CN113273566A - 一种甘氨酸作为公猪精液常温保存液中有效成分的应用 - Google Patents

一种甘氨酸作为公猪精液常温保存液中有效成分的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘氨酸作为公猪精液常温保存液中有效成分的应用，以甘氨酸、葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、Tris、碳酸氢钠、青霉素、链霉素和多黏菌素为主要成分，可以对精液于常温下以液态形式进行有效保存，提高了鲜精保存品质，延长了精液的保存时间，有利于提高优良种畜利用率并获得高受胎率；同时生产成本低，便于大规模推广应用。

Description

一种甘氨酸作为公猪精液常温保存液中有效成分的应用
技术领域
本发明涉及猪繁殖技术领域，特别涉及一种猪精液常温保存稀释液配方。
背景技术
猪人工授精技术主要包括精液采集、精液保存与运输、人工输精等环节，为提高公畜站工作效率、优良种猪利用率及使用年限以及加快种群扩繁速度、减少流行病传染、提高养殖户经济效益、加快猪产业发展提供了技术依据。猪精液保存作为猪人工授精技术中承上启下的关键环节，直接影响种公猪的利用率和母猪的配种、妊娠，目前国内外关于猪精液保存已经有了较为深入的研究，且相关研究成果表明营养物质组成、pH、氧化损伤和病菌污染等因素均影响猪精液的保存效果。精液的稀释和保存是猪人工授精关键技术环节，现阶段猪精液的保存方式根据保存温度可以分为冷冻保存、低温保存和常温保存。
冷冻保存是利用超低温控制精子代谢的一种保存技术，一般是将精子保存在液氮(-196℃)或干冰(-79℃)中。由于猪精子质膜中胆固醇与磷脂的比值低，对低温敏感，使其容易在保存过程中受到不可逆转的伤害，因而目前猪精液冷冻保存技术主要用于保存优良的公猪种质资源以及保护濒临灭绝地方品种。
低温保存是指将猪精液保存在0～5℃的低温下使猪精子的代谢水平下降，从而延长精子存活时间。但由于低温会导致猪精子冷休克死亡，目前在养猪生产中没有应用。
常温保存是指将猪精液保存在15～17℃，该温度下猪精子代谢受到抑制但并未损害精子。精液常温保存以其操作简单以及可以提高种猪利用率和获得高受胎率等特点，更加迎合以良种公畜的人工授精站为主的猪生产发展现状，全球范围内大约99％的猪人工授精都是采用的常温保存精液。
猪精液常温保存中，通过稀释液的组成成分、渗透压、pH值及精液的稀释倍数、保存温度共同决定对精液的保存效果，稀释液主要成分包括缓冲剂、营养剂和添加剂。商品化精液稀释液通常价格较高，增加了养殖成本。并且，常见的精液常温保存稀释液仅能使精子的活力保持在0.5～0.6一段有限的时间(大多数猪场采用的稀释液对精液的有效保存时间仅为2～3天)，不能满足对于扩大良种公畜站的辐射范围及种畜利用率的发展需要，影响人工授精技术的推广应用。
甘氨酸是一种中性氨基酸，价格低廉。甘氨酸在精液品质好的公猪精液中含量高，而在精液品质差的精液中含量低，表明甘氨酸对猪精子重要。中国专利CN107094755A报道了含有包括甘氨酸在内的多种氨基酸成分的稀释液配方，其中各氨基酸用于提供能量，但复合添加多种氨基酸可能会对精子产生毒害作用，随着精子代谢活动的持续进行这种作用愈发明显，从而无法延长精液有效保存时间。同时，该专利并未说明稀释液配方对精子提供能量的机制。
商品化稀释液Modena不含甘氨酸，仅能在一定保存时间范围内满足精子保存期间正常的能量需求，随着保存时间延长，其无法消除精子保存期间受到的不利因素，例如能量代谢降低、ROS产生增多等的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘氨酸作为公猪精液常温保存液中有效成分的应用，通过使用含有甘氨酸的稀释液对猪精液起到良好的常温保存效果，且成本低廉。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种猪精液常温保存稀释液，该常温保存稀释液的成分包括26～28g/L的葡萄糖、2.10～2.45g/L的EDTA二钠、6.8～7.0g/L的柠檬酸钠、2.8～3.0g/L的柠檬酸、5.55～5.75g/L的Tris、0.9～1.1g/L的碳酸氢钠、4～20万IU/L的青霉素、4～20万IU/L的链霉素、4～20万IU/L的多黏菌素和1～80mmol/L的甘氨酸。
