CN109845728A - 临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法 - Google Patents

Abstract

一种临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法，包括：15mmol/L～50mmol/L的蔗糖；15mmol/L～50mmol/L的甘露醇注射液；1mmol/L～5mmol/L的葡萄糖注射液；1mol/L～3mol/L的腺苷注射液；0.5mmol/L～5mmol/L的还原型谷胱甘肽；1mol/L～4.5mol/L的海藻糖；0.1mmol/L～1mmol/L的EDTA‑2Na；这样混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液。结合其冻存方法有效避免了现有技术中所用到的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红、DMSO、动物血清、血小板提取物等还存在发生不良反应的缺陷。

Description

临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及一种临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法，尤其涉及一种用于符合临床要求的脂肪组织冻存液及冻存方法。

背景技术

脂肪组织是指由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。脂肪组织中的网状纤维很发达。脂防组织的细胞间质很少，脂肪组织关节处的脂肪有缓冲肌肉运动的功能，在臂部及足底有支垫作用。

另外随着近年来医疗技术的不断更新，脂肪组织作为一种人体的天然填充材料在临床上的应用也越来越受到人们重视，其中在软组织填充、鼓膜修复、脂肪来源细胞保存、中重度溃疡性结肠炎治疗、慢性阻塞性肺疾病(COPD)治疗和组织工程皮肤重建等方面有着重要作用。以上的应用均要求脂肪组织有较高成活率和安全性，同时能快速便捷的获取并减少患者痛苦。

目前符合临床要求的脂肪组织冻存液和冻存方法主要通过与细胞冻存类似的冻存方式,采用渗透性保护剂二甲基亚砜(DMSO)、培养液和其他成份来进行脂肪组织冻存，虽然该方法的效果明显，但要应用于临床时，该方法所用到的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红、DMSO、动物血清、血小板提取物等还存在发生不良反应的风险。

具体而言，现有技术的脂肪组织冻存液及冻存方法在脂肪组织冻存中存在的不足：

目前脂肪组织冻存液和冻存方法常用的是将脂肪组织与DMSO、培养液和血清等混合后采用程序降温仪或程序降温盒进行冻存，DMSO是最常用的渗透性冷冻保护剂，广泛应用于细胞的冷冻保存。在细胞水平，DMSO除了是一种DNA致畸因子外，还可渗入细胞内，分子中S＝O键可能与细胞内蛋白发生化学反应，致使蛋白变性。因此，对DMSO敏感的组织使用含DMSO的冷冻液会降低组织复苏后活性，进而影响细胞的功能。临床上，使用经DMSO冻存的细胞会引发广泛的身体不适，最常见的是腹泻，严重的会造成患者神经系统、呼吸系统损伤甚至死亡。

另外，现有技术中针对脂肪组织的市售培养液成分复杂，通常含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红等不适宜人体使用的成分，且在脂肪组织复苏、填充等环节上无法完全去除这些不适宜人体使用的成分。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法，有效避免了现有技术中所用到的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红、DMSO、动物血清、血小板提取物等还存在发生不良反应的缺陷。

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法的解决方案，具体如下：

一种临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

15mmol/L～50mmol/L的蔗糖；

15mmol/L～50mmol/L的甘露醇注射液；

1mmol/L～5mmol/L的葡萄糖注射液；

1mol/L～3mol/L的腺苷注射液；

0.5mmol/L～5mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1mol/L～4.5mol/L的海藻糖；

0.1mmol/L～1mmol/L的EDTA-2Na；

所述15mmol/L～50mmol/L的蔗糖、15mmol/L～50mmol/L的甘露醇注射液、1mmol/L～5mmol/L的葡萄糖注射液、1mol/L～3mol/L的腺苷注射液、0.5mmol/L～5mmol/L的还原型谷胱甘肽、1mol/L～4.5mol/L的海藻糖和0.1mmol/L～1mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液。

所述蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，其冰晶形成之前优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。

