CN103637978B - 一种稳定的含菠萝蛋白酶的凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定的含菠萝蛋白酶的凝胶，含有作为活性成分的菠萝蛋白酶和药学上可接受的载体PLGA-PEG-PLGA，具有稳定性良好，使用方便，作用迅速的特点，同时具有抑菌作用，用于蛋白变性修复、抗炎、止痛、增加抗生素效果，属于医药技术领域。

Description

一种稳定的含菠萝蛋白酶的凝胶

技术领域

本发明涉及一种的含菠萝蛋白酶的凝胶，具有在良好的稳定性，使用方便，作用迅速的特点，同时具有抑菌作用，用于蛋白变性修复、抗炎、止痛、增加抗生素效果，属于医药技术领域。

背景技术

菠萝蛋白酶（Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素）是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000，等电点为9.55，最适pH值：6～8。溶于水，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。尚有水解酰胺基键和酯类的作用。主要的医药用途包括可抑制肿瘤细胞的生长；对心血管疾病的防治是有益的。它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风，缓解心绞痛症状，缓和动脉收缩，加速纤维蛋白原的分解。能选择性地除皮，使新皮移植得以尽早进行。动物实验证明，菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不良影响。菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤)。将菠萝蛋白酶与各种抗生素（如四环素，阿莫西林等）联用，能提高其疗效。相关研究表明，它能促进抗生素在感染部位的传输，从而减少抗生素的用药量。据推断，对于抗癌药物，也有类似的作用。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。另外，菠萝蛋白酶还具有嫩肤、美白去斑的优异功效。基本作用原理：菠萝蛋白酶可作用于人体皮肤上的老化角质层，促使其退化、分解、去除，促进皮肤新陈代谢，减少因日晒引起的皮肤色深现象。使皮肤保养呈现良好白嫩状态。

在干燥或低湿的环境下，菠萝蛋白酶的失活发生在保存的前期，到后期趋于平稳，这是由于保存初期酶的湿度大于环境湿度，较高的水分赋予酶结构一定的柔性，酶活性中心的构象易发生变化。当酶与干燥环境达到平衡后，酶的水分减少，酶活趋于稳定。同时，在高湿环境下，酶活一直下降，其原因除了高水分增加了酶结构的柔性外，更重要的是由于蛋白酶的自水解作用。

但是由于药用菠萝蛋白酶原料的对高湿和温度敏感，在水溶液或水分较多的状态下很快降解失活，使其提供的剂型仅限于胶囊、粉剂等，需要临用前用溶剂调制，使用不便。

水凝胶是一种能够在水中溶胀并保持大量水而又并不溶解的亲水性聚合物，通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联构成三维网状结构。由于有大量的水分充斥于水凝胶聚合物网络中，因此整个材料具有了流体的性质，这与机体组织（含有大量水溶液）非常相似，湿润、柔软的表面还有与组织的亲和力大大减少了材料对机体组织的刺激，使得水凝胶的生物相容性比其他材料要好。另外，高分子水凝胶的网状结构还可以保护药物不被酶解或被胃酸破坏。根据水凝胶对外界刺激的响应情况可将其分为两大类：传统水凝胶（普通水凝胶）和智能水凝胶（环境敏感水凝胶）。前者对环境的变化不敏感，而后者对于外界微小的物理化学刺激，如温度、电场、磁场、光、pH、离子强度和压力等能够感知、处理并产生应答，表现为体积、形态等的显著变化。

温敏水凝胶是一类响应温度变化的智能材料，由亲水性聚合物形成的网络结构，当温度超过低临界溶液温度（LCST）时，体系发生溶液-凝胶转变；当温度超过高临界溶液温度（UCST）时，体系发生凝胶-溶液转变；反相温敏凝胶材料的特征是，低温下为液态,高温时转变成固态或半固态的凝胶。其优越性能正是在于其相变的特性。在体外是液态，用于生物体或体表，在局部形成一定机械强度的凝胶，控制药物缓慢释放。由于在体外为不定型的液体，在给药后可以随给药部位不同形成各种形状，特别是用于局部的体表使用时，达到无死角给药，而后形成均匀的附着凝胶层，更好的发挥药效，并有一定的屏蔽作用。

