CN1879899A - 柠檬酸化半水硫酸钙骨替代材料、其组合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柠檬酸化半水硫酸钙骨替代材料、其组合物及制备方法和应用,是通过以下制备方法制备得到的:取二水硫酸钙,加入柠檬酸,或还进一步加入金属转晶剂,混匀,放入蒸压釜内,高温高压反应后,取出,干燥即得。可应用在修复人体骨组织、治疗长骨干骺端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松疾病、作为治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病药物或生物因子的控缓释载体,具有制备工艺简单,降解速度缓慢,材料强度高,生物相容性好,可大幅降低医疗成本,应用前景广阔。
Description
本申请以申请日为2005年8月30日、名称为“一种柠檬酸化疛水硫酸钙骨移植替代材料、其组合物及其制备方法和应用”,申请号为200510093439.4的发明专利申请为优先权。
技术领域
本发明涉及一种骨移植替代材料,尤其涉及一种柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料、其组合物及其制备方法和应用。
背景技术
外伤、感染、外科肿瘤切除以及先天疾患外科治疗等造成的骨缺损的修复及重建问题一直是骨科和整形外科等相关学科的重要研究方向。迄今为止,自体骨移植仍然是骨缺损修复的主要方法,但是需要采用第二术区取骨,增加额外手术创伤和感染的机会,而且骨的来源有限。其次,异体骨(包括皮质骨、松质骨、脱钙骨)移植,又存在降解吸收缓慢、消毒、移植物病毒传播及免疫排斥反应等问题。由于生物材料具有免疫源性低、生物相容性好的优点,人们开始探讨生物材料用作骨移植替代物的研究,如羟基磷灰石、磷酸钙、珊瑚等,已经成为该领域研究的一个热点内容。
硫酸钙也是一种生物材料,早在1892年Dreesmann就报告用硫酸钙治疗8例骨缺损患者,其中6例患者为骨结核(其中3例骨结核空洞缺损消失,被新形成的新骨替代,1例患者有两个部位骨结核空洞缺损,其中一个痊愈,另一个未愈合,另外2例治疗失败),1例骨髓炎空洞缺损和1例第5掌骨内生软骨瘤刮除术后空洞缺损消失痊愈。这个报告引起了许多学者的兴趣,他们在临床中应用硫酸钙治疗各种骨缺损,同时也进行了动物实验,认为硫酸钙可以填充骨缺损,恢复骨的外形轮廓,阻止软组织长入,随着硫酸钙的降解吸收为血管和成骨细胞长入提供引导性支架。但是作为骨移植替代材料,这种早期应用的硫酸钙多为天然矿石经过煅烧烧制而成,材料纯度低,含杂质多,强度差,降解吸收速度太快,一定程度上影响了新骨的形成。如:煅烧石膏(Plaster of Paris,POP)作为骨移植替代材料目前已经有100多年的历史,大量的临床实践和实验结果研究表明POP突出的优点是体内能够降解吸收,其降解产物不干扰新骨的形成,但是存在降解吸收速度过快,约3周、缺乏必要的力学强度等问题。
因此如何延缓材料的降解速度使其接近新骨再生速度、提高材料本身的强度是材料学领域研究的任务。美国Wright公司将二水硫酸钙经特殊处理制成的半水硫酸钙具有强度大、纯度高、晶形均一特点,体内完全降解吸收时间为6-8周,动物实验和临床应用提示晶体形态均一、强度高的硫酸钙十分适合于作骨移植替代物。但美国Wright公司利用半水硫酸钙制备的Osteoset系列骨替代物由于制备工艺的限制,其产品价格十分昂贵,而且制备的半水硫酸钙降解速度还不够接近骨的生长修复速度。
发明内容
本发明的目的是提供一种骨移植替代材料,尤其提供一种柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料、其组合物及其制备方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
本发明提供了一种柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料,分子式为CaSO4·H2O,为短柱状规则的六面体晶形结构,晶形结构均一,自固化强度达到20Mpa-30Mpa以上,与煅烧石膏相比达到延缓降解速度30%-50%,接近新骨再生形成速度,所述柠檬酸化半水硫酸钙骨是通过以下制备方法制备得到的骨移植替代材料,包括以下步骤:取二水硫酸钙,加入柠檬酸,优选浓度为2‰-10‰的柠檬酸转晶剂,最好为4‰、5‰、6‰的柠檬酸,二水硫酸钙与柠檬酸加入比例为(0.5-1.5)∶1,最好为1∶1;或还进一步加入适量金属转晶剂,如硫酸铝、硫酸铁等,与柠檬酸配成复合转晶剂,金属转晶剂加入量优选为0.1-1‰,最好为0.5‰,二水硫酸钙与复合转晶剂加入比例仍为(0.5-1.5)∶1,金属转晶剂与柠檬酸配比比例适量即可;上述原料混匀,放入蒸压釜内,反应后,取出,干燥;所述干燥优选在鼓风干燥箱内,130℃温度下干燥3-4小时,即得。