优选的，所述常温保存稀释液的pH为7.15～7.25。
优选的，所述常温保存稀释液的成分包括27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、5.65g/L的Tris、1.0g/L的碳酸氢钠、10万IU/L的青霉素、10万IU/L的链霉素、4万IU/L的多黏菌素和40mmol/L的甘氨酸。
一种猪精液常温保存方法，包括以下步骤：
将上述常温保存稀释液与猪精液混合后于15～20℃下进行保存。
优选的，所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述常温保存稀释液进行稀释，并将猪精子的密度稀释至0.4～0.6×108个/mL。
优选的，所述常温保存稀释液在与新鲜猪精液混合前预先加热至37～38.5℃(例如，与新鲜猪精液等温)。
优选的，所述新鲜猪精液的精子活率在0.8以上。
优选的，所述保存的时间至少为7天。
本发明的有益效果体现在：
本发明选择将甘氨酸与葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、Tris、碳酸氢钠、青霉素、链霉素、多黏菌素组合，形成了能够高效保存猪精液的稀释液配方，可以补充精子的营养消耗、维持精子的渗透压、降低精子代谢产物的危害，以及氧化应激对精子质膜、顶体结构的损坏。而且通过添加甘氨酸能在更长的保存时间内有效的维持精子质膜完整性、降低精子顶体受损可能性和程度以及保持精子的冲击能力，从而维持较高的精子活力。实验结果表明，本发明的稀释液可以使猪精液在常温下存放一周后活力仍达到约0.8，有效解决鲜精人工授精的时效性问题。同时利用该稀释液进行猪精液保存经济实用，便于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
本发明以满足良种公畜站在扩大对周边企业、养殖户(场)的人工授精辐射范围中的精液保存需求为出发点，结合能量物质、缓冲液等基础成分，对抗菌剂及氨基酸添加剂进行了筛选和配比优化，研制出能高效保存猪精液(在常温下保存一周以上)的稀释液配方，利用其将精液与空气隔绝更有利于精子免受外界环境的损伤，不仅可以更好的克服采精时限及输精地点远近不同等实际情况对充分发挥良种公猪利用率、实现良种资源共享的不利影响，而且生产成本可控，经济性高。
(一)猪精液常温保存稀释液配制
稀释液配方成分和用量：葡萄糖2.75g、EDTA二钠0.235g、柠檬酸钠0.69g、柠檬酸0.29g、Tris 0.565g、碳酸氢钠0.1g、青霉素1万IU、链霉素1万IU、多黏菌素0.4万IU和甘氨酸4mmol。
按用量称取上述稀释液配方各成分并与双蒸水充分混匀后定容至100mL，即得到猪精液常温保存稀释液，pH值约为7.2。
本发明稀释液中葡萄糖具有提供营养以补充精子生存和运动所消耗的能量，以及维持精子高活性的作用，EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、Tris和碳酸氢钠具有提供缓冲及平衡渗透压的作用(所添加的葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、Tris、碳酸氢钠无毒性，且具有pH调节及良好的缓冲稳定性)。在此基础上，本发明稀释液中按配比添加的青霉素、链霉素、多黏菌素可有效控制精液中细菌的菌落数量并且对精子无毒害作用，从而维护精子较高的活率。同时，本发明稀释液中按配比添加的甘氨酸不仅可以发挥抗氧化作用，还可以通过合成丙酮酸，参与精子的三羧酸能量循环，在精子保存过程中提供能量，促进精子能量代谢，同时具有提高精子运动性能、介导信号传递和防止脂质过氧化(LPO)作用对精子的损伤(例如，防止损伤精子质膜、顶体)及抗氧化等功能，并且可显著提高精子膜脂流动性，从而提高精子活力。
(二)猪鲜精常温保存方法
鲜精采集及质量评定：采用假阴道法或手握法采集成年健康种猪精液，采集的新鲜精液放置于保温杯中并在60min内送至实验室进行品质检测。
取10μL新鲜精液，用血细胞计数板计数，正常猪精液的精子密度在2～5亿个/mL。
用Modena稀释液稀释新鲜精液的精子密度至1亿个/mL后放入37℃水浴锅孵育10min，取6μL滴于预热的载玻片上，使用计算机辅助分析系统(CASA)进行精子活力检测，活率大于0.8的新鲜精液可以用于保存。