由于菠萝蛋白酶具有局部用药的潜质，为得到一种菠萝蛋白酶的局部用药，本发明进行了有关研究，发现使用水凝胶制剂可以解决菠萝蛋白酶在液体或半固体状态下的稳定性问题，为此本发明提供了一种稳定性良好的，使用方便的菠萝蛋白酶温敏性凝胶制剂。无需调剂，可直接涂抹于病患部位，作用迅速。

发明内容

本发明所提供一种含菠萝蛋白酶的水凝胶制剂，含有作为活性成分的菠萝蛋白酶和药学上可接受的载体；

本发明的水凝胶制剂，其中所述菠萝蛋白酶为经过提纯步骤获得的精制蛋白水解酶。其水解酶活力为每克15-18万单位；蛋白含量为16-20%。

其中所述精制蛋白水解酶的制备方法如下：

1.取一定量的外购菠萝蛋白酶，加入15-20倍的pH6.0-7.2，0.02-0.05M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌2-4小时，4000-10000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质；

2.收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液；

3.沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液；

4.进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶；

本发明的水凝胶制剂，其中所述药学上可接受的载体为LA:GA:PEG1500=6:1:3的重量比例进行聚合反应得到的PLGA-PEG-PLGA，该载体在25℃下20%的共聚物水溶液粘度为6.9mm²/s。与50%的甘油溶液具有相同粘度，其在浓度为25%时发生胶凝的温度为32℃，即在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变，本发明经过筛选发现该载体特别适合本发明的菠萝蛋白酶制剂。

本发明所述PLGA-PEG-PLGA是一种三嵌段聚合物，由混旋丙交脂、乙交酯聚乙二醇1500经过聚合反应聚合而成。

本发明优选使用LA:GA:PEG1500=6:1:3的重量比例进行聚合反应得到的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物，本发明的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物其制备方法如下：

1）称量混旋丙交脂6份、乙交酯1份、聚乙二醇15003份；

2）将混旋丙交脂、乙交酯置于40℃烘箱中挥水2h，同时将聚乙二醇1500放于140℃烘箱中挥水2h；

3）将挥水后的混旋丙交脂、乙交酯和聚乙二醇1500混与同一西林瓶中并加入催化剂异辛酸亚锡(0.1%，w/w)，真空封盖后压盖；

4）将封盖后的西林瓶放于140℃烘箱中使其反应12h，完毕后趁热倒出，自然冷却至室温，4℃纯化水溶解，全溶后加热至70℃产生沉淀弃去水层，再加4℃纯化水，重复操作3次，除去反应的单体化合物和低分子水溶性共聚物。

本发明的水凝胶制剂，制备方法如下：

取精制菠萝蛋白酶适量，用水溶解，加入到PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，在低于20℃条件下，搅拌溶解，补水到全量即得。

其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：10-30%，优选20%。

PLGA-PEG-PLGA的用量为：10-30%，优选20%。

其余为水。

溶解后，分装，得到可商用的制剂。

由于PEG嵌段对蛋白酶的亲和吸附作用，使其保持相对稳定的空间结构，增加了在高水分条件下的稳定性。

本发明的凝胶制剂，根据需要还可加入激动剂，所述激动剂选自：半胱氨酸、硫酸镁、氧化锌，其加入量根据各自的特点，加入适当的有效量即可。

其中半胱氨酸能够启动激动程序，二价的镁离子和锌离子，可以调高蛋白酶的活力效应。同时在作用于有渗出的炎症时，可以吸收局部的渗出液，有利于病部快速修复。

为此，本发明的水凝胶制剂，根据需要含有菠萝蛋白酶，药学上可接受的载体以及激动剂。

其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：10-30%，优选20%。

PLGA-PEG-PLGA的用量为：10-30%，优选20%。

激动剂的用量为：0.1-5%，

其余为水。

含有菠萝蛋白酶，药学上可接受的载体以及激动剂的本发明水凝胶制剂其制备方法如下：

取精制菠萝蛋白酶适量，用水溶解，加入激动剂溶解，加入到PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，在低于20℃条件下，搅拌溶解，补水到全量即得。

