기 소결 단계의 지속시간은 적절하게는 1 내지 10시간, 바람직하게는 7 내지 9시간에서 선택될 수 있다.

소결된 후, 상기 물질은 선택적으로 유기산의 수용액으로 처리되고 세척된다. 상기 세척은 적절하게 아세톤, 에탄올, 물 또는 그의 조합을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 중요한 일 양태는 골유도 물질의 물리적 구조이다. 매우 바람직한 구현예에 있어서, 상기 물질은 미세입자 또는 과립의 형태, 즉 50-1500㎛, 바람직하게는 100-500㎛, 더욱 바람직하게는 200-300㎛, 가장 바람직하게는 212-300㎛의 입자 크기의 범위를 갖는 입자로 이루어진 과립형, 흩어진 물질이 바람직하다. 따라서, 소결 후에는, 상기 물질은 바람직하게는 분쇄, 예를 들어 볼분쇄기(ball mill)에서 분쇄되어, 50-1500㎛, 바람직하게는 100-500㎛, 더욱 바람직하게는 200-300㎛, 가장 바람직하게는 212-300㎛의 입자 크기의 범위를 갖는 미세입자를 포함하는 상대적으로 굵은 분말을 생성한다. 구체적인 크기의 범위는 예를 들어 212-300㎛ 체를 이용하여 수득될 수 있다.

최종적으로, 상기 수득된 골유도 물질의 미세입자를 증기, 에틸레녹시드 또는 감마 멸균과 같이 멸균 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 물질, 특히 과립 형태는 주입가능물의 형태로, "분말"의 형태로 단독으로 사용되거나 또는 액체 운반체와 조합하여 페이스트의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 물질은 예를 들어 인산 칼슘 시멘트로 사용될 수 있고, 또는 살아있는 생물에서 골조직의 형성을 유도하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 물질은 비골화 부위에서의 자가골 생성을 위한 이식 물질로서, 즉 골격으로서 적절하게 사용될 수 있다. 이러한 능력은 상기 물질의 우수한 골유도 특성으로 인한 것이다.

따라서 본 발명의 물질은 인산 칼슘으로 형성된 의료 이식물 또는 의료 기기로서 사용될 수 있다. 또한 상기 물질은, 금속 또는 중합체 물질과 같은 다른 물질의 의료 이식물과 조합하여 본 발명에 따른 골유도 물질이 코팅의 형태로 존재하도록 사용될 수 있다.

본 발명의 물질의 다양한 용도가 골 회복의 일반 수술적 응용뿐 아니라 치과 수술에서의 응용도 포함한다는 것이 인식되어야 할 것이다.

이하 본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 들어 설명될 것이다. 이러한 실시예들은 인산 칼슘 세라믹(즉, 소결된 인산 칼슘으로서, 상기 인산 칼슘은 본 명세서에 기술된 임의의 물질, 바람직하게는 HA, BCP 및/또는 TCP 형태일 수 있다)의 골 형성 능력을 향상시키기 위한 방법을 설명한다. 상기 향상된 인산 칼슘 세라믹은 그레인 크기가 1.50㎛ 미만 (예: 0.10-1.50㎛ 범위)이며, 그 표면의 세공의 크기는 1.50㎛ 보다 작으며(예: 0.10-1.50㎛ 범위), 상기 표면상의 세공의 면적 백분율은 10% 내지 40%이다. 바람직한 결정의 그레인 크기, 세공의 크기 및 세공의 면적 백분율은 세라믹에의 고농도의 단백질 흡착 및 높은 골형성 능력(비골화 부위에서의 유도성 골형성)을 가져온다. 상기 개선된 인산 칼슘 세라믹은 24시간 내에 3ml 1% 우태아혈청 용액으로부터 1.0ml (또는 약 400mg)의 다공성 세라믹 입자 (총 공극률 80%)로 40% 단백질 초과(40-80%)와 동등한 양의 단백질을 그 표면에 흡착하는 것으로 나타났다. 본 발명의 개선된 인산 칼슘 세라믹은 바람직하게는, 불규칙적인 형태를 가지며 바람직하게는 8.0㎛ 미만 D(v.0.5) (예: 2.00-4.00㎛)의 입자 크기(직경)를 갖는 오븐 건조된 분쇄된 인산 칼슘 분말을 이용한 방법을 통해 제조된다. 이러한 물질은 8.0㎛ D(v.0.5) 초과의 규칙적인 구형 입자를 갖는 분사 건조된 인산 칼슘 분말에 비해 더 선호된다. 본 발명의 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법에 있어서, (H₂O₂와 같은) 기포제를 사용하는 방법이 등압 성형법(isostatic pressing)과 같은 다른 방법보다 더 바람직하다. 이에 더해, 소결 온도는 바람직하게는 1050 내지 1150℃이다. 개별적인 인산 칼슘에 대해서는, 소결 온도가 더 최적화될 수 있다. 예를 들어, TCP의 바람직한 소결 온도는, 1050-1100℃의 온도인 반면, HA와 BCP의 바람직한 소결 온도는 1100-1150℃이다.

