CN113729007A

CN113729007A - 一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液及其制备方法

Info

Publication number: CN113729007A
Application number: CN202111117129.7A
Authority: CN
Inventors: 吴海青; 苏少锋; 李泽廷; 马跃军; 孙培陪; 白晋宇; 高俊
Original assignee: Inner Mongolia Caoyuan Tongyuan Animal Husbandry Industry Co ltd; Inner Mongolia Glassland Yulu Technology Animal Husbandry Co ltd; Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Inner Mongolia Caoyuan Tongyuan Animal Husbandry Industry Co ltd; Inner Mongolia Glassland Yulu Technology Animal Husbandry Co ltd; Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113729007B

Abstract

本发明公开了一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，还公开了一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法。优点在于：通过适量的添加牛磺酸、亚牛磺酸，牛血清白蛋白、肝素钠以及孕酮，可促进精子在体外获能，维持精子的活力，在对原精稀释后，仍能提高受胎率，并能实现精液高倍稀释的目的，在原精一定量的情况下，可大大提高公驴精液的利用率，进一步提高受精母驴的数量，使更多的母驴可以受胎，促进驴养殖企业养殖规模的发展壮大，提高企业的经济效益；通过适量的添加头孢西丁钠、两性霉素以及多粘菌素，可有效降低母驴发生子宫炎的几率，保证母驴健康的子宫环境，促进深角输精方式的应用推广，可为提高受胎率提供有力的保障。

Description

一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液及其制备方法

技术领域：

本发明涉及畜牧领域，尤其涉及一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液及其制备方法。

背景技术：

随着驴肉、驴奶、驴胶等产品越来越受到消费者的欢迎，驴养殖业也在日益壮大。在驴的发情季节，配种员会给母驴输入采集好的驴精液，以使母驴受胎，促进驴的繁殖。为了提高母驴的受胎率，往往要对母驴进行多次输精，为了保证受胎率，通常每头母驴每次输入的精子量约2亿个以上，每天输精1次，且需要连续输精2～4天，才能保证受胎率，即一头母驴就需要数量众多的精子，导致公驴过度利用到繁殖季节后期公驴表现疲软，精子质量下降，受胎率下降，严重制约驴养殖企业养殖规模的发展壮大，影响企业的经济效益。为了增加受精母驴的数量，使更多的母驴可以受胎，目前，在给母驴进行输精时，一些驴养殖企业会对采集的驴精液进行稀释。由于，精子在离开公驴身体后，其活力会逐渐下降，然而，目前市场上售卖的精液稀释液仅可起到稀释精液的作用，在维持精子的活力方面效果有限，且不具备促进精子体外获能的功能，所以受胎率仍无法得到保障；同时，为了促进精子与卵细胞结合，一些配种员会采用深角输精的方式，即：将精液输至母驴的子宫角处，以缩短精子的运动距离，但是，在输精管穿过阴道时，容易将阴道内的细菌带入子宫，使母驴引发子宫炎，不仅影响母驴的子宫健康，还会影响胚胎着床，进一步影响受胎率。综上所述，为了提高受胎率，提高公驴精子的利用率，并保证母驴的身体健康，对驴精液稀释液配方进行改良优化显得尤为重要。

发明内容：

为了有效提高母驴受胎率、降低子宫炎发病率，促进精子在体外获能，本发明的第一个目的在于提供一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，本发明的第二个目的在于提供一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法。

本发明的第一个目的由如下技术方案实施：

一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，包括A溶液和B溶液，其中：

A溶液由以下成分组成：氯化钠1.2g～1.6g、磷酸二氢钾0.5g～0.7g、七水硫酸镁0.05g～0.15g、碳酸氢钠0.3g～0.5g、HEPES 4.3g～6.1g、葡萄糖40g～60g、丙酮酸钠0.06g～0.1g、乳酸钠3mg～4.2mg、脱脂奶粉12g～24g、牛磺酸2g～4g、亚牛磺酸8.72mg～13.08mg，以及纯水800ml。