本发明之所以选择上述技术特征的PLGA-PEG-PLGA是经过筛选获得的，发明人经过筛选比较发现，只有上述技术特征的PLGA-PEG-PLGA最适合本发明，筛选过程如下：

在有限的范围内，采用不同的LA/GA比例以及不同的PEG投料量均可得到具备温敏性质的水凝胶，所制备的水凝胶为浅黄色至无色的粘性胶体。在反应体系中，增加LA投料比例，所得材料的相变温度降低；增加PEG的投料量，材料相变温度降低；在1000～1500的范围内，随着PEG分子量增加，材料的相变温度升高。按LA:GA:PEG1500=6:1:3的比例，在反应条件下可得到相变温度32℃（20%水溶液）的水凝胶，产率约30%（以无水物计）。

本发明经过筛选剔除的水凝胶基质包括：卡波姆，羧甲基纤维素钠，泊洛沙姆407，壳聚糖-甘油这些基质中，卡波姆和羧甲基纤维素钠与菠萝蛋白酶形成水凝胶后为半固体，不具备智能相变的特点，涂展性及与皮肤的附着力较差，且在后期稳定性考察过程中酶活力下降严重。以壳聚糖-甘油体系制备的温敏性凝胶，在后期稳定性发现菠萝蛋白酶酶活力下降显著。

泊洛沙姆407选取浓度为20%、30%、40%的浓度进行考察，在浓度大于20%时，有温敏性凝胶的特性，就浓度越高，溶液粘度越大，胶凝温度越低，从在20%浓度时不具备胶凝特性，到30%时胶凝温度为约20℃，40%时的胶凝温度约15℃；即使在添加了盐类及PEG等调整也未能得到理想胶凝温度的基质，不符合我们作为外用制剂，，故未选用。最终寻找到了LA:GA:PEG1500=6:1:3制备的PLGA-PEG-PLGA作为本发明的凝胶基质。具有合适的相变温度，即相变温度为32℃的要求，以适合菠萝蛋白酶。该凝胶基质在体外为不定型的液体，可以随给药部位不同形成各种形状，特别用于局部的体表使用时，达到无死角给药，给药感受体温作用后，形成均匀的附着凝胶层，更好的发挥药效，并有一定的屏蔽作用。

本发明名词术语的解释：

菠萝蛋白酶：是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。

酶活力：一定条件下（温度，pH，底物浓度等），酶催化某一化学反应的能力。其大小可用反应速度来表示。

精制蛋白水解酶：菠萝蛋白酶经进一步水解精制得到的酶和蛋白含量更高的产品。

PLGA-PEG-PLGA：由混旋丙交脂，乙交酯，聚乙二醇1500经过聚合反应聚合而成的三嵌段聚合物。

PEG：聚乙二醇

LA：丙交酯，包括混旋丙交脂，D型或L型丙交酯。

GA：乙交酯

混旋丙交脂：D,L-3,6-二甲基-2,5-二酮-1,4-二氧杂环己烷，化学式：C₆H₈O₄，外观：无色透明片状或针状晶体纯度（%）≥99.5熔点（℃）：124～128含水量（%）：≤0.4重金属含量（ppm）:≤5游离酸(mgNaOH/kg):≤1灰份（%）:≤0.05，物理化学性质：易水解，易聚合，应低温保存。