골유도의 특성에 중요한 다공성 인산 칼슘 세라믹의 특징 및 특성은 다음과 같다:

- 그레인 크기 (연속적인 기질을 형성하는 10개 이상의 가장 큰 개별적으로 인식가능한 "입자"의 평균 직경, 즉, 약 10-20㎛ X 5-15㎛의 면적을 나타내는 물질 표면의 현미경사진의 확대 및 관찰에 따른, 예를 들어 도 6에 나타난 것과 같은 SEM 현미경사진에 보이는 바와 같이, 세라믹 물질에 함입되어 있고 다른 그레인에 구조적으로 연결되어 있는 가장 큰 10개 이상 그레인의 평균 직경);

- 세공 크기 (약 10-20㎛ X 5-15㎛의 면적을 나타내는 물질 표면의 현미경사진의 확대 및 관찰에 따른, 예를 들어 도 7에서 나타난 바와 같은 SEM 현미경사진에 가시적인 10개 이상의 가장 큰 세공들의 평균 직경);

- 세공의 면적 백분율 (예: 세공과 관련된 디지털 이미지에서의 픽셀 수의 선택된 표면적의 총 픽셀 수에 대한 백분율: 물질의 단면도에서의 세공의 면적 백분율); 및

- 단백질 흡착도 (예: 37℃에서 24시간 배양 후 25ppm의 아자이드 나트륨(NaN₃)의 존재 하에서 3ml의 1% 우태아혈청(FBS) 수용액에 담갔을 시 1ml 부피의 상기 인산 칼슘에 의해 흡수된 단백질의 양 및, 예를 들어 BCA^TM 단백질 분석 키트 (피어스 바이오테크놀로지 사, Rockford, IL, USA)를 사용하여 용액에 잔존하는 양으로부터 흡수된 양을 결정).

높은 골형성 능력을 보이는 물질은 더 작은 그레인 크기, 더 높은 세공의 면적 백분율 및 더 높은 단백질 흡착도를 갖는다. 실시예 2의 TCP-01은 그러한 개선된 인산 칼슘 세라믹의 일 예이다. 일반적으로 매우 향상된 골유도 특성을 보이는 인산 칼슘 세라믹은 1.50㎛ 미만의 그레인 크기 (0.10-1.50㎛ 사이), 1.50㎛ 미만의 세공 크기 (0.10-1.50㎛ 사이), 10%보다 높은 (10-40% 사이) 인산 칼슘 세라믹 표면상의 세공의 면적 백분율 및 24시간 내 3ml 1% 우태아혈청 용액으로부터 1.0ml (또는 약 400mg)의 다공성 세라믹 입자 (80%의 총 공극률)로의, 40% 초과(40-80% 사이)의 단백질과 동등한 더 높은 단백질 흡착도를 갖는다.

도 1-3은 실시예 1에 보다 상세히 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 골유도 과립 인산 삼칼슘 세라믹 물질의 물리화학적 특성을 보여준다.

도 1은 실시예 1에 기재된 물질의 XRD 패턴을 보여준다.

도 2는 실시예 1에 기재된 물질의 세공의 정형도 (SEM 사진)이다.

도 3은 실시예 1에 기재된 (증강적(incremental) 공극 용적은 1.1㎛의 공극 크기에서 최대값을 가짐을 나타내는) 수은 침투에 의해 결정된 증강적 공극 용적 대 평균 세공 직경의 그래프를 나타낸다.

도 4는 실시예 1에서 사용된 두 이식 물질을 보여준다: 1-3mm의 입자 크기를 갖는 세공성 TCP (패널 A; 비교군), 및 212-300㎛ (패널 B; 본 발명의 따른).

도 5는 실시예 1에 기재된 바와 같은 회수된 이식물의 조직학적 조제물의 현미경사진을 나타낸다. 1-3mm의 입자 크기를 갖는 TCP의 세공 입자에 기초한 이식물과 관련된, 개의 근육에 이식 12주 후 골 형성 (분홍 발색)(왼편)과, 212-300㎛의 입자 크기를 갖는 TCP의 세공 입자에 기초한 이식물과 관련된 골 형성을 비교한다(오른편).

도 6은 실시예 2에 기재된 TCP-01(A) 및 TCP-02(B)의 그레인(grain) 크기를 나타내는 SEM 사진을 나타낸다.

도 7은 실시예 2에 기재된 TCP-01(A) 및 TCP-02(B)의 세공 크기를 나타내는 현미경사진을 나타낸다(흑색: TCP 그레인; 흰색: 세공)

도 8은 실시예 2에 기재된 바와 같은 TCP 세라믹의 1% FBS로부터의 24시간 내에 단백질 흡착도의 막대 그래프의 결과를 나타낸다.

도 9는 실시예 2에 기재된 바와 같은, 개 근육에 이식 12주 후의 TCP-01(A)에서의 골 형성 및 TCP-02(B)에서의 골 비형성의 조직학적 현미경사진을 나타낸다.

도 10은 실시예 3에 기재된 바와 같은, 분말 E의 입자 크기 분포를 도시한다.

도 11은 실시예 3에 기재된 바와 같은 SEM 관찰에 따른 4개의 TCP 분말(A: 분말 A; B:분말 D; C: 분말 E 및 D: 분말 F)의 형태를 나타낸다.

도 12는 실시예 3에 기재된 바와 같은 다양한 세라믹(A: 세라믹 A; B: 세라믹 D; C: 세라믹 E 및 D: 세라믹 F)에서의 그레인을 나타낸다.

도 13은 실시에 3에 기재된 바와 같은 다양한 세라믹(A: 세라믹 A; B: 세라믹 D; C: 세라믹 E 및 D: 세라믹 F)의 표면상의 세공을 나타낸다 (흑색: TCP 그레인; 백색: 세공).

도 14는 실시예 3에 기재된 바와 같은 24시간 내 1% FBS로부터의 다양한 세라믹의 단백질 흡착도를 나타낸다.

