CN114732005A - 一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用，将褪黑素和脯氨酸进行搭配，并限定其浓度使得其制成的冻存液，其中脯氨酸浓度为1.5～3mol/L；褪黑素的浓度为10‑3～10‑6mol/L。所得冻存液不仅单次冻存效率高，而且能解决多次冻融后脐带血单个核细胞的细胞活率和回收率低的问题，提高单个核细胞的细胞活率和回收率，提升单个核细胞的应用效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用。
背景技术
脐带血单个核细胞(Cord Blood Mononuclear Cell，CB-MNC)，指脐带血中具有单个核的细胞，包含造血干细胞、淋巴细胞、单核细胞等。在体内可促进机体造血，增进机体免疫力，在体外可诱导分化成多种免疫细胞，在抗肿瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，冻存脐带血单个核细胞具有重要意义。
目前对脐带血单个核细胞冻存主要集中于单次冻融的研究，而对反复冻融过程鲜有报道。当复苏后细胞制品由于各种原因而不能及时回输时候，需要进行再次冻融。经再次冻融后脐带血单个核细胞会出现一系列生理生化、形态结构及功能变化造成细胞活率和回收率低。为了减轻或避免反复冻融过程对细胞造成的损伤，使细胞在复苏后仍能保持正常的活性和功能，在进行超低温冻存时必须要加入冻存保护剂。因而，开发高效无毒的可反复冻存脐带血单个核细胞的超低温冻存保护剂具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种细胞冻存液，包含脯氨酸和褪黑素，所述脯氨酸浓度为1.5～3mol/L，所述褪黑素的浓度为10-3～10-6mol/L。
在本发明的一些优选实施方式中，所述脯氨酸浓度为1.5～3mol/L，所述褪黑素浓度为10-4～10-6mol/L。
在本发明的一些优选实施方式中，所述脯氨酸浓度为3mol/L，所述褪黑素浓度为10-4mol/L。
在本发明的一些优选实施方式中，所述脯氨酸浓度为1.5mol/L，所述褪黑素浓度为10-6mol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述冻存液中还包含20～40％(v/v)血浆。
在本发明的一些实施方式中，所述冻存液中还包含基础培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基为RPMI 1640培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为单个核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为脐带血单个核细胞。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的细胞冻存液在(a)～(d)任一项中的应用：
(a)细胞的冻存和/或冻存后复苏；
(b)制备细胞培养或细胞冻存相关产品；
(c)制备包含细胞的产品；
(d)制备细胞库。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为单个核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为脐带血单个核细胞。
本发明的第三方面，提供一种细胞的冻存方法，用本发明第一方面所述的冻存液冻存细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述冻存方法包含以下步骤：将细胞与本发明第一方面所述的冻存液进行混合，然后使用冻存程序冻存，然后转移至液氮中冷冻保存。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为单个核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为脐带血单个核细胞。
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的冻存液。
在本发明的一些实施方式中，所述产品可以为用于细胞培养的相关产品来获取细胞，例如试剂盒。
在本发明的一些实施方式中，所述产品还包含细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述产品可以为相关细胞制剂，所述制剂的形式为注射剂、粉剂、片剂、胶囊剂等常见剂型，其中冻存液可以作为辅料维持细胞活性。
在本发明的一些实施方式中，所述产品可以为细胞库。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为单个核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞为脐带血单个核细胞。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种高效无毒的可反复冻融脐带血单个核细胞的超低温冻存保护剂，将褪黑素和脯氨酸进行搭配，并限定其浓度使得其制成的冻存液，不仅单次冻存效率高，而且能解决多次冻融后脐带血单个核细胞的细胞活率和回收率低的问题，为脐带血单个核细胞反复冻融提供参考。
本发明中选取的两种冻存添加剂均为渗透性保护剂，渗透性保护剂之所以能够保护细胞，主要因为：(1)能够高度溶于水，有效降低凝固点并降低溶液化学势能，减少冰晶形成量；(2)能够渗透进细胞，降低冷冻过程中逐渐增高的电解质浓度并防止细胞过分收缩；(3)具有粘度的渗透性保护剂溶液可以有效的保护细胞膜，防止细胞堆积造成机械损伤而脯氨酸是细胞的有效渗透调节物质，可以快速进出细胞发挥保护作用，不仅冻存效率高，而且方便快捷。安全无毒，稳定蛋白质及其他生物大分子，保护酶和膜的结构，具有防止渗透压损伤和冰晶损伤的能力，维持细胞的生命特征和生物过程。