所述甘露醇注射液在医药上是利尿剂，降低颅内压和脱水药，作为脱水剂，能够提高细胞外渗透压，导致细胞内水分进入细胞外，1g甘露醇可产生渗透浓度为5.5mOsm。

所述葡萄糖注射液作为细胞能量物质，可经过不需氧的糖酵解途径或需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出能量，以三磷酸腺苷ATP形式贮存起来，供生长、运动这样的生命活动之需。

所述腺苷注射液是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是用于合成ATP三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

所述还原型谷胱甘肽是一种细胞膜稳定剂，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子；所述还原型谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能；它的生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基；GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。

所述海藻糖又称芦糖或蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类；所述海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜。

所述EDTA-2Na作为促渗剂能通过对钙离子的螯合作用破坏细胞间连接的完整性，松解细胞间的连接，间接促进冻存保护剂向组织内部渗透。

所述临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

20mmol/L的蔗糖；

20mmol/L的甘露醇注射液；

5mmol/L的葡萄糖注射液；

2mol/L的腺苷注射液；

3mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1.2mol/L的海藻糖；

0.3mmol/L的EDTA-2Na；

所述20mmol/L的蔗糖、20mmol/L的甘露醇注射液、5mmol/L的葡萄糖注射液、2mol/L的腺苷注射液、3mmol/L的还原型谷胱甘肽、1.2mol/L的海藻糖和0.3mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的溶剂或稀释剂为乳酸钠林格注射液。

所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：将手术获取的无菌脂肪组织用剪刀剪成糜状，把剪成糜状的无菌脂肪组织转入离心管一中；

步骤2：加入0.9％生理盐水到离心管一中直至浸没剪成糜状的无菌脂肪组织后，混匀离心后收集中层脂肪组织，再把中层脂肪组织从离心管一中转出来并转入离心管二中；

步骤3：加入0.9％生理盐水到离心管二中直至浸没中层脂肪组织后对中层脂肪组织进行清洗，然后离心收集脂肪层；

步骤4：将脂肪层与冻存液按体积比为(1～2)：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；

步骤5：将冻存管先置于室温中保持10min，接着在2～8℃的温度条件下静置30～40min，然后在-20℃的温度条件下静置60～90min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把所述冻存管转入液氮中长期保存。

与现有技术相比，本发明有以下优点和益处：

(1)本发明的冻存液为不含DMSO的冻存液，降低了造成组织内细胞DNA畸变和蛋白质变性的风险，同时能适应更广泛的敏感的细胞或组织存储，保持复苏后的活性，并最大限度减少因冻存对细胞或组织造成的功能影响。由于该冻存液不含有DMSO，在临床应用的脂肪组织冻存时，可以避免因DMSO造成的患者不适、腹泻、神经系统、呼吸系统损伤甚至死亡的发生概率。

(2)本发明所涉及的试剂均为市售的临床注射制剂或符合注射剂标准的原料药，不含市售培养液成分中通常含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红等不适合人体应用组分。

(3)本发明的培养基无任何动物源成分，不会引入外源性病毒污染，可以最大限度避免白蛋白等动物组分的副反应及白蛋白造成的过敏感和感染风险，

(4)相对于程序降温仪和程序降温盒，本发明的冻存操作简单，对脂肪组织冻存时单支容器体积无严格要求，降低了冻存、复苏操作复杂性和污染风险。

附图说明

图1为本发明的冻存方法流程图。

图2为本发明中的用肌酸激酶测定法对A组样品、B组样品、C组样品、对照组1和对照组2分别进行脂肪组织的复苏和组织内细胞活性检测的结果图。

图3为本发明中的A组样品和对照组2分离培养的P3和P10代细胞100倍照片的结果图。

图4为本发明中的A组样品与对照组2原代分离脂肪间充质干细胞P3流式检测结果的结果图。

图5为本发明中的成骨诱导的结果图。

图6为本发明中的成脂诱导的结果图。

具体实施方式

根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》中对临床用细胞做出的规定，应避免在细胞培养过程中使用人源或动物源性成分，如必须使用应确保无特定动物源或人源性病毒污染，并做好产品名称和批号记录，以便保持使用者和产品批次之间的关联，脂肪组织作为活细胞产品，在其保存或分离过程中同样应注意避免引入人源或动物源性成分，根据这样的要求，就对现有技术的对临床应用级别的脂肪组织的冻存液及冻存方法做了改进。