B溶液由以下成分组成：牛血清白蛋白1g～6g、肝素钠20mg～25mg、孕酮1.57mg～6.28mg、头孢西丁钠20mg～30mg、两性霉素20mg～30mg、多粘菌素70mg～130mg，以及纯水100ml。

优选的，A溶液由以下成分组成：氯化钠1.52g、磷酸二氢钾0.68g、七水硫酸镁0.12g、碳酸氢钠0.35g、HEPES 4.76g、葡萄糖50g、丙酮酸钠0.08g、乳酸钠3.6mg、脱脂奶粉24g、牛磺酸3.75g、亚牛磺酸8.72mg以及纯水800ml。

优选的，B溶液由以下成分组成：牛血清白蛋白1g、肝素钠20mg、孕酮3.14mg、头孢西丁钠24mg、两性霉素25mg、多粘菌素100mg以及纯水100ml。

本发明的第二个目的由如下技术方案实施：

一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别按配比取A溶液、B溶液的各成分进行混匀，分别制得A溶液和B溶液；

(2)将步骤(1)中制得的A溶液在高温高压条件下进行灭菌处理；

(3)在无菌环境下，将步骤(1)中制得的B溶液过滤除菌后与步骤(2)中得到的灭菌后的A溶液进行混合并通过添加无菌纯水定容至1L，即得抑菌子宫角输精稀释液。

优选的，所述步骤(2)中，A溶液在压力103.4kPa、温度121.3℃的条件下，维持15～30分钟，进行灭菌。

优选的，所述步骤(3)中，B溶液用22μm无菌滤器进行过滤除菌。

本发明的优点：

1、通过适量的添加牛磺酸、亚牛磺酸，牛血清白蛋白、肝素钠以及孕酮，可促进精子在体外获能，维持精子的活力，在对原精稀释后，将一次输入的精子量控制在2×10⁷～8×10⁷个的情况下，仍能提高受胎率，并能实现精液高倍稀释的目的，在原精一定量的情况下，可大大提高公驴精液的利用率，进一步提高受精母驴的数量，使更多的母驴可以受胎，促进驴养殖企业养殖规模的发展壮大，提高企业的经济效益；

2、通过适量的添加头孢西丁钠、两性霉素以及多粘菌素，可有效降低母驴发生子宫炎的几率，保证母驴健康的子宫环境，促进深角输精方式的应用推广，可进一步为提高受胎率提供有力的保障。

具体实施方式：

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

A溶液由以下成分组成：氯化钠1.52g、磷酸二氢钾0.68g、七水硫酸镁0.12g、碳酸氢钠0.35g、HEPES 4.76g、葡萄糖50g、丙酮酸钠0.08g、乳酸钠3.6mg、脱脂奶粉24g、牛磺酸3.75g、亚牛磺酸8.72mg以及纯水800ml。

B溶液由以下成分组成：牛血清白蛋白1g、肝素钠20mg、孕酮3.14mg、头孢西丁钠24mg、两性霉素25mg、多粘菌素100mg以及纯水100ml。

本实施例中各成分的作用如下：

氯化钠是主要是控制精子细胞内电解质平衡；

磷酸二氢钾主要用于维持渗透压；

七水硫酸镁中的镁离子有助于精子运动；

HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力。由于精液呈弱碱性，PH值为7.2～7.8；因此，HEPES对维持精子PH具有较好的效果。

乳酸钠可以提高抗氧化作用，用于调节PH；

脱脂奶粉，由于奶是一种天然的缓冲剂，具有较好的缓冲作用；但乳脂会限制精子运动，其中的酪蛋白可以维持精子活力。因而，脱脂乳粉较脱脂乳使用方便。

葡萄糖是精子获能和维持超激活运动的主要能源物质，有助于驴精子获能；

丙酮酸钠在此配方中主要起到强力的抗氧化作用，提高精子在缺氧情况的耐受能力，它全身碱化作用使其无论在缺氧或是有氧条件下都能消耗，保护精子细胞的基本功能。

碳酸氢钠在维持渗透压也起着很重要的作用，精子在体内处在等渗的精清中，如果精清部分的盐浓度较高，则渗透压高，精子易脱水；反之,渗透压低，易使精子膨胀，适量使用碳酸氢钠可有效维持驴精液稀释液的渗透压。