所述方法中最好立即取出,干燥,研磨,过筛140-200目,最好180目,或更细的颗粒,得到柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料。
所述二水硫酸钙为已知的高纯度二水硫酸钙,优选为分析纯二水硫酸钙,所述蒸压釜温度为110℃-140℃,优选温度为127℃,压力为0.09-0.3Mpa,优选压力0.15Mpa,反应时间为4小时-8小时,优选反应时间为7小时。
本发明还提供了上述制备方法得到的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用;
所述柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用,是将该柠檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均匀后,体外自固化预制成型、或注射、或直接填充到骨损部位;所述固化液选自生理盐水、去离子水、乳酸林格氏液之一或其组合。
由于柠檬酸化半水硫酸钙的可注射性和自固化性、以及优良的抗压缩强度,本发明还提供了所述柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料实现微创技术在治疗长骨干骺端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松疾病方面的应用。
本发明还提供了所述柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在齿科领域治疗牙周病、牙髓病、下颌骨缺损、上颚窦扩大等疾病方面的应用。
本发明柠檬酸化半水硫酸钙的具有的降解吸收特性,可实现携带物质控制释放,并且柠檬酸化半水硫酸钙固化过程产热量小而对所载物质活性影响小,可作为骨疾病药物和生物因子的控缓释载体,实现药物和生物因子在植入部位的缓慢释放。
因此,本发明还提供了一种控释药物组合物,包括上述柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料,已知的药物或生物因子;
所述药物为治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的抗生素、化疗药物、抗结核药物;所述生物因子为治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的选自人类重组BMP-2、血小板释放的血小板衍化生长因子PDGF、转化生长因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或碱性成纤维细胞因子。
本发明还提供了所述控释药物组合物在制备治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的控释药物方面的应用,是将上述柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料作为药物或生物因子的控缓释载体,使药物和生物因子在植入部位的缓慢释放。
本发明具有以下优点和有益效果:
1、通过制备工艺的改进,使制备的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料更适宜作骨移植替代材料,具有优良的骨传导性,材料生物相容性好,能够在体内降解吸收,降解速度更接近新骨的再生速度,降解产物并不干扰骨的再生,同时具有原位固化的优点。本材料既可以直接用于临床手术中原位固化修复骨组织,注射、或直接填充到骨损部位,也可以体外预制成型用于填充修复骨缺损。同时可以作为药物、生长因子的控缓释载体。
2、以柠檬酸为添加剂,通过工艺改进制备出纯度高、晶形均一、具有良好生物相容性的医用外科级柠檬酸化半水硫酸钙,作为骨移植替代物。体内外实验检测显示该材料降解速度与骨的再生形成速度趋于一致,体外生物力学强度优于国外同类产品。用其作为化疗药物、抗生素、多种生长因子的控缓释载体,为临床治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连提供了新的思路与方法。同时开发研制半水硫酸钙的可注射剂型,利用微创技术可治疗长骨干骺端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松。
3、制备工艺简单,进一步延缓了材料的降解速度,提高了材料强度,生物相容性好,应用临床可以大幅降低医疗成本,应用前景广阔。
4、延缓了煅烧石膏的降解速度,体外实验研究表明生物相容性好,其饱和溶液对成骨细胞的增殖和分化具有一定促进作用。