褪黑素是由人脑中器官松果体腺分泌的一种自然物质，不仅是一种高效的内源性抗氧化剂，能有效清除羟自由基、过氧亚硝基阴离子等活性氧，而且具有其它抗氧化剂所无法比拟的脂溶性和水溶性两种性质,能极易透过各种生理屏障到达体内任何部位发挥药理作用，同时还能维持细胞膜的通透性和渗透性功能。褪黑素可以提高细胞的抗氧化能力，抑制凋亡蛋白的产生，这可以有效的减少因多次冻融对细胞的损伤。
本发明针对于脐带血单个核细胞因各种原因不能及时回输时候，需要进行反复冻融，因此在结合脯氨酸与褪黑素各自的优势，经过摸索最终发现脯氨酸和褪黑素的最适浓度，联合添加可以降低反复冻融对单个核细胞的损伤，以提高单个核细胞的细胞活率和回收率，提升单个核细胞的应用效果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1冻存液的配制
本实施例中冻存液的配方见表1。
其中脯氨酸和褪黑素用基础培养基+30％(v/v)血浆制成各组细胞冻存液，分别添加到装有脐带血单个核细胞的冻存管中并将其与混匀。
基础培养基为：RPMI-1640。
表1冻存液配方
实施例2冻存效果检测
1、脐带血单个核细胞的制备
①将合格的浓缩脐带血转移至50mL离心管中，600g离心10min；
②离心后用移液器小心吸取上层血液，留下细胞层；
③用生理盐水重悬定容到30ml，缓慢添加到15ml淋巴细胞分离液Ficoll上，动作一定要轻柔，注意保持清楚的界面；
④600g离心30min，将离心机的升、降速率都调为3，离心后离心管从上往下共4层，分别为上层为血浆，中间层是以单个核细胞为主的白膜层，下层为分离液层，最下层为红细胞和粒细胞；
⑤吸取脐带血单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，800g离心10min，获得脐带血单个核细胞。
2、脐带血单个核细胞冻存
①将DMSO分别缓慢加入3支装有脐带血单个核细胞的冻存管中并将其与混匀；
②将冻存液1、冻存液2、冻存液3和冻存液4依次重复上述步骤①操作；
③将该15支冻存管按照标准的冻存程序冻存：先为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
3、脐带血单个核细胞复苏
①在冻存7天后，从液氮中将15支冻存管均取出，浸入37℃水浴中，振荡加强对流换热；
②从37℃水浴中取出15支冻存管，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液，加到12个新的50ml离心管；
③并加入10倍体积RPMI1640培养液，混匀；
④200g离心5min，弃上清液；
⑤分别向各离心管中加入4℃预冷RPMI1640培养基5ml，轻轻吹打混匀。
4、MTT检测脐带血单个核细胞的细胞存活率
①吸取上述12个脐带血单个核细胞，分别培养于96孔培养板，每孔100ml；
②置于37℃，5％CO2恒温培养箱孵育；
③3-4d后按顺序加入10μL 0.5％的MTT溶液；
④继续孵育培养6-8h后，细胞内会产生蓝色结晶；
⑤加入10μL 20％的SDS，继续孵育过夜，使结晶溶解；
⑥取出用酶标仪570nm比色，读取各组吸光度值，比较细胞存活率；
⑦检测脐带血单个核细胞的细胞存活率和细胞回收率：
利用MTT法检测脐带血单个核细胞的细胞存活率；应用全自动血细胞分析仪进行单个核细胞计数，计算单个核细胞回收率＝解冻后MNC/冻存前MNC×100％。
⑧脐带血单个核细胞单次冻融结果及分析。
结果见表2和表3。
表2脐带血单个核细胞单次冻融计数及回收率结果
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
表3脐带血单个核细胞单次冻融OD值
| 项目 | DMSO组 | 冻存液1 | 冻存液2 | 冻存液3 | 冻存液4 |
| 冻存前OD值 | 0.32±0.03 | 0.32±0.03 | 0.32±0.03 | 0.32±0.03 | 0.32±0.03 |
| OD值 | 0.30±0.05<sup>a</sup> | 0.23±0.01<sup>c</sup> | 0.29±0.01<sup>a</sup> | 0.21±0.01<sup>d</sup> | 0.26±0.01<sup>b</sup> |
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
结果表明，冻存液2与DMSO组无显著性差异，冻存液2显著高于冻存液1、冻存液3、冻存液4。这说明不同浓度的脯氨酸和褪黑素对脐带血单个核细胞冻存有保护作用，当脯氨酸浓度为3mol/L，褪黑素浓度为10-4mol/L时冻存效果最佳。表3与表2的结果基本相同，说明脯氨酸和褪黑素联合添加可以对脐带血单个核细胞的冻存具有保护作用。
5、为了进一步探究冻存液对脐带血单个核细胞多次冻融的保护作用，将复苏后的单个核细胞重新冻存回去操作步骤如上述冻存液实验中步骤2，在冻存7天后，分别取出5组脐带血单个核细胞进行解冻复苏；并检测脐带血单个核细胞的细胞存活率和细胞回收率。
利用MTT法检测脐带血单个核细胞的细胞存活率；应用全自动血细胞分析仪进行单个核细胞计数，计算单个核细胞回收率＝解冻后MNC/冻存前MNC×100％。脐带血单个核细胞单次冻融结果见表4和表5。
表4脐带血单个核细胞第二次冻融OD值
| 项目 | DMSO组 | 冻存液1 | 冻存液2 | 冻存液3 | 冻存液4 |