도 15는 실시예 4에 기재된 바와 같은 TCP 세라믹(A: TCP-H₂O₂ 및 B: TCP-압축)의 그레인을 나타낸다.

도 16은 실시예 4에 기재된 바와 같은 세라믹 표면상의 세공을 나타낸다(A: TCP-H₂O₂ 및 B: TCP-압축)(흑색: TCP 그레인 ; 백색: 세공).

도 17은 실시예 4에 기재된 바와 같은 24시간 내 1% FBS로부터의 다양한 세라믹의 단백질 흡착도를 보여준다.

도 18은 실시예 5에 기재된 바와 같은 서로 다른 온도에서 (A, 1050℃; B, 1075℃ 및 C, 1100℃) 소결된 TCP 세라믹에서의 그레인을 보여준다.

도 19는 실시예 5에 기재된 바와 같은 서로 다른 온도에서 (A, 1050℃; B, 1075℃ 및 C, 1100℃) 소결된 다양한 세라믹의 표면상에서의 세공을 보여준다 (흑색: TCP 그레인; 백색: 세공).

도 20은 실시예 5에 기재된 바와 같은 24시간 내 1% FBS로부터의 세라 믹(B1050, TCP 1050℃; B1057, TCP 1075℃ 및 B1100, TCP 1100℃)의 단백질 흡착도를 보여준다.

실시예 1. 212-300㎛의 크기 및 0.5-1.5㎛의 공극 크기를 갖는 TCP 미세입자

1.1. 물질의 제조

인산 삼칼슘 세라믹.

TCP 분말 (플라스마 바이오탈, UK)을 H₂O₂ 용액 (물 중 1.0-2.0%, 100-200ml/100g TCP 분말) 및 나프탈렌 입자 (500-1400㎛, 0-150g/100g 분말)와 혼합하고, 50-70℃에서 기포화하여 다공성 성형체(green body)를 얻었다. 건조하고 나프탈렌을 80-110℃에서 증발시킨 후, 상기 성형체를 8시간동안 1100℃에서 소결시켰다. 세라믹 입자 (1.0-3.0mm) 및 미세입자 (212-300㎛)를 제조하고 초음파적으로 아세톤, 에탄올 및 물로 세척하고, 최종적으로 80℃에서 건조시켰다.

1.2. 물질들의 특성 규명

상기 물질의 화학성을 XRD로 분석하고, 세공은 SEM(형태) 및 수은 침투 (Mercury intrusion)(미세 크기)로 분석하였다.

도 1-3에 결과를 나타내었고, 상기 제조된 물질은 화학적으로 수산화인회석을 미량으로 함유하는 β-인산 삼칼슘이라는 것을 보인다 (도 1). 상호연결된 2㎛ 미만의 세공들은 물질 내에 균일하게 분포된다 (도 2). 세공들의 크기는 수은 침투로 측정된 바에 따르면 0.5-1.5㎛ 사이이다.

1.3. 동물 연구 및 조직학

이식물은 1.0cc 부피의 세라믹 입자로 이루어져 있다. 대조군 이식물은 입자 크기가 1-3mm (비교예; 도 4A)인 이식물을 구성되고, 시험 이식물은 입자 크기가 212-300㎛ (본 발명에 따른 물질; 도 4B)인 이식물로 구성되었다. 두 유형의 이식물 모두 개의 등근육에 이식되었다. 8마리의 개들이 12주 동안 이식을 받았다. 12주 후, 이식물을 소량의 주변 조직을 포함하여 회수하고, 10% 완충된 포르말린 (pH=7.4)에 고정시켰다. 고정된 시료를 일련의 에탄올 용액(70%, 80%, 90%, 96%, 및 100% X 2)으로 탈수하고 최종적으로 MMA에 함몰시켰다. 탈회되지 않은 단편 (10-20㎛)을 제조하고 형성물에 대한 조직학적 관찰 및 조직형태측정 분석을 위해 메틸렌 블루와 염기성 푹신(fuchsin)으로 염색하였다. 조직형태측정은 이용가능한 공간 내에 형성된 뼈의 백분율에 대해 이식물의 중간을 가로지른 단편에서 수행되었다.

이식물의 크기 또는 부피는 12주 동안 개의 근육 내 이식 후 감소(1cc 미만)하였으며, 이는 TCP의 재흡수가능한 성질을 표시한다. 또한, 1-3mm 입자의 이식물의 남은 크기는 212-300㎛ 크기의 입자를 바탕으로 한 이식물보다 크며, 이는 212-300㎛ 미세입자는 1-3mm 입자보다 더 빠르게 재흡수된다는 것을 표시한다. 물질의 재흡수는 조직학적으로도 관찰되었다 (도 5). 손상되지 않은 TCP 입자는 1-3mm 입자를 바탕으로 한 TCP 이식물에서 보이는 반면, 대부분의 TCP 미세입자 (212-300㎛)는 붕괴되고 재흡수되었다.

골형성은 212-300㎛ 미세입자의 TCP 이식물 8개 중 6개에서 발견되고, 1-3mm 의 TCP 이식물 8개 중 8개에서 발견되었다. 그러나 가장 극적 효과는 212-300㎛ 미세 입자를 바탕으로 한 이식물에서 관찰되었다. 1-3mm의 입자와 관련된 골 형성은 제한적이고 입자 자체에만 한정된 한편 (도 5, 왼편), 대량의 광범위한 골형성은 212-300㎛의 미세입자와 관련된 것으로 밝혀졌으며, 뼈는 미세입자 사이에서 주로 생성된 것으로 발견되었다 (도 5, 오른편). 또한, 미세입자의 대부분은 12주간의 이식 후 재흡수되었으며 이식물은 실제로 "진짜" 자가골로 변환되었다.