为证明上述优点,本发明进行了以下试验以及实施例1的对比实验。
试验1:柠檬酸化硫酸钙对鼠成骨细胞增殖、分化的影响
1.材料和方法:
1.1硫酸钙溶液的制备:
实施例1制备的柠檬酸化硫酸钙由Co6025KGY照射消毒。将材料和DMEM液按照0.1g/ml比例混合37℃恒温保存10天,然后用细胞培养的培养基稀释成不同浓度含硫酸钙的培养液(100%浓度、25%浓度、6.25%浓度)。所有这些操作过程都在37度完成。
1.2成骨细胞的分离培养:
成骨细胞取自新生SD大鼠,用连续酶解法获得。无菌条件下取48h新生大鼠颅盖骨,用无血清的DMEM液冲洗,再用0.1%胶原酶II消化,清除脂肪、骨表面的被膜和软组织,用骨片剪剪成1~3mm3的小块,弃去酶溶液。再在0.1%胶原酶II中消化45min,弃去酶溶液。将骨块分散放置于100ml培养瓶内,加入含20%新生小牛血清的DMEM培养液内传代贴壁培养。所有实验用细胞传至第4代细胞,先用0.25%胰酶消化贴壁细胞,再用含10%新生小牛血清的DMEM培养液调至所需细胞浓度。每日观察细胞的形态变化及特征;并用碱性磷酸酶(ALP)细胞化学定性染色(采用偶氮偶联法)鉴定。
1.3MTT法测定存活细胞数:
表1 细胞毒性评估分级
评分 | RGR |
01234 | ≥100%75~99%50~74%25~49%1~25% |
四唑盐(MTT),化学名为3-(4,5)-2-唑噻-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝,活细胞中的脱氢酶可以将四唑盐还原成不溶于水的蓝色产物-甲赞(fromazan),并沉淀在细胞中,死细胞没有这种功能,二甲基亚芬可以溶解这种蓝紫色结晶物,溶液颜色的深浅与所含晶体量成正比,再用酶标仪比色测定OD值,该值反应线粒体的活动。消化后的第4代成骨细胞,用台盼蓝染色计算活细胞≥95%,按1×104/ml制备细胞混悬液,分别加于5块96孔板内,每孔200μL。培养24小时观察细胞贴壁后,换含不同浓度硫酸钙溶解液(100%浓度、25%浓度、6.25%浓度、空白对照)的培养液,培养1天、2天、3天、4天和5天,MTT法测定各孔OD值。细胞相对增殖率用于细胞毒性评价(表1),细胞相对增殖率=实验组吸光值/对照组吸光值。0-1级被认为对细胞没有毒性作用。
1.4核仁区嗜银蛋白颗粒染色分析:
消化后的第4代成骨细胞(1×104cells/200μl),传入含有盖玻片的6孔培养板内培养,待细胞爬片后,换含不同浓度硫酸钙溶解液的DMEM培养液培养72小时,取出长有细胞的盖片,进行AgNORs染色(将新鲜配制的1份2%明胶和2份50%硝酸银溶液均匀混合,滴加在样品上,室温避光染色40分钟,蒸馏水冲洗,5%NaS2O3浸染1分钟,蒸馏水冲洗,梯度酒精脱水和二甲苯透明,用树脂封片)。随机选取100个细胞,用油镜观察并计数AgNORs颗粒的数量,计算每个细胞核中所含该颗粒的平均数。
1.5硫酸钙对成骨细胞分化功能的影响:
消化后的第四代成骨细胞(1×104cells/200μl)接种24孔培养板内培养,细胞近铺满时加入含不同浓度硫酸钙溶解液的培养液培养3天,取上清液1备用。三蒸水洗涤,加入0.1%Triton x-100,4℃过夜,取上清液2。分别测定上清液2中的细胞碱性磷酸酶活性和上清液1中骨钙素含量。
1.6统计学方法:
数据以均数±标准差(MEAN±SD)表示,单因素方差分析,两两比较用t检验,p<0.05具有统计学意义。
2.结果:
2.1成骨细胞的培养与鉴定:
成骨细胞原代培养时形态呈梭形,胞核呈椭圆形。随着时间延长,胞体膨大,细胞变成长梭形或不规则形,并伸出数量、长短和形状各异的突起,显示出集落样生长趋势。集落中心相互重叠而致细胞轮廓不清晰,随着集落不断扩大,各集落间的外围细胞呈杂乱网络相互交织连接。碱性磷酸酶特异染色见细胞质中红色碱性磷酸酶阳性颗粒(图1)。
不同浓度硫酸钙溶解液中培养的成骨细胞缓慢增殖(图2),其中4倍稀释100%浓度硫酸钙溶解液对成骨细胞的增殖具有一定促进作用(Compared to control,P<0.01=。100%浓度硫酸钙溶解液中培养的成骨细胞增殖相对缓慢,但相对增殖率>90%,根据10993-5细胞毒性评价标准细胞毒性评价为1级。
2.2核仁区嗜银蛋白颗粒分析:
长满细胞的盖玻片经Ag-NOR颗粒染色后,光学显微镜下可见细胞核内分布大小不等的散在棕黑色颗粒(图3)。4倍稀释硫酸钙溶解液培养的成骨细胞细胞核内Ag-NOR颗粒数量与对照组相比显著增多(P<0.01),100%浓度组和16倍稀释组则无差异(P>0.05)(表2)。
2.3硫酸钙对大鼠成骨细胞ALP活性的影响:
100%浓度硫酸钙溶解液中培养的成骨细胞细胞内碱性磷酸酶含量显著高于空白对照组(P<0.01),而4倍和16倍稀释组相对空白对照组无显著性差异(P>0.05)(表2)。