孕酮能诱发驴精子发生顶体反应，而顶体反应标志着精子获能的完成；

牛血清白蛋白既可提高精子活力和活率，又可促进精子获能；

牛磺酸、亚牛磺酸、肝素钠在精子体外获能及维持精子活力方面也均具有积极的效果。

同时，由于一般引起子宫炎的菌主要包括：大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、芽孢杆菌、念珠菌。而头孢西丁钠对革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或其他链球菌(除了肠球菌)的敏感菌株均有较强的抗菌作用；两性霉素用于隐球菌、球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、念珠菌、毛霉、曲菌等引起的内脏或全身感染；多黏菌素(polymyxin)对绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌具有抗菌作用。因此，头孢西丁钠、两性霉素以及多粘菌素，对深角输精抗感染有积极作用。

实施例2：

(2)将步骤(1)中制得的A溶液在压力103.4kPa、温度121.3℃的条件下，维持15～30分钟，进行灭菌处理；

(3)在无菌环境下，将步骤(1)中制得的B溶液用22μm无菌滤器过滤除菌后与步骤(2)中得到的灭菌后的A溶液进行混合并通过添加无菌纯水定容至1L，即得抑菌子宫角输精稀释液。

由于B溶液中的牛血清白蛋白、头孢西丁钠、两性霉素、多粘菌素为活性物质，高温会破坏其功能，因此，本实施例中B溶液仅通过无菌滤器进行过滤除菌。

对比例1：

为了验证本发明提出的适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液可提高精子的活力，本对比例对利用通过实施例2制备的抑菌子宫角输精稀释液稀释后的精液中精子的活力进行了检测，具体检测方法如下：

对10头公驴采集精液，并将采集好的精液混匀后平均分为两组，分别作为实验组1和对照组1。将实验组1的精液中按照1:1(原精：稀释液)的体积比例加入本发明的抑菌子宫角输精稀释液进行稀释，将对照组1的精液中按照1:1(原精：稀释液)的体积比例加入INRA82稀释液进行稀释；之后，将实验组1和对照组1均置于在37℃避光水浴条件下，分别在0h、3h、6h、9h、24h用精子活力检测仪检测实验组1和对照组1中精子的活力，检测结果如表1；

表1实验组1和对照组1的精子活力检测结果

活力(％)	0h	3h	6h	9h	24h
						实验组1	71.6	64.3	52.7	43.5	18.4
对照组1	71.6	59.5	46.6	39.8	11.1

从表1中可以看出，随着时间的延长，实验组1的精子活力明显高于对照组1，可见，本发明提出的适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液可有效提高精子的活力。

对比例2：

为了验证本发明提出的适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液具有良好的抑菌效果，本对比例对利用通过实施例2制备的抑菌子宫角输精稀释液稀释后的精液的抑菌效果进行了检测，具体检测方法如下：

对10头公驴采集精液，并将采集好的精液混匀后，各取5ml精液，分别与由本发明的抑菌子宫角输精稀释液和INRA82稀释液(其包含抗生素：青霉素100000IU/L，链霉素双氢150mg/L)等体积混合后，分别作为实验组2和对照组2。将实验组2和对照组2分别用PBS以1:10、1:100、1:1000的体积比进行稀释。并将5ml的由本发明制备的抑菌子宫角输精稀释液作为空白实验组，将5ml的INRA82稀释液作为空白对照组；之后，将实验组2、对照组2、空白实验组以及空白对照组均置于37℃避光水浴条件下，按照菌落总数测定(GB4789.2-2016)测定方法，测定实验组2、对照组2、空白实验组以及空白对照组中，三个稀释梯度在不同时间对应的菌落生长情况，经过多次实验，检测结果如表2所示，实验组2在不同稀释梯度下均表现出较强的抑菌效果，尤其在24h内抑菌效果最佳。表2中，“--”表示菌落长满，无法计数。