1.4. 토의 및 결론

본 발명은 0.5-1.5㎛ 크기의 세공을 갖는 세공성 인산 칼슘을 갖는 이식물과 관련된 향상된 유도 골형성을 제공한다. 향상된 골 형성은 이식물에서 입자성 형태로 상기 물질을 사용하고 및 특정 입자 크기를 사용함으로써 관찰된다(즉, 미세입자, 예를 들어 212-300㎛).

이제 상기 접근법은 비골화 부위에서의 진 자가골의 생성 및 인산 칼슘 골격 물질의 완전 재흡수의 가능성을 입증한다.

실시예 2. 두 인산 삼칼슘 세라믹의 골형성 능력에 영향을 미치는 물질 특성

본 실시예에서는, 골유도 연구 모델(비골화 이식)에서 서로 다른 그레인 크기 및 세공 크기뿐 아니라, 서로 다른 단백질 흡착도 및 골형성 능력을 갖는 두 개의 인산 삼칼슘의 비교를 수행하였다.

2.1. 재료

하나의 TCP 세라믹 (TCP-01)을 D(v.0.5)에서 2.82㎛ 크기의 불규칙적인 형태 의 TCP 분말로부터 H₂O₂를 기포제로 사용한 본 발명의 방법에 따라 제조하였다 (표 1). 간략하게, 상기 TCP 분말은 희석된 H₂O₂ 용액(0.1-5.0%; 보통 2wt%) 및 나프탈렌 입자 (시그마 알드리치로부터 상업적으로 구입한 입자를 (선택적으로 분쇄하고) 메쉬 크기가 1400㎛인 체로 체질하여, 본 실시예에서 <1400㎛의 분획을 사용하였다)와 혼합하여 100-250ml의 H₂O₂ 용액중의 100g의 TCP 분말의 슬러리를 얻었다. 그 후, 상기 슬러리를 보통 밤새 교반 없이 오븐에 50-70℃의 온도에서 둠으로써 기포화시켰다. 그런 다음, 상기 기포화된 슬러리를 오븐에서 80-110℃의 온도에서 건조시켜 다공 성형체를 얻었다. 상기 다공성 성형체를 1100℃에서 소결시켜 TCP-01을 얻었다. 소결된 물질을 분쇄하여 세라믹 입자를 제공하고, 1-3mm의 분획을 체를 사용하여 수집하였다. 상기 세라믹 입자는 그 후 사용을 위해 세척되고 멸균되었다. 또 다른 TCP (TCP-02)는 오르토비타 사, Malvern, PA, USA에서 상업적으로 이용가능한 비토스 (Vitoss) TCP, 1-4mm였고, 구입한 상태로 사용하였다.

표 1. TCP-01^*에 대한 TCP 분말의 입자 크기 분석

D(v.0.5) = 2.82㎛: 부피로 입자의 50%가 2.82㎛보다 작다.

2.2. TCP 세라믹의 그레인 크기

TCP 세라믹의 그레인 크기를 5000배 확대한 주사 전자 현미경 사진으로 측정하였다. 어도비 포토샵^® 소프트웨어를 사용하여, 상기 세라믹의 가장 큰 그레인을 표시하고 측정하였다 (도 6). 각 TCP 세라믹 당 10 개의 그레인을 표시하고 측정하였다. TCP-01에서 가장 큰 그레인의 크기는 1.01±0.1㎛인 한편, TCP-02에서 가장 큰 그레인의 크기는 2.06±0.42㎛이었다.

2.3. 세공 크기 및 세공의 면적 백분율

TCP 세라믹의 세공 크기를 2500배 확대한 주사 전자 현미경 사진으로 측정하였다. 어도비 포토샵^® 엘레먼트 소프트웨어를 사용하여, 세공과 TCP 그레인을 요술지팡이 도구로 선택하여 각각 의사 색채화(pseudocolor)하였다 (도 7). 세공의 크 기를 측정하기 위해, 의사 색채화된 이미지를 인쇄하고 10개의 최대의 세공을 측정하였다. TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 측정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 선택 영역의 픽셀의 총 수를 계수하였다. 그런 다음, 세공을 요술지팡이 도구를 사용하여 선택하고 세공과 관련된 픽셀 수를 계수하였다. 최종적으로, TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 세공과 관련된 디지털 이미지의 픽셀 수로 상기 선택된 표면적의 총 픽셀 수의 백분율로서 계산하였다. TCP-01은 0.95±0.28㎛보다 작은 세공 및 22.4%의 세공 면적 백분율을 갖는 한편, TCP-02는 1.04±0.33㎛보다 작은 세공 및 4.4%의 세공 면적 백분율을 갖는다.

2.4. 단백질 흡착도

단백질 흡착도를 시험하기 위해, 1ml의 TCP 세라믹을 25ppm NaN₃의 3ml 1% 우태아혈청 (FBS) 용액에 담갔다. 시료를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후, BCA™ 단백질 분석 키트 (피어스 바이오테크놀로지 사, Rockford IL, USA)를 사용하여 단백질 정량분석을 수행하였다. 24시간 후에, TCP-01는 3ml의 1% FBS로부터 60±3%의 단백질을 흡착한 것으로 나타났고, TCP-02는 18±2%을 흡착하였다 (도 8 참조).