2.4硫酸钙对成骨细胞分泌骨钙素的影响:
表2 硫酸钙对成骨细胞功能的影响
含柠檬酸化硫酸钙溶液相对浓度 | AgNORs颗粒平均数(/cell) | 碱性磷酸酶活性(U/L) | 骨钙素分泌量(ng/ml) |
100%25%6.25%Control | 2.6±0.53.0±1.4**2.3±0.72.4±0.3 | 20.683±5.216**12.083±1.24811±0.9678.333±1.852 | 4.475±1.149**3.745±0.384*2.335±0.6271.988±0.445 |
FP | 13.73950.000 | 20.6840.000 | 10.5470.001 |
单因素方差分析.*P<0.05,**p<0.01,vs..Control group.
100%浓度硫酸钙溶解液和4倍稀释溶解液中培养的成骨细胞分泌的骨钙素含量显著高于空白对照组(p<0.01),而16倍稀释组与空白对照组相比无显著性差异(p>0.05)(表2)。
三、结论:
我们在实验中发现硫酸钙这种溶解性对成骨细胞功能活动无毒性作用、并且一定程度上刺激成骨细胞的增殖和分化。
试验2:柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及其生物相容性评价
1.材料和方法:
1.1材料:实施例1制备的柠檬酸化半水硫酸钙粉末,经Co60照射消毒备用,照射剂量为2.5兆拉得。
1.2方法:红细胞溶血试验:取材料粉末按照0.1kg/L浸于生理盐水中37℃恒温预热30min制备浸提液。浸提液(100%原液、50%稀释液、25%稀释液及阳性对照蒸馏水和阴性对照生理盐水)中加制备好的稀释抗凝兔血,振荡器混匀,恒温水浴60min,2000r/min离心5min,吸取上清液,用分光光度计在波长545nm处测定吸光度。按下式计算溶血率。标准:≤5%为正常。红细胞溶血率(%)=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%
1.3细胞毒性试验:采用四甲基偶氮唑盐比色法。取材料粉末按照0.1kg/L浸于DMEM培养液中37℃恒温保存10d制备浸提液。将兔骨髓基质干细胞经复苏、传代后,于对数生长期经胰蛋白酶消化制成10×106L-1的细胞悬液,接种于96孔培养板,37℃体积分数为0.05CO2培养箱内培养,24h后进行浸提液交换(100%浸提液、50%浸提液、25%浸提液、DMEM空白培养液)。分别在第1,3,5,7天取出1块培养板,加入10μL CCK-8试剂(Cell countingkit-8,CCK-8,DOJINDO Laboratories)培养4 h后,用酶标仪在波长500nm处测定吸光度。计算相对增殖率。相对增殖率=实验组吸光度/对照组吸光度。
1.4细胞粘附和生长形态观察:骨髓基质干细胞加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基内,稀释成10×106L-1密度。将直径3mm高2mm的材料放入48孔培养板内,细胞悬液滴在材料表面,1h后加入培养基,连续培养3d,倒置相差显微镜下观察材料边缘细胞贴壁生长情况。其中第3天倒掉培养基后,用体积分数为0.95乙醇固定,于环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况。
1.5热原试验:经体温试验筛选合格的3只普通级新西兰家兔,[解放军总医院动物实验中心提供,许可证号SCXK-(京)2002-0005],实验前测体温3次,确定其正常体温。自耳缘静脉缓慢注入浸提液后,定时测兔体温3次,确定其升高度数。标准:每只体温升高在0.6℃以下,3只体温升高总度数小于1.4℃。
1.6皮内注射实验:按照0.1kg/L制备材料的花生油、DMEM浸提液,高温消毒备用。选健康新西兰家兔3只,沿脊柱两侧剃毛,清洁暴露皮肤,酒精消毒。一侧选择10个点。每点间隔2cm,5个点注射DMEM浸提液,另外5个点注射DMEM空白对照液。同法在另一侧选择10个点,5点注射植物油浸提液,另外5个点注射植物油空白对照液。每个点注射0.2mL。参照标准进行评价。
1.7致敏实验:浸提液制备同前,将浸提液与完全氟氏佐剂等体积混合,用力搅拌数分钟至完全乳化,阳性对照采用40g/L甲醛溶液,阴性对照采用生理盐水。豚鼠背脊柱两侧6点对称皮内注射相应剂型试剂,1周后注射部位以石蜡液涂布,24h后贴敷相应剂型的饱和滤纸片固定并留置48h。14d后在豚鼠一侧腹部贴敷同前滤纸片并固定留置24h。除去贴敷物24h后观察腹部激发部位皮肤反应,并按标准分级。
2结果:
2.1描述性统计:
2.1.1材料特性:制备材料2h固化抗压缩强度达到26MPa,初凝时间5min,终凝时间20min。扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构,见图4a,图4b,,图4c。煅烧石膏晶体结构不匀一,呈雪花状、粒状、块状,见图5。
2.1.2细胞粘附与生长形态:骨髓基质干细胞围绕材料边缘生长,随着时间递增,镜下统计细胞数目逐渐增加。整个实验观察过程中未见细胞变形或坏死,材料组与空白对照组的细胞形态及粗略计数无显著性差异。环境扫描电镜观察见细胞贴附材料表面生长,呈不规则的梭形、多角形,胞体伸出伪足长短不等,见图6。
2.1.3红细胞溶解实验:红细胞溶血率为0.34%,远小于5%的阳性标准,说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应。
2.1.4热源反应:家兔平均体温升高为0.1℃,<1.4℃,符合医用材料的热源反应要求,说明本材料本身不具有致热源作用。
2.1.5皮内注射:两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑,水肿反应,提示材料对动物机体没有刺激性。
2.1.6致敏实验:致敏率为0,与阴性对照没有差别,说明材料没有致敏性。
2.2统计推断:
2.2.1细胞毒性实验:细胞毒性实验的检测结果相对增值率,见表3。
表3 不同浓度材料浸提液对细胞增殖毒性实验结果
组别 | 培养1天 | 培养3天 | 培养5天 | 培养7天 | ||||||||
吸光度值 | 相对 | 毒级 | 吸光度值 | 相对增 | 毒 | 吸光度值 | 相对 | 毒级 | 吸光度值 | 相对 | 毒级 | |
100%原液50%原液25%原液空白对照 | 0.32±0.010.34±0.020.35±0.020.36±0.02 | 88.994.497.2100 | 1110 | 0.81±0.020.84±0.030.78±0.10.83±0.07 | 97.6101.293.9100 | 1010 | 0.93 ±0.051.19±0.140.96±0.11.00±0.05 | 9311996100 | 1010 | 1.12±0.061.27±0.041.2 8±0.111.22±0.03 | 91.8104105100 | 1000 |
细胞毒性实验的检测结果提示实验组相对增殖率和对照组无显著性差别,评分为0~1级,说明材料本身不具有细胞毒性。
3.结论:
制备的柠檬酸化半水硫酸钙材料无细胞毒性、不溶血、不致热、不致敏、生物相容性良好,能满足作为骨移植替代材料的基本要求。
试验3:与美国Wright公司半水硫酸钙骨移植替材料(商品名OsteosetR)动物体内植入对比试验
下面对比本方法的得到的半水柠檬酸化硫酸钙(英文缩写为CcaS)和美国Wright公司半水硫酸钙骨移植替材料(OsteosetR)动物体内植入对比试验。OsteosetR是美国FDA批准使用的骨移植替代物,本试验将CCaS和OsteosetR植入兔股骨远端包容性骨缺损内、观察比较它们对骨缺损区周围组织作用以及对骨修复活动的影响。试验的目的是对比实施例1柠檬酸化硫酸钙和OsteosetR对周围组织作用及对骨修复活动的影响。
1.材料与方法:
1.1实验动物:成年雄性新西兰大白兔,体重3.5-4Kg,由解放军总医院动物实验中心提供。
1.2包容性骨缺损模型的制备:实验用新西兰兔,氯氨酮与速眠新II肌肉注射麻醉,仰卧位,常规消毒铺巾,选膝关节外侧切口,切开皮肤、皮下、关节外侧支持带,显露股骨远端,于侧副韧带与兔腓侧韧带起点之间中点处平行膝关节横轴钻一直径5mm、长12mm的圆柱形骨缺损。生理盐水冲洗,填塞干纱布彻底止血。
1.3实验分组:新西兰兔18只,随机分为3组(见图7)。A组(12只)左侧植入实施例1制备的柠檬酸化硫酸钙(直径5mm,长10mm圆柱体),右侧植入OsteosetR(直径4.8mm,高3.2mm小药片×3片),B组(3只)左侧植入实施例1制备的柠檬酸化硫酸钙,右侧不植入材料作为对照。C组(3只)右侧植入OsteosetR,左侧不植入材料作为对照,术后3w(周)、6w、13w处死动物。
1.4观察内容:(1)一般观察:术后每天观察动物的活动、精神、饮食。观察手术部位有无皮肤红肿、感染、渗液以及脓肿情况。取材时详细观察周围组织的炎症反应。(2)普通X线检查:大体观察材料降解以及骨缺损修复情况。(3)组织学分析:动物处死后,剔除软组织进行塑料包埋,用低速金刚砂钻石切片机切成矢状位100微米厚度原位不脱钙薄片,流水反复冲洗,表面超净,Giemsa染色,用Imageplus CCD系统做骨组织计量学分析。
2.结果:
术后兔运动自如,无跛行,精神及饮食正常。术后1周,切口局部无红肿、流脓、裂开。术后2周切口完全愈合,切口缝线自动脱落。组织取材未见关节腔积液及周围组织炎症反应。
