CN102726367A - 猪精液的低温保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪精液的低温保护剂，其特征在于：该保护剂组分配比为：D-葡萄糖8~12g/L,柠檬酸三钠8~12g/L，EDTA钠盐1.5~3g/L，碳酸氢钠1~2g/L，氯化钾0.5~1g/L，青霉素钠0.2~0.9g/L，硫酸链霉素0.2~1g/L，聚乙烯醇0.5~2.5g/L，三羟甲基氨基甲烷4~6g/L，柠檬酸3~4.5g/L，半胱氨酸0.05~0.08g/L，海藻糖0.5~1.5g/L，林肯霉素0.5~1.5g/L，乙二醇0.5~1.5g/L。本发明具有在低温环境下，仍然能够有效保证猪精液活率、延长储存时间的优点。
Description
技术领域
本发明涉及低温环境下保护动物精液技术领域，具体涉及一种猪精液的低温（≤4℃）保护剂。
背景技术
家畜精液保存技术是二十世纪随着人工授精技术广泛应用而产生的，原理是通过降低或抑制精子新陈代谢程度达到延长精子在体外寿命的目的。为此，研究者试验将精液放在低温状态(非结冰，如0～10℃)或冷冻(结冰)状态下保存。精液低温保存通常是在0～5℃范围施行，这是在冷冻保存以前常用的方法。据报道，在脱脂乳中加甘油10％～13％用于稀释牛精液，在低温下可保存14天仍具有很高的受精能力；在含有咖啡因6～10mg的脱离子缓冲溶液中保存牛精子，在6～7℃时，最长能维持生存时间达519小时。但是，猪精液低温保存的局限性仍很大，主要是因为猪精液对低温环境非常敏感，温度降到10℃以下，就发生“冷聚”现象，精子成团成片的死亡，且保存时间很短，24以后，精子活力仅能达到0.2-0.3，已不适宜配种。而当猪精液冷冻保存技术（但是冷冻保存需要设备性能高（始终处于结冰状态），耗能高，需要的成本高）成熟以后，冷藏保温技术更已少有人研究了，因此，至今仍没有成熟稳定的在低温环境下成功保存猪精液的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种在低温环境下，仍然能够有效保证猪精液活率、延长储存时间的猪精液的低温保护剂。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种猪精液的低温保护剂，该保护剂组分配比为：
D-葡萄糖8~12g/L,柠檬酸三钠8~12g/L，EDTA钠盐1.5~3g/L，碳酸氢钠1~2g/L，氯化钾0.5~1g/L，青霉素钠0.2~0.9g/L，硫酸链霉素0.2~1g/L，聚乙烯醇0.5~2.5g/L，三羟甲基氨基甲烷4~6g/L，柠檬酸3~4.5g/L，半胱氨酸0.05~0.08g/L，海藻糖0.5~1.5g/L，林肯霉素0.5~1.5g/L，乙二醇0.5~1.5g/L。
作为优选，上述的猪精液的低温保护剂，该保护剂组分配比为：D-葡萄糖8~11g/L,柠檬酸三钠8~11.5g/L，EDTA钠盐1.5~2g/L，碳酸氢钠1.2~1.5g/L，氯化钾0.6~0.7g/L，青霉素钠0.4~0.7g/L，硫酸链霉素0.2~0.4g/L，聚乙烯醇1~1.5g/L，三羟甲基氨基甲烷4~5g/L，柠檬酸3~4g/L，半胱氨酸0.05~0.06g/L，海藻糖0.5~0.8g/L，林肯霉素0.5~0.8g/L，乙二醇0.5~1.0g/L。
本发明上述的猪精液的低温保护剂采用蒸馏水配置，使得其中的各组分满足上述配方浓度要求。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明采用加入乙二醇作为精液低温保护剂与其他组分的协同作用，然后通过精子降温-冷藏-复苏三个重要步骤，观察保护剂对精子活率的影响。结果表明：在0~4℃下，第7天猪精液的活率仍能达到0.6以上，具有低温环境下存活率高、保持时间长的优点。
2.本发明成功实现低温保存猪精液的目的，低温下精子代谢活动水平更低，保存时间比常温下长的多。同时可应用普通冰箱保存，生产运输成本和操作技术与常温精液基本相同，对于多数人工授精站无需增加设备及专业人员，则可较大副度地提升优良种畜利用度，扩展供精范围，具有很广的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
配置如下配方比例的猪精液保护剂：D-葡萄糖11g/L,柠檬酸三钠12g/L，EDTA钠盐2.4g/L，碳酸氢钠1.7g/L，氯化钾0.8g/L，青霉素钠0.55g/L，硫酸链霉素0.5g/L，聚乙烯醇1.1g/L，三羟甲基氨基甲烷5.4g/L，柠檬酸4.0g/L，半胱氨酸0.06g/L，海藻糖1.0g/L，林肯霉素1.0g/L，乙二醇0.9g/L。
具体配置方法：即称取上述各组分，溶于蒸馏水中，得到上述浓度的猪精液低温保护剂。
实施例2