2.5. 골 형성 능력

골 형성 능력을 시험하기 위해서, 1ml의 TCP-01 및 TCP-02의 세라믹 입자를 8마리의 개의 등근육에 이식하였다. 12주 후, 동물들을 희생시키고 시료를 주변 조 직과 함께 수확하였다. 그런 다음 시료를 수확하고 완충 포르말린으로 고정시키고 탈수시키고 MMA에 함몰시켰다. 탈회되지 않은 단편을 제조하여 조직학적 관찰 및 조직형태측정을 위해 메틸렌 블루와 염기성 푹신으로 염색하였다. 개의 근육에 이식 12주 후 TCP-01 이식물 모두(n=8)에서 풍부한 뼈가 형성되었으며, TCP-02에서는 뼈가 하나도 발견되지 않았다 (도 9). TCP-02에서의 골 면적 백분율은 15±9%였다.

2.6. 결론

상기 두 인산 삼칼슘 세라믹의 그레인 크기, 세공 크기, 세공의 면적 백분율, 단백질 흡착도 및 골형성 능력을 고려할 때, 그레인 크기, 세공 크기, 세공의 면적 백분율, 단백질 흡착도와 골형성 능력 사이에 관계가 발견되었다. 더 작은 그레인 크기, 더 높은 세공의 면적 백분율, 및 더 많은 단백질 흡착량을 갖는 TCP-01은 보다 높은 골형성 능력을 가졌으며, 이에 향상된 인산 칼슘 세라믹이다. 상기 향상된 인산 칼슘 세라믹은 따라서 그레인 크기가 1.50㎛보다 작고(0.10-1.50㎛ 사이), 세공 크기가 1.50㎛보다 작으며(0.10-1.50㎛ 사이), 10%보다 큰 인산 칼슘 세라믹 표면 상의 세공의 면적 비율 (10-40%) 및 40% 단백질보다 큰(40-80%) 값과 동등한, 24시간 안에 3ml의 1% 우태아혈청 용액으로부터 1.0ml(또는 약 400mg)의 다공성 세라믹 입자(총 공극률이 80%)로의 단백질 흡착도가 더 높은 인산 칼슘 세라믹으로 정의된다.

실시예 3 인산 칼슘 분말 유형이 세라믹 특성에 미치는 영향

본 실시예는 개선된 인산 칼슘 세라믹을 위한 인산 칼슘 분말을 기술한다.

3.1. 인산 칼슘 분말

다양한 방법으로 및 다양한 형태와 크기를 갖는 4개의 TCP 분말이 본 실시예에 사용되었다. 이들은 분말 A, 분말 D, 분말 E, 및 분말 F이었다. 분말 A와 E는 오븐 건조 분쇄된 한편 분말 D와 F는 분사 건조되었다.

4개 분말 모두 서로 유사한 정규 입자 크기 분포를 가졌으나 (도 10), 입자 크기가 달랐다. 다양한 분말에 대한 D(v.0.5)에서의 입자 크기는: A, 2.79㎛; D, 11.60㎛; E, 2.82㎛, F, 7.80㎛이었다. 주사 전자 현미경으로 비교한 바에 따르면, 분말 A와 분말 E는 보다 작은 불규칙적 입자를 가진 한편, 분말 D와 분말 F는 보다 크고 구형인 입자를 가졌다 (도 11).

3.2. 인산 칼슘 세라믹의 제조

TCP 분말을 희석된 H₂O₂ 용액(0.1-5.0%) 및 나프탈렌 입자(<1400㎛)와 혼합하여 슬러리를 형성하였다. 상기 슬러리를 40-70℃에서 기포화시키고 80-110℃에서 건조시켜 성형체를 제공하였다. 그런 다음 상기 성형체를 8시간 동안 1100℃에서 소결하였다. 마지막으로 세라믹 입자 (1-2mm)를 제조하고, 세척, 건조 및 121℃에서 멸균하였다. 4가지의 인산 삼칼슘 분말로부터 각각 4가지의 인산 칼슘 세라믹을 제조하였다. 이들은 세라믹 A(분말 A 유래), 세라믹 D(분말 D 유래), 세라믹 E(분말 E 유래) 및 세라믹 F(분말 F 유래)였다.

3.3. 그레인 크기

4가지의 TCP 세라믹의 그레인 크기는 5000배로 확대된 주사 전자 현미경 사 진에서 측정하였다. 어도비 포토샵^? 소프트웨어를 사용하여, 상기 세라믹의 가장 큰 그레인을 표시하고 측정하였다 (도 12). 각 TCP 세라믹 당 10 개의 그레인을 표시하고 측정하였다. 가장 큰 그레인의 크기는 세라믹 A에서 1.14±0.12㎛, 세라믹 D에서 1.56±0.36㎛, 세라믹 E에서 1.01±0.10㎛ 및 세라믹 F에서 1.30±0.31㎛였다.