空白对照组仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织,中央被骨髓组织填充替代。6周时缺损区内新生骨小梁面积占缺损区面积仅为16.1±1.3%,13周时为18.6±2.3%。(见图8)
缺损区内CCaS和OsteosetR逐渐降解吸收,并被新生的骨组织替代,新生骨组织随时间逐渐成熟,骨小梁逐渐增粗,与正常骨小梁形态相似。不同时间点3周、6周、13周CCaS和OsteosetR缺损区内新生骨组织量及骨小梁粗度两者无显著性差异(见表4、表5、表6,图9、图10)。3周时,缺损区内CCaS和OsteosetR逐渐降解吸收,缺损区边缘可以见到新生骨组织,材料周边组织未见淋巴细胞浸润及异物巨细胞反应,材料剩余量CCaS组明显多于OsteosetR组(t=21.2,p=0)。6周时,缺损区填充的材料基本降解、被新生的骨组织替代,骨小梁相对正常骨小梁纤细,其中CCaS在缺损中心仍然有少量的材料未完全降解吸收、继续发挥材料引导新骨再生的作用,而OsteosetR组材料完全降解吸收。13周时,缺损区内未见材料残余,骨小梁与正常骨小梁厚度(14.01±3.1μm)接近。
表4 不同时间新骨形成占缺损区面积比
3周(%) | 6周(%) | 13周(%) | |
CCaSOsteosetR | 17.9±2.817.8±3.1 | 30.4±1.530.7±1.8 | 43.5±2.643.3±2.8 |
表5 不同时间剩余材料占缺损区面积比
3周(%) | 6周(%) | 13周(%) | |
CCaSOsteosetR | 32.8±1.9*11.5±1.2 | 3.1±0.50 | 00 |
CCaS vs.Osteoset:*p<0.01
表6 不同时间缺损区内新生骨小梁厚度
3周(μm) | 6周(μm) | 13周(μm) | |
CCaSOsteosetR | 7.02±1.316.16±2.01 | 9.66±0.789.85±0.62 | 9.88±1.6110.73±1.12 |
3、结论:
本实验证明CCaS降解速度慢于OsteosetR,降解产物不干扰新骨的形成,缺损区内新骨的形成量以及骨小梁的成熟程度在同一时间点两种材料无显著性差异,高倍镜下材料周围组织中未发现炎症刺激及异物排斥反应。本发明CCaS不仅避免了普通硫酸钙吸收速度过快、不能为新生骨再生提供引导性支架的缺点,同时也避免了羟基磷灰石因降解吸收速度过慢而抑制新骨再生的缺点。本发明CCaS和OsteosetR性质相似、修复骨缺损能力相当,其降解速度缓慢、更有利于发挥材料骨传导作用。CCaS制备工艺简单、原料来源广泛、费用低。因此,CCaS是一种非常有前途的骨移植替代材料。
试验4:与传统煅烧方法制备煅烧石膏的比较
将实施例1制备的5g柠檬酸化半水硫酸钙材料和煅烧石膏进行晶体衍射分析,显示两种材料均为半水硫酸钙,两者特征峰一样,具备自固化特性,但是制备材料的峰值明显高于煅烧制备的半水硫酸钙(见图11)。
将实施例1制备的5g柠檬酸化半水硫酸钙材料与1.5ml生理盐水,搅拌成糊状,注射入模具内固化;在100%湿度,37℃保持20分钟脱模,测量3小时抗压缩强度,达26Mpa。晶体衍射分析为半水硫酸钙。相比较,传统煅烧方法制备煅烧石膏抗压强度只有4Mpa。
试验5:
将实施例1制备的柠檬酸化半水硫酸钙与煅烧石膏按各自膏水比与生理盐水搅拌均匀,体外成型制成标准试件,直径2cm,高2.2cm,各自置于200ml生理盐水(恒温37℃)内,每日更换生理盐水并测量标准试件重量,材料80%降解的时间不同,制备材料约50天,而煅烧石膏只有30天,延缓了降解速度,每天的降解量降低了40%。
附图说明
图1为成骨细胞成集落样生长,碱性磷酸酶染色见成骨细胞胞质内红色颗粒×40。
图2:为在不同浓度硫酸钙溶解液中成骨细胞增殖曲线(MTT法)。
图3.为成骨细胞的细胞核内散在分布棕黑色颗粒×100
图4为柠檬酸化半水硫酸钙粉末扫描电镜观察:a:晶体结构大小均一(×350),b(×1500)、c(×1000):单晶体放大,呈短柱状规则的六面体结构。
图5为普通煅烧石膏粉末扫描电镜观察:晶体结构大小不一,形态各异(×700)
图6为环境扫描电镜观察:骨髓基质干细胞粘附在硫酸钙材料表面生长,呈多角形,胞体伸出伪足粘附在材料表面(×500)
图7为术后即刻X线正位像,股骨远端平行膝关节横轴圆柱形骨缺损(直径5mm,深10mm):a,OsteosetR组 b,CCaS组 c,空白对照,未植入材料。
图8为空白对照术后6周观察:a正位X像 b矢状位不脱钙骨组织切片Giemsa染色1×3.3缺损区边缘少量新生的骨组织,中央被骨髓组织替代。
