CN107183013A - 一种驴精液低温保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种驴精液低温保存的方法，包括步骤：(1)按质量份数Tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份及双蒸水100份制备基础液，将基础液85份，卵黄液15份制备精液稀释液；(2)以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，活率大于0.70；(3)取温度平衡至28℃的精液稀释液和精液，按2:1的比例进行稀释；(4)将稀释好的精液装于离心管后，置28℃水浴中转移至4℃冰箱中；(5)低温保存时每隔24小时进行混匀处理，同时镜检精子活率。采用本发明方法后精液保存时间明显延长，解决了规模化养驴场在母驴集中发情时大量人工授精的困难，有效提高种公驴的利用效率。

Description

一种驴精液低温保存的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是一种驴精液低温保存的方法。
背景技术
家畜精液保存结合人工授精技术可以极大地提高种公畜的繁殖利用效率。通常，哺乳动物精液的保存可分为常温保存(15-25℃)、低温保存(4℃)及冷冻保存(-196℃或-79℃)。常温保存发展最早，方法也相对简单，但常温保存时间较短，且容易受微生物的污染，使精子活率显著降低而影响受胎率。冷冻保存可以实现精子长期保存的目的，但冷冻保存精液较常温和低温保存而言，其方法比较复杂、所需仪器设备要求也较高，且解冻后精子活率较低，人工授精的受胎率也较低。低温保存具有操作方法简单，仪器设备要求不高，与常温保存相比可明显延长精液的保存时间，结合人工授精技术可显著提高种公畜的利用效率。尽管如此，目前驴精液保存的相关研究较少，所以涉及到驴精液每种保存方式的方法和技术体系都还不完善。
驴为马属动物，且是长日照季节性发情动物，对于规模化养驴场，母驴的发情通常会集中出现，如果对种公驴实施现场采精，然后用稀释液对采集的精液现场稀释后再做人工授精，其操作时间相对紧张，给生产带来了极大不便。如在长日照季节应用精液低温保存液提前对采集的驴精液进行低温保存，在母驴出现发情时便可直接进行人工授精，不仅给生产带来了方便，而且有效的提高了种公驴的利用效率。因而，生产中亟需开展驴精液的低温保存研究，建立一套适合生产中应用的驴精液低温保存方法和技术体系。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种驴精液低温保存的方法，解决规模化养驴场及其向周边养驴户在长日照季节母驴集中发情时段开展人工授精，提高种公驴的利用效率，加速品种改良。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种驴精液低温保存的方法，包括步骤如下：
(1)精液稀释液的配置及处理
①基础液的配置：所述基础液包括按质量份数构成的下述组份：Tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份、双蒸水100份，将上述组份定容配置成基础液；
②卵黄液的制备：将1日龄鸡蛋取蛋黄转至50mL无菌离心管中，用去针头无菌注射器反复吸吹，使蛋黄充分混合均匀，得新鲜卵黄液；
③用于低温保存的精液稀释液的配置及处理：按体积计取基础液85份，新鲜卵黄液15份，充分混匀，在对精液稀释前2小时，将精液稀释液放于28℃恒温培养箱中预热备用；
(2)采精及精液预处理
以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用无菌纱布过滤并收集到无菌烧杯中并封口，同时以显微镜检查精子密度和活率，密度正常且活率大于0.70以上方可应用，然后将封口的无菌烧杯置于28℃恒温箱中，维持1-2小时达到精液的28℃平衡；
(3)精液稀释
取温度平衡至28℃的精液稀释液和精液，按2:1的比例进行稀释，轻轻混匀后得到稀释精液备用；
(4)降温处理
将稀释好的精液以20-30mL每份分装于50mL离心管中，并用封口膜密封好，放入28℃的水中，然后转移至4℃冰箱中，使稀释好的精液缓慢降温至4℃。
(5)低温保存
降温处理后，每隔24小时对保存的稀释精液进行混匀处理，同时用显微镜镜检精子活率，精子活率在0.30以上的保存时间为可以进行人工授精的有效保存时间。
而且，按2:1的比例进行稀释的具体方法为：用50mL无菌注射器先吸取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀，然后再取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀后既得稀释精液。
而且，使稀释好的精液缓慢降温至4℃的具体方式为：将稀释好的精液置28℃的盛有400mL水的烧杯中，然后置4℃冰箱中缓慢降温至4℃的过程。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明对精液稀释时，采用了不经离心处理直接稀释的方式，较常规离心处理后再稀释的方式，精液保存时间得到了明显延长，而且简化了精液稀释的处理步骤，更方便于在生产中的实际应用。
2、本发明保存驴精液后精子活率在0.30以上的有效时间可达5天，较常温保存更能延长精液的保存时间，解决了规模化养驴场及其向周边养驴户在母驴集中发情的时间段进行人工授精的推广应用，可有效提高种公驴的利用效率。
具体实施方式
以下结合实例对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种驴精液低温保存的方法，该方法的步骤如下：
(1)精液稀释液的配置及处理
①基础液的配置：用电子天平准确称取Tris 3.04g、柠檬酸1.70g、葡萄糖1.50g，果糖1.50g、青霉素0.06g，链霉素0.10g，加双蒸水100mL定容配置成基础液。
②卵黄液的制备：鸡蛋来源于无疫病的鸡场，保证鸡蛋新鲜(1日龄鸡蛋)、蛋壳干净无污染，取卵黄前用75％酒精对蛋壳表面进行仔细消毒，待酒精挥发完后，用无菌镊子钝端在鸡蛋的大头端将蛋壳轻轻敲开一2cm左右的开口，然后用无菌镊子将蛋壳膜撕开，倾倒蛋壳内的蛋清(蛋清尽量去除干净)，只留蛋黄，并将蛋黄转至50mL无菌的离心管中，用去针头的20mL无菌注射器反复吸吹，使蛋黄充分混合均匀，得新鲜卵黄液；
③用于低温保存的精液稀释液的配置及处理：取基础液85mL，新鲜卵黄液15mL，充分混匀，在对精液稀释前2小时，将精液稀释液放于28℃恒温培养箱中预热备用。
(2)采精及精液预处理
以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采精前要用干净的毛巾蘸温水擦干净公驴的外生殖器，采集的精液立即用6-8层无菌纱布过滤并收集到无菌的烧杯中并封口，所采精液为乳白色或灰白色，无异味，显微镜检查精子密度正常，活率大于0.70以上方可应用。符合标准的鲜精置28℃恒温箱中，维持1-2小时，使精液温度平衡到28℃。
(3)精液稀释
记录采集精液的体积，取预热、平衡至28℃的精液稀释液和精液，按2:1的比例进行稀释，可用50mL无菌注射器先吸取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀，然后再取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀后备用。
(4)降温处理
根据稀释后精液的体积，将稀释好的精液以20-30mL每份分装于50mL离心管中，并用封口膜密封好，放入提前预热至28℃的盛有400mL水的烧杯中，转移至4℃冰箱中，使保存的精液缓慢降温至4℃，从精液采集后至降温处理操作完成时间控制在2-3h内。
(5)低温保存
降温处理后，每隔24小时对保存精液进行混匀处理后，置4℃冰箱继续保存。同时取一滴精液置载玻片上，盖上盖玻片，置37℃载物台的显微镜下(400×)观察精子的活率。