3.4. 세공 크기 및 세공의 면적 백분율

TCP 세라믹의 세공 크기를 2500배 확대한 주사 전자 현미경 사진으로 측정하였다. 어도비 포토샵^? 엘레먼트 소프트웨어를 사용하여, 세공과 TCP 그레인을 요술지팡이 도구로 선택하여 각각 의사 색채화(pseudocolor)하였다 (도 13). 세공의 크기를 측정하기 위해, 의사 색채화된 이미지를 인쇄하고 10개의 최대의 세공을 측정하였다. TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 측정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 선택 영역의 픽셀의 총 수를 계수하였다. 그런 다음, 세공을 요술지팡이 도구를 사용하여 선택하고 세공과 관련된 픽셀 수를 계수하였다. 최종적으로, TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 실시예 2에 기술된 바와 같이 계산하였다. 각각의 세공 크기 및 세라믹 표면상의 세공 면적 백분율은 세라믹 A에서 0.73±0.12㎛와 10.1%, 세라믹 D에서 1.23±0.33㎛와 14.5%, 세라믹 E에서 0.95±0.28㎛와 22.4% 및 세라믹 F에서 1.23±0.21㎛와 16.1%였다.

3.5. 단백질 흡착도

단백질 흡착도를 시험하기 위해, 1ml의 TCP 세라믹을 25ppm NaN₃의 3ml 1% 우태아혈청 (FBS) 용액에 담갔다. 시료를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후, BCA 키트를 사용하여 단백질 정량분석을 수행하였다. 24시간 안에, 세라믹 A는 3ml 1% 우태아혈청(FBS) 용액으로부터 48±4% 단백질을, 세라믹 D는 36±3%, 세라믹 E는 59±2% 및 세라믹 F는 41±2%를 흡착하였다 (도 14).

3.6. 결론

4가지의 TCP 분말로부터 제조된 세라믹들은, 상기 분말들이 제조된 방법 및/또는 입자 크기 및/또는 입자 크기 분포에 따라 다양한 특징을 나타내었다. 표 2는 분말 A [오븐 건조 분쇄, 불규칙적 입자로서 분말 입자 크기가 D(v.0.5)에서 2.79㎛], 분말 E [오븐 건조 분쇄, 불규칙적 입자로서 분말 입자 크기가 D(v.0.5)에서 2.82㎛] 및 분말 F [분사 건조, 구형 입자로서 분말 입자 크기가 D(v.0.5)에서 7.80㎛]로부터 제조된 세라믹이 매우 유사한 특징을 가지며, 특히 작은 그레인 크기와 조합되어 개선된 단백질 흡수도를 나타냈다. 한편 분말 D[분무 건조, 구형 입자로서 분말 입자 크기가 D(v.0.5)에서 11.60㎛]로부터 제조된 세라믹 D는 1.5㎛ 초과 크기의 그레인과 합하여 감소된 단백질 흡수력을 나타냈다. 따라서, 불규칙적 형태를 가지며 D(v.0.5)에서 분말 입자 크기 2.00-4.00㎛를 갖는 오븐 건조 분쇄 분말이 개선된 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 데 바람직한 한편, 8.0㎛ 초과의 구형 입자를 갖는 분사 건조 분말은 덜 적절한 것으로 결론지었다.

표 2. 서로 다른 분말로부터 제조된 세라믹의 특징

실시예 4 개선된 골유도 특성을 갖는 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법

본 실시예는 등압성형법(isostatic pressing)을 사용하는 방법과 비교하여 H₂O₂를 기포제로 사용하는 본 발명의 방법을 사용하는 인산 칼슘 세라믹의 제조를 기술한다.

4.1. 인산 칼슘 분말

본 실시예에 사용된 인산 칼슘 분말은 D(v.0.5)에서 7.80㎛의 크기의 구형 입자를 갖는 분사 건조된 인산 삼칼슘 (TCP) 분말이다.

4.2. 세라믹

본 명세서에서 TCP-H₂O₂ 및 TCP-압축으로 참조되는 두 가지의 세라믹 입자를 제조하였다.

TCP-H₂O₂는 H₂O₂를 기포제로 사용하여 제조하였다. 간략하게는, TCP 분말을 희석된 H₂O₂ 용액(0.1-5.0%) 및 나프탈렌 입자(<1400㎛)와 혼합하여 슬러리를 형성 한 다음, 슬러리를 40-70℃에서 기포화시키고 80-110℃에서 건조시켜 성형체를 제공하였다. 그런 다음 상기 성형체를 8시간 동안 1100℃에서 소결하였다. 마지막으로 분쇄하여 세라믹 미세입자 (212-300㎛)를 제조하고, 입자를 세척 및 건조시켰다.

TCP-압축은 등압성형법으로 제조하였다. TCP 분말을 물과 혼합하고, 먼저 1MPa에서 1분 동안 압축한 다음, 5MPa로 5분 동안 압축하였다. (원통 형태의) 수득된 물질을 60℃에서 건조시키고 1100℃에서 소결하였다. 마지막으로 분쇄함으로써 세라믹 미세입자 (212-300㎛)를 제조하고, 입자를 세척 및 건조시켰다.

4.3. 그레인 크기

두 TCP 세라믹의 그레인 크기를 5000배로 확대된 주사 전자 현미경 사진에서 측정하였다. 어도비 포토샵^? 소프트웨어를 사용하여, 상기 세라믹의 가장 큰 그레인을 표시하고 측정하였다 (도 15). 각 TCP 세라믹 당 10 개의 그레인을 표시하고 측정하였다. 가장 큰 그레인의 크기는 TCP-H₂O₂에서 1.15±0.21㎛, TCP-압축에서 1.07±0.20㎛였다.

