CN105519519A - 一种驴精液冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种驴精液稀释液的制备和稀释方法、以及驴细管冻精的制备方法。使用方法包括以下步骤：精液稀释液的配制、采精、初次稀释、控制性降温、二次稀释、冷冻、冷冻保存。冷冻过程中采用控制性降温，适当的液氮熏蒸温度的手段，有效地提高了精子冷冻后的品质，提高了驴冷冻精液人工授精的效率。本发明提高了优良种公驴的使用效率，同时使用方法简单，适合基层推广应用。

Description

一种驴精液冷冻保存方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种驴精液冷冻保存方法。

背景技术

自1950年Smith和Polge冷冻保存牛精液获得成功后，其它动物如猪、马、家禽及一些野生动物的精液冷冻保存研究进展也较快。精液冷冻技术是指用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)或液氦(-269℃)等作为冷源，将精液进行特殊处理后冷冻，然后投入超低温的液氮中，使精子细胞的代谢维持在最低水平，可达到长期保存的目的。使用时将精液在水浴中解冻，精子恢复活性，即可用于人工输精。目前，牛的精液保存已达到应用阶段，马、驴等家畜的精液保存技术还处在实验阶段。1973年西北农学院用干冰冷冻驴颗粒精液，授精母马16匹，受胎率为37．5％。1977年陕西省畜牧兽医研究所用干冰冷冻袋装驴精液，授精母马109匹，情期受胎率为52．3％。2008年新疆农业大学王慧伟等，制作的驴冷冻精液，给7头发情母驴输精，其中3头成功妊娠。2010年，塔里木大学动科学院曾维斌等制作的驴冻精，解冻后精子活力可以达到0.31。

应用冷冻精液进行人工授精，不仅可以解决精液远距离运输问题，促进不同区域的优良种质资源的交流，而且可以延长种公畜遗传物质的使用时间。我国在奶牛及肉牛上应用冷冻精液技术及人工授精技术已发展的较为完善，充分提高了养殖的经济效益.但在驴精液冷冻保存技术上虽有所研究，但普遍存在冷冻精液解冻后，精子活率低，受胎率不高等现象。本发明较其他的驴精子冷冻保存区别在于：冷冻稀释液有所不同；在冷冻方法上采用控制性降温、液氮熏蒸的温度和短的熏蒸时间，这些技术改进和创新显著的提高了精子冷冻效果。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种驴精液冷冻保存方法，提高种公驴的利用效率，加速驴的品种改良步伐。

本发明的目的是这样实现的：

通过人工采精专用假台驴进行精液采集，然后将采集的驴精液在Ⅰ液和Ⅱ液的稀释下进行冷冻处理保存。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

1.稀释液的配置

Ⅰ液：乳糖7g、葡萄糖1.25g,新鲜鸡蛋黄20ml、蒸馏水100ml。

Ⅱ液：取Ⅰ液45ml，加入5ml甘油、青霉素钠5000UI、硫酸链霉素5000UI。

2.驴精液的采集

2.1准备台驴或者假台驴

根据种公驴的个体大小调整假台驴的驴体，使其更适合种公驴爬跨。

2.2装配采精假阴道

采精假阴道装好后先用75％的酒精消毒内胎及集精杯，再用96％的酒精擦拭，待酒精挥发后，再用稀释液冲洗。

2.3假阴道的调温、调压、涂润滑剂

先灌入1800毫升的42℃温水，用温度计测试阴道器内壁的温度，保持在40℃之间为宜，吹气加压，使采精筒大口内胎缩成三角形为佳，最后用润滑剂涂抹至阴道器内壁的前1/3，如涂抹过深，易使润滑剂污染精液或者流入集精杯内。

2.4精液的采集

用软毛巾蘸温开水冲洗种公驴的外生殖器，采精员站在台驴或者假台驴的左侧，待种公驴阴茎勃起爬跨，顺势轻托种公驴阴茎将其导入假阴道孔内，观察种公驴表现待公驴射精后，将假阴道气孔阀门打开，使全部精液流入集精杯内，以纱布封口，送入精液处理室。