图9为股骨远端正位X像:a~c OsteosetR组,a,术后3周。b,术后6周。c,术后13周。d~f CCaS组d,术后3周。e,术后6周。f,术后13周。X像提示两种材料逐渐被降解吸收,被新生的骨组织替代。
图10为股骨远端矢状位不脱钙骨组织切片Giemsa染色1×3.3::a~c OsteosetR组,a,术后3周。b,术后6周。c,术后13周。 d~f CCaS组d,术后3周。e,术后6周。f,术后13周。组织学提示两种材料逐渐被降解吸收,被新生的骨组织替代,骨小梁逐渐成熟,厚度逐渐增厚,其中CCaS被降解吸收速度慢于OsteosetR药片,结果与X线一致。
图11为煅烧石膏与本发明柠檬酸化硫酸钙晶体衍射图比较图。
具体实施方式
实施例1
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
将分析纯二水硫酸钙500克,添加5‰柠檬酸500ml,放入蒸压釜内,加热至127℃,加压至0.15Mpa,反应7小时,立即取出,放入鼓风干燥箱内,130℃干燥3小时,研磨,过筛180目,得到柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料。
实施例2
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
将分析纯二水硫酸钙750克,添加2‰柠檬酸500ml,放入蒸压釜内,加热至110℃,加压至0.09Mpa,反应4小时,立即取出,干燥,研磨,过筛140目,得到柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料。
实施例3
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
将分析纯二水硫酸钙500克,添加10‰柠檬酸500ml,放入蒸压釜内,加热至140℃,加压至0.3Mpa,反应8小时,立即取出,干燥,研磨,过筛200目,得到柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料。
实施例4
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
将分析纯二水硫酸钙700克,添加6‰柠檬酸500ml,放入蒸压釜内,加热至140℃,加压至0.3Mpa,反应8小时,立即取出,干燥,研磨,过筛200目,得到柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料。
实施例5
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
同实施例1,不同做将分析纯二水硫酸钙500克,添加4‰柠檬酸500ml。
实施例6
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
同实施例1,不同在于,还加入适量硫酸铝或硫酸铁0.5‰)。
实施例7
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
同实施例1,不同在于,还加入适量硫酸铝或硫酸铁0.1‰。
实施例8
柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替材料及其制备方法
同实施例1,不同在于,还加入适量硫酸铝或硫酸铁1‰。
实施例9
本发明提供了实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用,是将权利要求1的柠檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均匀后,体外自固化预制成型、或注射、或直接填充到骨损部位,所述固化液选自生理盐水、去离子水、乳酸林格氏液之一或其组合。
实施例10
本发明还提供了一种控释药物组合,含适量实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料和已知治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的抗生素、化疗药物或抗结核药物,所述药物为甲氨喋呤、顺铂、妥布霉素或万古霉素。
实施例11
本发明还提供了一种控释药物组合物,含适量实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料和已知治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的生物因子;所述生物因子的选自人类重组BMP-2、血小板释放的血小板衍化生长因子PDGF、转化生长因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或碱性成纤维细胞因子。