4.4. 세공 크기 및 세공의 면적 백분율

두 TCP 세라믹의 세공 크기를 2500배 확대한 주사 전자 현미경 사진을 사용하여 측정하였다. 어도비 포토샵^? 엘레먼트 소프트웨어를 사용하여, 세공과 TCP 그레인을 요술지팡이 도구로 선택하여 각각 의사 색채화(pseudocolor)하였다 (도 16). 세공의 크기를 측정하기 위해, 의사 색채화된 이미지를 인쇄하고 10개의 최대 의 세공을 측정하였다. TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 측정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 선택 영역의 픽셀의 총 수를 계수하였다. 그런 다음, 세공을 "요술지팡이" 도구를 사용하여 선택하고 세공과 관련된 픽셀 수를 계수하였다. 최종적으로, TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 실시예 2에 기술된 바와 같이 계산하였다. 각각의 세공 크기 및 세라믹 표면상의 세공 면적 백분율은 TCP-H₂O₂에서 1.28±0.10㎛와 14.1%, TCP-압축에서 1.04±0.45㎛와 5.4%이였다.

4.5. 단백질 흡착도

단백질 흡착도를 시험하기 위해, 1ml의 TCP 세라믹을 25ppm NaN₃의 3ml 1% 우태아혈청 (FBS) 용액에 담갔다. 시료를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후, BCA 키트를 사용하여 단백질 정량분석을 수행하였다. 24시간 안에, TCP-H₂O₂는 3ml 1% 우태아혈청(FBS) 용액으로부터 78±5% 단백질을, TCP-압축은 24±2%를 흡착하였다 (도 17).

4.6. 결론

H₂O₂ 방법 및 등압성형법으로 제조된 세라믹은 상이한 특징을 보였다. 표 3은 TCP-H₂O₂가 TCP-압축보다 더 높은 세공 백분율을 나타내고, 더 우수한 단백질 흡착 특징을 가진다는 것을 나타낸다. 따라서, 인산 칼슘 세라믹의 골유도 특성을 개선시키기 위해 H₂O₂ 방법이 등압성형법보다 바람직한 것으로 결론지어진다.

표 3. H₂O₂ 및 등압성형법으로 제조된 세라믹의 특징

실시예 5 소결 온도가 인산 칼슘 세라믹에 미치는 영향

본 실시예는 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법에서 소결 온도가 그에 따라 제조된 인산 칼슘 세라믹의 골유도 특성에 미치는 영향을 도시한다.

5.1. 인산 칼슘 분말

본 실시예에 사용된 인산 칼슘 분말은 D(v.0.5)에서 2.11㎛의 크기의 불규칙적 입자를 갖는 오븐 건조 분쇄된 TCP 분말이다.

5.2. 세라믹

세라믹들은 H₂O₂ 방법으로 제조하였으나, 1050℃, 1075℃, 및 1100℃의 서로 다른 온도에서 소결하였다. 간략하게는, TCP 분말을 희석된 H₂O₂ 용액 (0.1-5.0%) 및 나프탈렌 입자 (<1400㎛)와 혼합하여 슬러리를 형성한 다음, 슬러리를 40-70℃에서 기포화시키고 80-110℃에서 건조시켜 성형체를 제공하였다. 그런 다음 상기 성형체를 8시간 동안 각각 1050℃, 1075℃, 및 1100℃에서 소결하였다. 마지막으로, 세라믹 입자 (1-2mm)를 제조, 세척 및 건조하고 121℃에서 멸균하였다.

5.3. 그레인 크기

3개의 TCP 세라믹의 그레인 크기를 5000배로 확대된 주사 전자 현미경 사진에서 측정하였다. 어도비 포토샵^? 소프트웨어를 사용하여, 상기 세라믹의 가장 큰 그레인을 표시하고 측정하였다 (도 18). 각 TCP 세라믹 당 10 개의 그레인을 표시하고 측정하였다. 가장 큰 그레인들의 크기는 1050℃에서 소결된 TCP에서 1.30±0.12㎛, 1075℃에서 소결된 TCP에서 1.53±0.20㎛, 및 1100℃에서 소결된 TCP에서 1.53±0.20㎛이었다.

5.4. 세공 크기 및 세공의 면적 백분율

TCP 세라믹의 세공 크기를 2500배 확대한 주사 전자 현미경 사진을 사용하여 측정하였다. 어도비 포토샵^? 엘레먼트 소프트웨어를 사용하여, 세공과 TCP 그레인을 요술지팡이 도구로 선택하여 각각 의사 색채화(pseudocolor)하였다 (도 16). 세공의 크기를 측정하기 위해, 의사 색채화된 이미지를 인쇄하고 10개의 최대의 세공을 측정하였다.

TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 측정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 선택 영역의 픽셀의 총 수를 계수하였다. 그런 다음, 세공을 "요술지팡이" 도구를 사용하여 선택하고 세공과 관련된 픽셀 수를 계수하였다. 최종적으로, TCP 표면의 세공의 면적 백분율을 실시예 2에 기술된 바와 같이 계산하였다. 각각의 세공 크기 및 세라믹 표면상의 세공 면적 백분율은 각각 1050℃에서 소결된 TCP에서 0.58±0.09㎛와 24.2%, 1075℃에서 소결된 TCP에서 0.62±0.12㎛와 11.3%, 및 1100℃에서 소결된 TCP에서 0.47±0.19㎛와 4.5%였다.

5.5. 단백질 흡착도

단백질 흡착도를 시험하기 위해, 1ml의 TCP 세라믹을 25ppm NaN₃의 3ml 1% 우태아혈청 (FBS) 용액에 담갔다. 시료를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후, BCA 키트를 사용하여 단백질 정량분석을 수행하였다. 24시간 안에, 1050℃에서 소결된 TCP는 3ml 1% 우태아혈청(FBS) 용액으로부터 68±7% 단백질을 흡착하였고, 1075℃에서 소결된 TCP는 59±8% 단백질, 및 1100℃에서 소결된 TCP는 37±5% 단백질을 흡착하였다 (도 20).