乙交酯：是白色片状晶体，熔点为84℃,溶于乙酸乙酯。沸点330℃。通常经有两种途径制备得到，,第一种途径是乙醇酸分子间相互反应酯化脱水生成较低分子量的聚乙醇酸,聚乙醇酸高温裂解环化生成乙交酯。第二种途径是利用卤代乙酸的金属盐如钾脱除金属卤化物生成乙交酯。乙交酯作为聚合单体,既可以均聚得到聚乙交酯,又可以和其他环状单体开环共聚,得到无规共聚物或嵌段共聚物,

聚乙二醇1500：为环氧乙烷和水缩聚而成的混合物，分子式以HO(CH₂CH₂O)nH表示，其中n代表氧乙烯基的平均数。性状为白色蜡状固体薄片或颗粒状粉末；略有特臭。本品在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。凝点本品的凝点（附录ⅥD）为41～46℃。黏度取本品25.0g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用毛细管内径为0.8mm的平氏黏度计，依法测定（附录ⅥG第一法），在40℃时的运动黏度为3.0～4.0mm<2>/S。

激动剂：影响酶的催化活性,能加速酶的催化作用的物质。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。

1、对创面的坏死组织去除实验：

在大鼠烧伤试验中，局部应用本发明的水凝胶制剂平均1.9天能完全清除创面，而对照组中胶原酶需要平均10.6天才有相似的效果。同时显示用本发明的水凝胶制剂进行脱痂的，发生继发感染为10%以下。

显示使用本发明的水凝胶制剂治疗烧伤，不会形成癍痕或者癍痕很小。

2、菠萝蛋白酶修复软组织的损伤

本发明的水凝胶制剂用于拳击手的脸部瘀伤、眼眶、嘴唇、胸部和臂部等部位的血肿，每天给药四次，连续4天或直至瘀伤消失，对照组的拳击手给予安慰剂，在服用本发明的水凝胶制剂的拳击手中58名瘀伤4天内完全消失，其余的16名8-10天也完全恢复了。对照组中只有10人在4天内完全恢复，其余的需要7-14天才恢复。

3、抗炎作用

16个口腔炎症病人一天用本发明的水凝胶制剂4次，3天后75%的病人只有轻微的炎症或炎症消失。而给予安慰剂的一组只有19%。

4、增加抗生素的抑菌效果

本发明的水凝胶制剂对诺氟沙星软膏、金霉素软膏、莫匹罗星乳膏、夫西地酸乳膏、红霉素软膏、新霉素软膏均有协同作用。

5、淡化黄褐斑

对81例两侧面部斑块面积大致相同的门诊黄褐斑患者随机分成2组，治疗组在左面部外敷本发明的水凝胶制剂，每次喷涂后涂抹均匀，2次/d。对照组在右面部外用丝白祛斑软膏，外涂患处，2次/d，疗程12w。结果治疗组与对照组的临床疗效相当，但治疗组的治愈率和安全性优于对照组。说明本发明的水凝胶制剂治疗黄褐斑有确切疗效，其临床治疗效果与丝白祛斑软膏相当，但治愈率和安全性优于丝白祛斑软膏。

6、止痛

对59名肌骨骼系统有钝伤的病人进行观察研究，在4个平行试验中用本发明的水凝胶制剂可以明显减轻水肿、静止状态疼痛、运动状态疼痛及触痛。

7、稳定性实验

对实施例4-7的本发明的水凝胶制剂的稳定性酶活力进行考察，测定方法为FIP法，以蓝蛋白为底物，经菠萝蛋白酶水解后，采用紫外分光光度计测定水解酪氨酸的浓度，计算出酶活力，考察初始值为100%计算一段时间后的酶活保存率。结果见表：

酶活性测定法如下：

菠萝蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生的酪氨酸在碱性条件下将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。1g固体酶粉(或1mL液体酶)，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