3.精液冷冻处理

3.1采精前处理

控制精液处理室的温度在25℃—30℃，将空离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻稀释Ⅰ液的离心管置于25℃水浴中预热，将载有冷冻保存Ⅱ液的实验瓶置于4℃冰箱中。

3.2精液的过滤及离心

采集的种公驴精液经八层无菌纱布过滤，显微镜镜检活力即直线运动精子比例达到70%以上，可进行冷冻。580--620×g离心力条件下离心10min，弃上清液，留下浓缩液。

3.3精液的稀释

将离心后的浓缩液移至实验瓶，加入等体积（1：1）的冷冻稀释Ⅰ液，缓缓摇匀后置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于4℃冰箱中，平衡90min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加4℃与精子浓缩液等体积的冷冻保存Ⅱ液。添加完成后缓缓摇匀，在4℃下再平衡90min。

3.4精液的冷冻

在4℃温度下，用专用注射器将经处理的精子混合液吸入0.5ml细管内，快速封口，置于液氮面上2.5cm上熏蒸6min后，直接投入液氮中冷冻。将细管冻精从液氮中取出,置于38℃水浴中45s，即精子解冻

本发明的技术用冷却源降低或抑制精子新陈代谢水平,长期保存在超低温的状态下，并且在复苏后能保持受精能力，以突破时间和空间对种畜精液使用的限制。这一技术的核心是采用何种冷冻保存液和冷冻方法对精子进行处理以降低冷冻和复苏过程中对精子的损害。本发明所述方法中，驴冷冻精液需在无菌的环境下操作，每一步都需严格控制，严防出错，否则会影响最终结果。本发明方法的冷冻精液合格率达100％，即冷冻精液解冻后精子活力在0.3以上，冷冻-解冻后精子的活率达到35%以上，精子的顶体完整率达到80%以上，每剂细管中有效精子数不少于3000万个。

具体实施方式：

1.稀释液的配置

1.1基础液的配置

用电子分析天平准确称取乳糖7g、葡萄糖1.25g，将其溶解于100mL蒸馏水中，用恒温磁力搅拌器搅拌均匀后，用10%碳酸氢钠调整溶液pH值至7.1～7.8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌。过滤后的液体基础液，放入4℃冰箱中备用。

1.2蛋黄的抽取

鸡蛋应选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、干净，取用卵黄前先用75%酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，待酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄；也可在鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄；然后用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。

1.3Ⅰ液和Ⅱ液的配置

在进行驴精液冷冻前，取75mL基础液置于锥形瓶中，抽取卵黄20mL加入。在锥形瓶中加入灭菌后的小玻璃珠若干，用恒温磁力搅拌器搅拌15～20min，以促使卵黄碎裂，搅拌后的液体为Ⅰ液。抽取Ⅰ液45mL，向其中加入甘油5mL，青霉素钠5000UI、硫酸链霉素5000UI，混合均匀后即为Ⅱ液。

2.采精

2.1采精前的预处理

采精前，控制精液处理室的温度在25℃—30℃，将空离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻稀释Ⅰ液的离心管置于25℃水浴中预热，将载有冷冻保存Ⅱ液的实验瓶置于4℃冰箱中。

2.2准备台驴或者假台驴

根据种公驴的个体大小调整假台驴的驴体，使其更适合种公驴爬跨。

2.3配采精假阴道

台驴装好后先用75％的酒精消毒内胎及集精杯，再用96％的酒精擦拭，待酒精挥发后，再用稀释液冲洗。

2.4假阴道的调温、调压、涂润滑剂

先灌入1800毫升的42℃温水，用温度计测试阴道器内壁的温度，保持在40℃之间为宜，吹气加压，使采精筒大口内胎缩成三角形为佳，最后用润滑剂涂抹至阴道器内壁的前1/3，如涂抹过深，易使润滑剂流入集精杯内。

2.5采集精液

用软毛巾蘸温开水冲洗种公驴的外生殖器，采精员站在台驴或者假台驴的左侧，待种公驴阴茎勃起爬跨，顺势轻托种公驴阴茎将其导入假阴道孔内，观察种公驴表现待公驴射精后，将假阴道气孔阀门打开，使全部精液流入集精杯内，以纱布封口，送入精液处理室。