常温保存：根据新鲜精液(温度为37℃)体积及精子密度，加入等温(预热至37℃)的(一)中配制的稀释液，使精子密度为0.4～0.6×108个/mL，颠倒混匀、密封，分装于1.5mL离心管，然后将1.5mL离心管放于试管盒中并用保温棉纱布包裹。试管盒避光放置于17℃恒温箱内7天以上，每隔12h摇晃一次，避免精液沉淀，期间可根据具体情况反复用于人工授精。
(三)猪精液保存后质量评定
1、精子活力、活率及其他精子运动参数测定
从17℃恒温箱中取出当天待检测的精液样品(即经过常温保存的精液)，置于37℃水浴锅中孵育10min使精子恢复活力，之后取10μL样品在250倍显微镜视野下用计算机辅助分析系统(CASA)测定精子活率、活力、精子直线运动速率和曲线运动速率；测定时选取5个以上不同的视野，每个视野内的精子数在200个以上且分布均匀，进行检测。
2、精子顶体完整率的检测
使用FITC-PNA对精子顶体进行染色，检测精子顶体完整性：从17℃恒温箱中取出当天待检测的精液样品，取20μL精液样品涂在载玻片上，自然风干，再将载玻片置于甲醇中固定10min，取出风干，得到样品载玻片，避光下取20μL的FITC-PNA工作液滴加在样品载玻片上，涂抹均匀，将染色后的样品载玻片放入湿盒中，37℃孵育30min，取出载玻片用PBS洗10min，重复洗涤3次。取出样品载玻片并盖上盖玻片，用荧光显微镜进行观察，使用488nm蓝色光激发，FITC-PNA染色的顶体呈绿色，并且顶体完整的精子呈完整绿色帽状，其他则为顶体受损精子。
随机选取5个视野，每个视野精子至少200个，计算精子顶体完整率。
3、精子质膜完整率检测
使用PI/SYBR-14法检测精子质膜完整性：从17℃恒温箱中取出当天待检测的精液样品，取100μL精液样品置于1.5mL离心管中并在37℃水浴锅中孵育5min，加入0.2μL的SYBR-14工作液，混匀后37℃水浴加热5min，加入0.3μL的PI工作液，混匀，取2.5μL染色后精液置于载玻片上，盖好盖玻片，分别使用488nm蓝色光、525nm绿色光激发，观察质膜完整(SYBR-14染色)、质膜受损(PI染色)情况。
随机选取5个清晰视野观察，每个视野计数大于200个精子，计算精子质膜完整率。
4、精子内活性氧自由基(ROS)水平的检测
采用ROS含量检测试剂盒进行检测：取100μL精液样品，加入200μL的Modena稀释液，混匀后800g/min离心5min，去上清，按试剂盒说明书加入一定体积的ROS工作液(DCFH-DA)，37℃水浴中孵育20min，每隔3～5min混匀一次，孵育后1000g/min离心5min，去上清，使用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，使用多功能酶标仪进行检测，检测时使用的荧光波长为488/525，试验全程避光操作。
5、精子内脂质氧化损伤程度(LPO含量)的检测
检测采用BODIPY 581/591C11染色法：取100μL精液样品，加入200μL的Modena稀释液，混匀后800g/min离心5min，去上清，避光环境下，加入BODIPY 581/591C11工作液，37℃水浴30min。水浴后800g/min离心5min，去上清，使用Modena稀释液重悬后重复离心操作两次，使用多功能酶标仪进行检测，检测时使用的波长为488/525、590/635。
(四)猪精液常温保存实例
在陕西省咸阳兴平市选取成年、健康的20头公猪，采用手握法采集精液，在37℃下检测精液的精子活率、活力及密度，从而对采集自每只猪的精液进行质量评定，结果参见表1。结果显示，所采集猪鲜精的精子密度在2.5～3.1×108个/mL范围内，平均密度为2.8×108个/mL，活力在0.81～0.83范围内，平均值为0.82，活率在0.90～0.92范围内，平均值为0.91。
利用(二)中保存方法将猪精液保存一周(将500uL密度为1亿个/mL猪精液与500uL稀释液混合，使精子密度为5000万个/mL，完成混合后保存至17℃恒温箱)，以Modena稀释液作为实验对照，对鲜精保存质量进行了比较。
结果显示(表1)，利用本发明的稀释液常温保存猪精液一周后精子活力在0.77～0.81范围内，活率在0.84～0.86范围内，平均值为0.85，顶体完整率约为75％，质膜完整率约为83％。并能有效降低活性氧自由基(ROS)的脂质过氧化反应(抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性)。