以上数据表明在溶液状态存在的菠萝蛋白酶制剂稳定性在12个月，酶活与初始基本无显著变化，相对比与文献中菠萝蛋白酶在高湿条件下315天酶活性残存率仅14.4%有明显的稳定性优势，创造性的解决在溶液（高湿条件下）稳定性问题，突破性的提供了供临床应用的稳定的，使用方便的制剂。

具体实施方式：

以下对本发明的医药组合物做进一步具体说明，但并不仅限于以下实例。

实施例1：

菠萝蛋白酶的精制工艺：1）取一定量的菠萝蛋白酶，加入15倍的pH7.2,0.05M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌4小时，10000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质；

2）收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液；

3）沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液，

4）进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶。

上述方法得到的菠萝蛋白水解酶精制品，水解酶活力为每克18万单位；蛋白含量为20%。

实施例2：

菠萝蛋白酶的精制工艺：1）取一定量的菠萝蛋白酶，加入20倍的pH6.0,0.02M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌2小时，4000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质；

2）收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液；

3）沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液，

4）进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶。

上述方法得到的菠萝蛋白水解酶精制品，水解酶活力为每克15万单位；蛋白含量为16%。

实施例3：PLGA-PEG-PLGA

1）称量混旋丙交脂6g、乙交酯1g、聚乙二醇15003g；

2）将混旋丙交脂、乙交酯置于40℃烘箱中挥水2h，同时将聚乙二醇1500放于140℃烘箱中挥水2h；

3）将挥水后的混旋丙交脂、乙交酯和聚乙二醇1500混与同一西林瓶中并加入催化剂异辛酸亚锡(0.1%，w/w)，真空封盖后压盖；

4）将封盖后的西林瓶放于140℃烘箱中使其反应12h，完毕后趁热倒出，自然冷却至室温，4℃纯化水溶解，全溶后加热至70℃产生沉淀弃去水层，再加4℃纯化水，重复操作3次，除去反应的单体化合物和低分子水溶性共聚物。

实施例4：制成含精制菠萝蛋白酶20%的溶液

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶200g，用300ml水溶解，备用；在20-25℃条件下，取PLGA-PEG-PLGA200g，加水400g搅拌溶解；在低于20℃条件下，将精制菠萝蛋白酶溶液加入到载体基质中，搅拌溶解，并加加水定容至1000ml。灌封于喷雾给药装置中给药。在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变。

实施例5：制成含精制菠萝蛋白酶10%的溶液

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶100g，硫酸镁1g，用少量水溶解，作为含药溶液备用；在20-25℃条件下，取PLGA-PEG-PLGA300g，加水400g搅拌溶解；在低于20℃条件下，将含药溶液加入到载体基质搅拌溶解，加水定容至1000ml。

灌封于喷雾给药装置中给药。

在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变。

实施例6：含菠萝蛋白酶30%，氧化锌5%的混悬溶液。

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶300g，氧化锌50g，用300ml水溶解混悬，作为含药溶液备用；在20-25℃条件下，取PLGA-PEG-PLGA100g，加水400g搅拌溶解；在低于20℃条件下，将含药溶液加入到载体基质搅拌溶解，加水定容至1000ml。

灌封于喷雾给药装置中给药，用前应摇晃均匀。

在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变。

实施例7：含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸0.1%的凝胶制剂

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶200g，半胱氨酸1g，用少量水溶解，加入到20%的PLGA-PEG-PLGA的凝胶基质中，在低于20℃条件下，搅拌溶解,制成含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸0.1%的溶液；

灌封于喷雾给药装置中给药。在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变。

对比实施例8：含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸2%的凝胶制剂

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶200g，半胱氨酸20g，用200ml水溶解，备用；取卡波姆94010g，加水500ml浸泡过夜，加三乙胺调节pH值4-6，加主药溶液，搅拌均匀，加纯化水调节总量至1000ml。灌封于塑料软管中，供临床使用。