Claims (3)

1.一种驴精液低温保存的方法，其特征在于包括步骤如下：
(1)精液稀释液的配置及处理
①基础液的配置：所述基础液包括按质量份数构成的下述组份：Tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份、双蒸水100份，将上述组份定容配置成基础液；
②卵黄液的制备：将1日龄鸡蛋取蛋黄转至50mL无菌离心管中，用去针头无菌注射器反复吸吹，使蛋黄充分混合均匀，得新鲜卵黄液；
③用于低温保存的精液稀释液的配置及处理：按体积计取基础液85份，新鲜卵黄液15份，充分混匀，得到精液稀释液，在对精液稀释前2小时，将精液稀释液放于28℃恒温培养箱中预热备用；
(2)采精及精液预处理
以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用6-8层无菌纱布过滤并收集到无菌烧杯中并封口，同时以显微镜检查精子密度和活率，密度正常且活率大于0.70以上方可应用，然后将封口的无菌烧杯置于28℃恒温箱中，维持1-2小时达到精液的28℃平衡；
(3)精液稀释
取温度平衡至28℃的精液稀释液和精液，按2:1的比例进行稀释，轻轻混匀后得到稀释精液备用；
(4)降温处理
将稀释好的精液以20-30mL每份分装于50mL离心管中，并用封口膜密封好，放入28℃的水中，然后转移至4℃冰箱中，使稀释好的精液缓慢降温至4℃。
(5)低温保存
降温处理后，每隔24小时对保存的稀释精液进行混匀处理，同时用显微镜镜检精子活率，精子活率在0.30以上的保存时间为可以进行人工授精的有效保存时间。
2.根据权利要求1所述的驴精液低温保存的方法，其特征在于：所述步骤(3)中按2:1的比例进行稀释的具体方法为：用50mL无菌注射器先吸取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀，然后再取一份精液稀释液缓慢加入到等温的精液中，轻轻混匀后即得稀释精液。
3.根据权利要求1所述的驴精液低温保存的方法，其特征在于：所述步骤(4)中使稀释好的精液缓慢降温至4℃的具体方式为：将稀释好的精液置28℃的盛有400mL水的烧杯中，然后置4℃冰箱中缓慢降温至4℃的过程。
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