表1.稀释液对猪精液常温保存的影响
对照组(Modena稀释液) 本发明稀释液
数量(只) 20 20
鲜精活力 0.82±0.01 0.82±0.01
保存后活力 0.72±0.1 0.79±0.02
鲜精密度(×10<sup>8</sup>个/mL) 2.8±0.3 2.8±0.3
鲜精活率 0.91±0.01 0.91±0.01
保存后活率 0.82±0.2 0.85±0.01
保存后顶体完整率(％) 70±1.7 75.4±2.1
保存后质膜完整率(％) 78.2±1.3 83.4±1.1
保存后ROS含量(5×10<sup>4</sup>个精子) 11.2±0.2 8.4±0.2
保存后LPO含量(％) 53±1.2 45±1.3
结果表明，本发明的稀释液相比于Modena稀释液，能够有效的消除精子保存期间受到的不利因素的影响，为延长精液的保存时间提供了可靠的基础。同时，甘氨酸具有很好的调节细胞内外渗透压、钙离子浓度等功能，不仅可以有效改善精液保存品质，而且没有毒害作用，有助于后续研发混合氨基酸猪精液保存稀释液，此外甘氨酸价格低廉，购买方便，可以降低成本。
总之，本发明探明了精液保存过程中甘氨酸参与的有效保护机制，所制备的稀释液可以起到良好的保存效果。不仅精液保存时间长，而且能有效保持精子活率、活力、顶体完整率，降低精子畸形率，使猪鲜精在常温下存放一周后精子活力仍可达到约0.8，完全满足良种公畜站对扩大人工授精辐射范围的需求，有利于提高人工授精生产效率。同时稀释液配制成本低，便于大规模推广应用，有利于提高优良品种种公猪利用率并获得高受胎率，实现真正意义上的良种资源共享。

Claims (8)

1.一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：该常温保存稀释液包括26～28g/L的葡萄糖、2.10～2.45g/L的EDTA二钠、6.8～7.0g/L的柠檬酸钠、2.8～3.0g/L的柠檬酸、5.55～5.75g/L的Tris、0.9～1.1g/L的碳酸氢钠、4～20万IU/L的青霉素、4～20万IU/L的链霉素、4～20万IU/L的多黏菌素和1～80mmol/L的甘氨酸。
2.根据权利要求1所述一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述常温保存稀释液的pH为7.15～7.25。
3.根据权利要求1所述一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述常温保存稀释液包括27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、5.65g/L的Tris、1.0g/L的碳酸氢钠、10万IU/L的青霉素、10万IU/L的链霉素、4万IU/L的多黏菌素和40mmol/L的甘氨酸。
4.一种猪精液常温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
将稀释液与猪精液混合后于15～20℃下进行保存；所述稀释液包括26～28g/L的葡萄糖、2.10～2.45g/L的EDTA二钠、6.8～7.0g/L的柠檬酸钠、2.8～3.0g/L的柠檬酸、5.55～5.75g/L的Tris、0.9～1.1g/L的碳酸氢钠、4～20万IU/L的青霉素、4～20万IU/L的链霉素、4～20万IU/L的多黏菌素和1～80mmol/L的甘氨酸。
5.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述稀释液进行稀释，将猪精子的密度稀释至0.4～0.6×108个/mL。
6.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述稀释液在与猪精液混合前预先加热至37～38.5℃。
7.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述猪精液的精子精子活率在0.8以上。
8.根据权利要求4所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述保存的时间至少为7天。
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