对比实施例9：含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸2%的凝胶制剂

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶200g，半胱氨酸20g，用200ml水溶解，备用；取壳聚糖20g（分子量95W，脱乙酰度91.3%）加1%的醋酸溶解，制成5%的溶液，加入100g甘油，磁力搅拌混合，并调节pH值到6.0；与含药溶液混合，搅拌均匀，加纯化水调节总量至1000ml。

对比实施例10：

含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸1%的凝胶制剂

采用以上实施例1所得精制菠萝蛋白酶200g，半胱氨酸10g，用200ml水溶解，备用；取羧甲基纤维素钠5g，加水500ml浸泡过夜，加主药溶液，搅拌均匀，加纯化水调节总量至1000ml。灌封于塑料软管中，供临床使用。

Claims (3)

1.一种含菠萝蛋白酶的水凝胶制剂，含有作为活性成分的菠萝蛋白酶，载体PLGA-PEG-PLGA和激动剂；

其中，所述菠萝蛋白酶为经过提纯步骤获得的精制蛋白水解酶，其水解酶活力为每克15-18万单位；蛋白含量为16-20%；其制备方法如下：

1） 取一定量的外购菠萝蛋白酶，加入15-20倍的pH6.0-7.2，0.02-0.05M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌2-4小时，4000-10000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质；

2) 收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液；

3) 1份沉淀物再用100份蒸馏水透析脱盐，脱去硫酸铵，得浓缩液；

4) 进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶；

其中，所述PLGA-PEG-PLGA在25℃下20%的共聚物水溶液粘度为6.9 mm²/s ，与50%的甘油溶液具有相同粘度，其在浓度为25%时发生胶凝的温度为32℃，即在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变；所述PLGA-PEG-PLGA是按LA:GA:PEG1500=6:1:3的重量比例反应得到，其制备方法如下：

1）称量混旋丙交酯6份、乙交酯1份、聚乙二醇1500 3份；

2）将混旋丙交酯、乙交酯置于40℃烘箱中挥水2h，同时将聚乙二醇1500放于140℃烘箱中挥水2h；

3）将挥水后的混旋丙交酯、乙交酯和聚乙二醇1500混于同一西林瓶中并加入重量比例为0.1%的催化剂异辛酸亚锡，真空封盖后压盖；

4）将封盖后的西林瓶放于140℃烘箱中使其反应12h，完毕后趁热倒出，自然冷却至室温，4℃纯化 水溶解，全溶后加热至70℃产生沉淀弃去水层，再加4℃纯化水，重复操作3次，除去反应的单体化合物和低分子水溶性共聚物；

其中，所述激动剂选自：半胱氨酸、硫酸镁、氧化锌；其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：10-30%，PLGA-PEG-PLGA的用量为：10-30%，激动剂的用量为：0.1-5%，其余为水。

2.根据权利要求1的水凝胶制剂，其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：20%，PLGA-PEG-PLGA的用量为：20%，激动剂的用量为：0.1-5%，其余为水。

3.权利要求1所述的水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

取精制菠萝蛋白酶100g，硫酸镁1g，用少量水溶解，作为含药溶液备用；在20-25℃条件下，取PLGA-PEG-PLGA　200g，加水400g搅拌溶解；在低于20℃条件下，将含药溶液加入到载体基质搅拌溶解，加水定容至1000ml；

或

取精制菠萝蛋白酶200g，氧化锌50g，用300ml水溶解混悬，作为含药溶液备用；在20-25℃条件下，取PLGA-PEG-PLGA　200g，加水400g搅拌溶解；在低于20℃条件下，将含药溶液加入到载体基质搅拌溶解，加水定容至1000ml；

或

取精制菠萝蛋白酶，半胱氨酸，用水溶解，加入到PLGA-PEG-PLGA的凝胶基质水溶液中，在低于20℃条件下，搅拌溶解，制成含菠萝蛋白酶20%，半胱氨酸2%的溶液。