表2实验组2和对照组2的抑菌效果检测结果

由于实验过程中可能会带入菌，为了保证实验数据的可靠性，本对比例对空白实验组和空白对照组分别对同一样品进行了三组实验。

由表2可以看出，通过实验组2和对照组2进行比较可以看出，在不同的稀释梯度下，在相同时间，实验组2的菌落数均明显少于对照组2的菌落数；同时，空白实验组和空白对照组中的菌落数极少，可见，通过实施例2制备的抑菌子宫角输精稀释液和INRA82稀释液本身无菌，所以，实验组2和对照组2中的细菌并不是由两种稀释液带入的。可见，实验组2所采用的实施例2制备的抑菌子宫角输精稀释液较对照组2所采用的INRA82稀释液而言，抑菌效果显著。

对比例3：

为了验证本发明提出的适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液在提高母驴受胎率和降低子宫炎发病率方面具有良好的效果，本对比例在项目合作示范驴场用通过本发明制备的抑菌子宫角输精稀释液对原精进行稀释后，共计输精1280头次母驴，并作为实验组3；用INRA82稀释液对原精进行稀释后，共计输精5400头次母驴，并作为对照组3；且实验组3和对照组3的原精相同，稀释比例相同，输精位置相同，均是将稀释后的精液输至母驴的子宫角处。

输精并排卵后的18天后通过孕检统计受胎情况，实验组3中，受胎母驴为764头，受胎率为59.7％，母驴子宫炎发病率为4.3％。对照组3中，受胎母驴为2432头，受胎率为45％，母驴子宫炎发病率为10.8％。

可见，实验组3相对于对照组3，受胎率大大提高，而母驴子宫炎发病率大大降低，由此可见，本发明提出的适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液在提高母驴受胎率和降低子宫炎发病率方面具有突出的效果，促进养殖规模的不断扩大，也对母驴的子宫健康更有保障。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，其特征在于，包括A溶液和B溶液，其中：

A溶液由以下成分组成：氯化钠1.2g～1.6g、磷酸二氢钾0.5g～0.7g、七水硫酸镁0.05g～0.15g、碳酸氢钠0.3g～0.5g、HEPES 4.3g～6.1g、葡萄糖40g～60g、丙酮酸钠0.06g～0.1g、乳酸钠3mg～4.2mg、脱脂奶粉12g～24g、牛磺酸2g～4g、亚牛磺酸8.72mg～13.08mg，以及纯水800ml；

2.根据权利要求1所述的一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，其特征在于，A溶液由以下成分组成：氯化钠1.52g、磷酸二氢钾0.68g、七水硫酸镁0.12g、碳酸氢钠0.35g、HEPES 4.76g、葡萄糖50g、丙酮酸钠0.08g、乳酸钠3.6mg、脱脂奶粉24g、牛磺酸3.75g、亚牛磺酸8.72mg以及纯水800ml。

3.根据权利要求1所述的一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液，其特征在于，B溶液由以下成分组成：牛血清白蛋白1g、肝素钠20mg、孕酮3.14mg、头孢西丁钠24mg、两性霉素25mg、多粘菌素100mg以及纯水100ml。

4.权利要求1-3任一所述的一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)中制得的A溶液在高温高压条件下进行灭菌处理；

5.根据权利要求4所述的一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，A溶液在压力103.4kPa、温度121.3℃的条件下，维持15～30分钟，进行灭菌。

6.根据权利要求4所述的一种适用于驴精液的抑菌子宫角输精稀释液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，B溶液用22μm无菌滤器进行过滤除菌。