| OD值 | 0.18±0.01<sup>c</sup> | 0.19±0.01<sup>bc</sup> | 0.23±0.02<sup>a</sup> | 0.17±0.02<sup>c</sup> | 0.21±0.01<sup>b</sup> |
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
表5脐带血单个核细胞第二次冻融计数及回收率结果
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
从表4以及表5可以看出对脐带血单个核细胞进行第二次冻融，冻存液2与冻存液4OD值和回收率上显著高于DMSO组，且冻存液1在回收率上也显著高于DMSO组，这说明脯氨酸和褪黑素在多次冻融中保护脐带血单个核细胞的效果优于DMSO。
6、脐带血单个核细胞冻融3次
将复苏后的单个核细胞重新冻存回去操作步骤如上述冻存液实验中步,2。在冻存7天后，分别取出5组脐带血单个核细胞进行解冻复苏；并检测脐带血单个核细胞的细胞存活率和细胞回收率。
利用MTT法检测脐带血单个核细胞的细胞存活率；应用全自动血细胞分析仪进行单个核细胞计数，计算单个核细胞回收率＝解冻后MNC/冻存前MNC×100％。脐带血单个核细胞冻融3次结果见表6和表7。
表6脐带血单个核细胞冻融3次OD值
| 项目 | DMSO组 | 冻存液1 | 冻存液2 | 冻存液3 | 冻存液4 |
| OD值 | 0.13±0.01<sup>c</sup> | 0.14±0.01<sup>c</sup> | 0.22±0.01<sup>a</sup> | 0.14±0.01<sup>c</sup> | 0.19±0.02<sup>b</sup> |
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
表7脐带血单个核细胞冻融3次计数及回收率结果
注：同一行标有不同字母代表差异显著。
从表6和表7可以看出对脐带血单个核细胞冻融3次，冻存液2和冻存液4的OD值显著高于DMSO组且回收率为DMSO组的2倍以上，这说明脯氨酸和褪黑素对脐带血单个核细胞冻融3次细胞存活率和细胞回收率高有显著的促进作用，冻存效果显著优于传统方法(DMSO)。
综合上述实验结果：本发明将褪黑素和脯氨酸作为细胞冻存液，避免二甲基亚砜(DMSO)细胞毒性影响，对脐带血单个核细胞冻融2次冻存效果显著优于传统方法(DMSO)，同时对脐带血单个核细胞反复冻融3次仍能保持较高存活率和细胞回收率高，这为细胞反复冻融提供参考。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种细胞冻存液，包含脯氨酸和褪黑素；所述脯氨酸浓度为1.5～3mol/L；所述褪黑素浓度为10-3～10-6mol/L。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述脯氨酸浓度为1.5～3mol/L；所述褪黑素浓度为10-4～10-6mol/L。
3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中还包含20～40％(v/v)血浆。
4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中还包含基础培养基。
5.根据权利要求1～4任一项所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞为单个核细胞。
6.权利要求1～4任一项所述的细胞冻存液在(a)～(d)任一项中的应用：
(a)细胞的冻存和/或冻存后复苏；
(b)制备细胞培养或细胞冻存相关产品；
(c)制备包含细胞的产品；
(d)制备细胞库。
7.一种细胞的冻存方法，用权利要求1～4任一所述的冻存液冻存细胞。
8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述细胞为单个核细胞。
9.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～4任一项所述的冻存液。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包含细胞。
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|---|---|---|---|
| CN202210360536.9A CN114732005A (zh) | 2022-04-07 | 2022-04-07 | 一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN109430246A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-08 | 天津医科大学 | 一种无血清干细胞冻存液及干细胞冻存方法 |
| CN110432259A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-12 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 |
| CN113973805A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-28 | 北京京蒙细胞生物科技股份有限公司 | 细胞冻存试剂盒及其使用方法 |
-
2022
- 2022-04-07 CN CN202210360536.9A patent/CN114732005A/zh active Pending
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