3.精液处理及冷冻

3.1精液的过滤及离心

采集的种公驴精液经八层纱布过滤，显微镜镜检活力≥0.7即直线运动精子比例达到50%以上，所采集的精液为乳白色或灰白色，无异味，精子形态正常，密度≥1亿/ml，活力≥0.7，方可用于制作细管冷冻精液。用灭菌注射器将精液分装至水浴锅中预热的离心管中，580--620×g离心力条件下离心10min，弃上清，留下浓缩液。

3.2精液的稀释

将离心后的浓缩液移至实验瓶，加入等体积（1：1）的冷冻稀释Ⅰ液，缓缓摇匀后置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于4℃冰箱中，平衡90min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加4℃与精子浓缩液等体积的冷冻保存Ⅱ液。添加完成后缓缓摇匀，在4℃下再平衡90min。

3.3精液的冷冻处理

在4℃温度下，用专用注射器将经处理的精子混合液吸入0.5ml细管内，快速封口。置于液氮面上2-3cm上熏蒸6min后，将细管投入液氮中保存。

4.细管冻精解冻及精子质量检测

4.1精液的解冻和活力检查

预先将恒温水浴锅中的水温加热至38℃，用镊子将一支超低温冷冻的细管从液氮中迅速取出后，投入38℃水浴中摇晃约45s，待完全溶解后立即取出，用纱布擦干水珠，再用细管剪先剪去封口端，再剪去棉塞端，将细管内的精液全部置于一小试管内，摇匀，取一滴于载玻片上，并盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。

4.2顶体完整性检测

采用FITC标记的花生凝集素染色后，用荧光显微镜检测冷冻-解冻后的精子顶体的完整性。取30μL解冻后的细管精液涂片，之后自然风干。自然干燥后的抹片在20-22℃的甲醇中浸泡10分钟固定。然后在每个风干后的抹片上滴上含有100mg/mL的FITC标记的花生凝集素的染液，放置在37℃的暗湿盒中染色30min。之后，用PBS冲洗，风干抹片后，滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，用无色指甲油封片后，在荧光显微镜下检查精子顶体的状况。

Claims (5)

1.一种驴精液冷冻保存方法，其特征在于：精液样品要求新鲜样品活力≧0.7，冷冻方法按以下步骤进行：

（1）采精前，控制精液处理室的温度在25℃—30℃，将空离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻稀释Ⅰ液的离心管置于25℃水浴中预热，将载有冷冻保存Ⅱ液的实验瓶置于4℃冰箱中；

（2）精液的过滤及离心：采集的种公驴精液经八层无菌纱布过滤，显微镜镜检活力即直线运动精子比例达到70%以上，可进行冷冻，580--620×g离心力条件下下离心10min，弃上清，留下浓缩液；

（3）精液的稀释：将离心后的浓缩液移至实验瓶，加入等体积（1：1）的冷冻稀释Ⅰ液，缓缓摇匀后置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于4℃冰箱中，平衡90min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加4℃与精子浓缩液等体积的冷冻保存Ⅱ液，添加完成后缓缓摇匀，在4℃下再平衡90min。

2.根据权利要求1所述稀释液，其特征是：Ⅰ液的组分是：乳糖7g、葡萄糖1.25g,新鲜鸡蛋黄20ml、蒸馏水100ml；Ⅱ液的组分是：取Ⅰ液45ml，加入5ml甘油、青霉素钠5000UI、硫酸链霉素5000UI。

3.根据权利要求1所述采精，其特征是：准备台驴或者假台驴，根据种公驴的个体大小调整假台驴的驴体，使其更适合种公驴爬跨。

4.根据权利要求1所述精液的冷冻，其特征是：在4℃温度下，用专用注射器将经处理的精子混合液吸入0.5ml细管内，快速封口，置于液氮面上2.5cm上熏蒸6min后，直接投入液氮中冷冻。

5.根据权利要求4所述细管冻精，其特征是：冷冻精液从液氮中取出,置于38℃水浴中45s，即精子解冻。