实施例12
本发明还提供了实施例10控释药物组合物在制备治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的控释药物方面的应用,是将实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料作为药物或生物因子的控缓释载体,使药物和生物因子在植入部位的缓慢释放。这是因为的具有的降解吸收特性,可实现携带物质控制释放,并且柠檬酸化半水硫酸钙固化过程产热量小而对所载物质活性影响小,因此可作为骨疾病药物和生物因子的控缓释载体,实现药物和生物因子在植入部位的缓慢释放。
实施例12
本发明还提供了实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在制备治疗长骨干垢端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松疾病方面的应用。是因为柠檬酸化半水硫酸钙硫酸钙的可注射性和自固化性、以及优良的抗压缩强度,可实现微创技术治疗长骨干垢端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松。
实施例13
本发明还提供了实施例1-8之一的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在齿科领域治疗牙周病、牙髓病、下颌骨缺损、上颚窦扩大等疾病方面的应用。
Claims (10)
1一种柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料,分子式为CaSO4·H2O,为短柱状规则的六面体晶形结构,晶形结构均一,自固化强度为20-30Mpa,降解吸收速度与煅烧硫酸钙相比可以延缓降解速度30-50%,所述柠檬酸化半水硫酸钙骨是通过以下制备方法制备得到的骨移植替代材料,所述制备方法包括以下步骤:取二水硫酸钙,加入浓度为2‰-10‰的柠檬酸转晶剂,加入比例为(1-1.5)∶1,或还可进一步加入适量0.1-1‰金属转晶剂,与柠檬酸配成复合转晶剂,混匀,放入蒸压釜内,反应后,取出,干燥即得。
2、根据权利要求1的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料,所述蒸压釜温度为110℃-140℃,压力为0.09-0.3Mpa,反应时间为4小时-8小时。
3、权利要求1或2的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用。
4、根据权利要求3的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用,是将权利要求1的柠檬酸化半水硫酸和已知的固化液混合均匀后,体外自固化预制成型、或注射、或直接填充到骨损部位。
5、根据权利要求4的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在修复人体骨组织中的应用,所述固化液选自生理盐水、去离子水、乳酸林格氏液之一或其组合。
6、权利要求1或2的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在治疗长骨干骺端与椎体压缩骨折后松质骨缺损及预防性治疗骨质疏松疾病方面的应用。
7权利要求1或2的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料在治疗牙周病、牙髓病、下颌骨缺损、上颚窦扩大疾病方面的应用。
8、一种控释药物组合物,包括权利要求1或2的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料,已知的药物或生物因子。
9、根据权利要求8的控释药物组合物,所述药物为治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的抗生素、化疗药物、抗结核药物;所述生物因子为治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的选自人类重组骨形态发生蛋白BMP-2、血小板释放的血小板衍化生长因子PDGF、转化生长因子β-TGF、金葡液骨折刺激愈合素或碱性成纤维细胞因子。
10、权利要求8或9的控释药物组合物在制备治疗骨肿瘤、骨结核、骨感染及骨缺损、骨不连疾病的控释药物方面的应用,是将权利要求1的柠檬酸化半水硫酸钙骨移植替代材料作为药物或生物因子的控缓释载体,使药物和生物因子在植入部位的缓慢释放。
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