5.6. 결론

서로 다른 온도에서 소결된 세라믹은 다양한 특징을 가졌다. 표 4는 1100℃에서 소결된 TCP가 1050℃ 또는 1075℃에서 소결된 TCP보다 더 큰 그레인 크기와 낮은 단백질 흡착력을 갖는다는 것을 보였다. 따라서, 인산 삼칼슘 세라믹의 특성을 개선하기 위해서, 소결 온도는 1100℃을 초과하지 않는 것이 바람직하고, 바람직하게는 약 1050℃-1075℃이어야 하는 것으로 결론지었다.

표 4. 각각 다른 온도에서 소결된 세라믹의 특징

Claims

0.1-1.50㎛의 범위의 평균 그레인 크기, 0.1-1.50㎛의 크기 범위의 세공을 포함하는 공극률을 갖고, 10-40%의 범위의 세공의 표면적 백분율을 갖는 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항에 있어서, 25ppm의 아자이드 나트륨(NaN₃)의 존재 하에서 3ml의 1% 우태아혈청(FBS) 수용액으로부터 1ml의 인산 칼슘에 의하여 37℃에서 24시간 후 흡수된 단백질의 백분율로 표현되는 단백질 흡착능이 40% 이상인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세공으로 이루어지는 공극률를 갖는 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘은 입자 크기가 50 내지 1500㎛의 범위를 갖는 미세입자의 형태인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제4항에 있어서, 상기 미세입자는 200 내지 300㎛의 범위의 입자 크기를 갖는 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘은 인산 팔칼슘, 인회석, 휘트록카이트(whitlockite), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제6항에 있어서, 상기 인회석은 수산화인회석 또는 탄산 인회석인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제6항에 있어서, 상기 휘트록카이트는 β-인산삼칼슘 또는 α-인산삼칼슘인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘은 이상성(biphasic) 인산 칼슘 (BCP) 또는 인산 삼칼슘인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제9항에 있어서, 상기 인산 삼칼슘은 β-인산삼칼슘인 것인 다공성 골유도 인산 칼슘.
제1항에 따른 다공성 골유도 인산 칼슘을 포함하는 의료 이식 물질.
제1항에 따라 정의된 다공성 골유도 인산 칼슘을 포함하는, 살아있는 생물에서의 골조직 형성 유도용 조성물.
단독의, 또는 성장 인자 또는/및 세포와 조합된 제1항에 따라 정의된 다공성 골유도 인산 칼슘을 포함하는, 비골성 부위에서의 자가골 생성을 위한 이식 물질.
성장 인자 또는/및 세포와 조합된 제1항에 따라 정의된 다공성 골유도 인산 칼슘을 포함하는, 의료 이식용 조성물.
제12항 또는 제14항에 있어서, 치과 수술용인 것인 조성물.
다공성 골유도 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 방법으로서, 물 중에 1.0-8.0㎛의 입자 크기를 갖는 인산 칼슘 분말, 기포제 및 선택적으로 공극형성제의 수성 슬러리를 제공하는 단계; 상기 슬러리의 기포화를 유발하는 조건으로 슬러리를 처리하는 단계; 얻어진 기포화된 슬러리를 건조시키고 선택적으로 상기 공극형성제를 제거하여 다공성 성형체(green body)를 제공하고, 상기 다공성 성형체를 1050℃ 내지 1150℃의 온도에서 소결하여 다공성 소결 인산 칼슘을 제공하는 단계; 및 선택적으로 상기 소결된 인산 칼슘을 분쇄(milling)하여 입자로 하고, 50 내지 1500㎛의 범위의 입자 크기를 갖는 상기 입자를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 수성 슬러리는 물 중에 2.0-4.0㎛의 입자 크기를 갖는 인산 칼슘 분말, 기포제 및 선택적으로 공극형성제의 수성 슬러리인 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 입자는 212 및 300㎛ 체를 사용하여 수집되는 것인 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산 칼슘 분말은 0.01 내지 1.0㎛의 결정 크기를 갖는 결정으로 구성되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 인산 칼슘 분말은 0.05 내지 0.5㎛의 결정 크기를 갖는 결정으로 구성되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 기포제는 과산화수소인 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 공극형성제는 나프탈렌 입자를 포함하며, 상기 공극형성제는 80-110℃에서의 증발에 의해 제거되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 슬러리의 기포화를 유발하는 상기 조건은 상기 슬러리를 50-70℃로 가열하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 슬러리의 기포화는 다공성 성형체를 생성하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 건조 및 기포화된 슬러리는 TCP의 경우 1050-1100℃의 온도, 또는 HA 및/또는 BCP의 경우 1100-1150℃의 온도에서 소결되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 인산 칼슘 분말은 TCP 또는 BCP 분말인 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 수집된 미세입자는 후속적으로 아세톤, 에탄올 및/또는 물로 초음파 세척되고, 선택적으로 건조 및 멸균되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 인산 칼슘 분말은 입자가 불규칙적 형태를 갖는 오븐 건조된 분쇄된 분말인 것인 방법.
제1항에 따른 다공성 골유도 인산 칼슘을 포함하는 조직 골격 재료.
제13항에 있어서, 치과 수술용인 이식 물질.