配置如下配方比例的猪精液保护剂：D-葡萄糖10g/L,柠檬酸三钠10g/L，EDTA钠盐1.6g/L，碳酸氢钠1.2g/L，氯化钾0.7g/L，青霉素钠0.6g/L，硫酸链霉素0.35g/L，聚乙烯醇1.2g/L，三羟甲基氨基甲烷4.5g/L，柠檬酸3.2g/L，半胱氨酸0.055g/L，海藻糖0.6g/L，林肯霉素0.7g/L，乙二醇1.0g/L。
上述猪精液低温保护剂样品的试用：
材料及方法
1.精液采集
采集一头20月龄的宁波福宁种猪有限公司的杜洛克种公猪精液。使用手握采精法收集富含精子的部分（共采集到200ml），滤纸过滤，并收集到消毒后的保温瓶中，立即拿进室温为25℃的室内。
2.精液稀释液配制
使用GBT-25172-2010推荐的第三种精液稀释剂作为基础稀释剂，新鲜精液按照1:1比例稀释，低温保护剂按照表1所列进行配比稀释并装瓶。试验共设4个实验组，1个对照组，每组三个重复。
表1各组低温保护剂添加量及浓度
3.休眠和复苏程序
预置隔热效果好的泡沫箱，加入35℃的温水适量，将装瓶精液放入泡沫箱中，并固定好，盖好泡沫盖，并用厚毛巾包裹好泡沫箱，放入4℃冰箱。以后每天两次，在冰箱中轻轻摇晃精液瓶，以防精子沉淀死亡。第七天，观察精子前，将精液瓶放入35℃恒温水浴锅中，静置30分钟。
4.数据统计
采用完全随机设计，使用Excel（2003）处理数据，用SPSS(16.0)统计软件对数据进行单因子方差分析及LSD法多重比较，所有数据均以平均数±标准误表示。
1.结果
表2各处理组精子活率比较
注：肩注字母含相同小写字母表示两者差异不显著(P＞0.05)；不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
由表2可以看出，乙二醇组效果最好，复苏后活率仍能达到0.6以上，和二甲基乙酰胺、二甲亚砜及空白对照组均差异显著；甘油组次之，活率率低于0.6，和二甲亚砜及空白对照组差异显著；二甲基乙酰胺组活率率高于0.5，和乙二醇、二甲亚砜及空白对照组差异显著；二甲亚砜组精子活率约为0.4，和其他四组均差异显著；空白组活率低于0.2，和其他四组均差异显著。
2.讨论
3.1猪精液低温保存的可行性
由于猪精子对低温较马和牛等其他家畜更为敏感，耐受能力差，容易发生冷休克等特点，使得猪精液低温保存技术的研究进展较为缓慢。De Ieeuw提出，随着温度的降低，精子质膜的磷脂由液相转变为胶相，使膜的通透性变强，导致精子内部的阳离子和酶外漏，及膜控制酶活性和扩散能力的降低，致使精子的获能、顶体反应及死亡[1]。Ahhouse等研究发现，低于12℃，精子的存活时间和活率均急剧下降[2]。但Funahashia等在10℃条件下稀释保存猪精液9天后，精子仍具有较高的活率和体外穿透卵子的能力[3]；徐振军等用糖类，卵黄和柠檬酸钠配制的稀释剂在4℃下保存精液，发现在6天后，活力仍高于0.5[4]；本实验中，猪精液在4℃下保存7天仍然具有较高活动，提示猪稀释精液保存的温度界限可以降低。
3.2不同低温保护剂对精子活率的影响
龙翔等使用甘油、乙二醇和二甲亚砜作为冷冻保护剂，通过液氮熏蒸法冷冻猪精液，解冻后观察精子活率，发现二甲亚砜对精子的毒性最大[5]，与本实验中二甲亚砜组在个处理组中精子活率最低结果类似。甘油组和乙二醇组对精子保护作用最好，本实验得出相同结论。李兆华等在猪精液中加入牛血清白蛋白作为冷冻保护剂，发现第7天的精子活率仍可达到0.5以上。说明低温保护剂确实可以对低温保存精液起到一定的保护作用[6]。
3.提示
在实验中我们发现，冷藏精液缓慢降温和复苏时间非常关键，如果把处理后的精液，经室温直接放入4℃冰箱，精液将会出现不可逆的休克，另一方面，复苏5分钟以内，精液基本上上还是没有表现出活力，5分钟后精子活力逐渐增强，直至30分钟表现出稳定的活力。对低温保存精液的降温-冷藏-复苏程序的优化是下一步的重要方向。
Claims (2)
1.一种猪精液的低温保护剂，其特征在于：该保护剂组分配比为：D-葡萄糖8~12g/L,柠檬酸三钠8~12g/L，EDTA钠盐1.5~3g/L，碳酸氢钠1~2g/L，氯化钾0.5～1g/L，青霉素钠0.2~0.9g/L，硫酸链霉素0.2～1g/L，聚乙烯醇0.5~2.5g/L，三羟甲基氨基甲烷4~6g/L，柠檬酸3~4.5g/L，半胱氨酸0.05~0.08g/L，海藻糖0.5~1.5g/L，林肯霉素0.5～1.5g/L，乙二醇0.5～1.5g/L。
2.根据权利要求1所述的猪精液的低温保护剂，其特征在于：该保护剂组分配比为：D-葡萄糖8~11g/L,柠檬酸三钠8~11.5g/L，EDTA钠盐1.5~2g/L，碳酸氢钠1.2~1.5g/L，氯化钾0.6~0.7g/L，青霉素钠0.4~0.7g/L，硫酸链霉素0.2~0.4g/L，聚乙烯醇1~1.5g/L，三羟甲基氨基甲烷4~5g/L，柠檬酸3~4g/L，半胱氨酸0.05~0.06g/L，海藻糖0.5~0.8g/L，林肯霉素0.5~0.8g/L，乙二醇0.5～1.0g/L。
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