下面将结合附图和实施例对本发明做进一步地说明。

实施例1：

如图1-图6所示，临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

20mmol/L的可注射级蔗糖；

20mmol/L的甘露醇注射液；

5mmol/L的葡萄糖注射液；

2mol/L的腺苷注射液；

3mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1.2mol/L的海藻糖；

0.3mmol/L的EDTA-2Na；

所述20mmol/L的可注射级蔗糖、20mmol/L的甘露醇注射液、5mmol/L的葡萄糖注射液、2mol/L的腺苷注射液、3mmol/L的还原型谷胱甘肽、1.2mol/L的海藻糖和0.3mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的溶剂或稀释剂为乳酸钠林格注射液。所述乳酸钠林格注射液的组份为：在所述乳酸钠林格注射液乳的全量为1000ml的条件下，其组份为3.10g的乳酸钠、6.00g的氯化钠、0.30g的氯化钾、0.20g的氯化钙(CaCl2·2H2O)和剩余量为注射用水。随后还把该临床应用级别的脂肪组织冻存液过滤除菌，取样送检确定无菌后并在2-8℃的温度条件下保存，这样检测合格后备用。

所述可注射级蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，其冰晶形成之前优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。所述可注射级蔗糖目前在胚胎和卵子低温冻存中有应用。

所述甘露醇注射液在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压和脱水药，作为脱水剂，能够提高细胞外渗透压，导致细胞内水分进入细胞外，1g甘露醇可产生渗透浓度为5.5mOsm。

所述葡萄糖注射液作为细胞能量物质，可经过不需氧的糖酵解途径或需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出较多的能量，以三磷酸腺苷ATP形式贮存起来，供生长、运动这样的生命活动之需。

所述腺苷注射液是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是用于合成ATP三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

所述还原型谷胱甘肽是一种细胞膜稳定剂，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子；所述还原型谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能；它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基；GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。例如当细胞内生成少量H2O2时，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O。

所述海藻糖又称芦糖或蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类；所述海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

所述EDTA-2Na作为促渗剂能通过对钙离子的螯合作用破坏细胞间连接的完整性，松解细胞间的连接，间接促进冻存保护剂向组织内部渗透。

所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：将手术获取的无菌脂肪组织用剪刀剪成糜状，把剪成糜状的无菌脂肪组织转入离心管一中；

步骤2：加入0.9％生理盐水到离心管一中直至浸没剪成糜状的无菌脂肪组织后，混匀离心后收集中层脂肪组织，再把中层脂肪组织从离心管一中转出来并转入离心管二中；

步骤3：加入0.9％生理盐水到离心管二中直至浸没中层脂肪组织后对中层脂肪组织进行清洗，然后离心收集脂肪层；

步骤4：将脂肪层与冻存液按体积比为1：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；

步骤5：将冻存管先置于室温中保持10min，接着在2℃的温度条件下静置30min，然后在-20℃的温度条件下静置60min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把所述冻存管转入液氮中长期保存。

实施例2：

临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

50mmol/L的可注射级蔗糖；

50mmol/L的甘露醇注射液；

5mmol/L的葡萄糖注射液；

3mol/L的腺苷注射液；

5mmol/L的还原型谷胱甘肽；

4.5mol/L的海藻糖；

1mmol/L的EDTA-2Na；

所述50mmol/L的可注射级蔗糖、50mmol/L的甘露醇注射液、5mmol/L的葡萄糖注射液、3mol/L的腺苷注射液、5mmol/L的还原型谷胱甘肽、4.5mol/L的海藻糖和1mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的溶剂或稀释剂为乳酸钠林格注射液，所述乳酸钠林格注射液的组份为：在所述乳酸钠林格注射液乳的全量为1000ml的条件下，其组份为3.10g的乳酸钠、6.00g的氯化钠、0.30g的氯化钾、0.20g的氯化钙(CaCl2·2H2O)和剩余量为注射用水。随后还把该临床应用级别的脂肪组织冻存液过滤除菌，取样送检确定无菌后并在2-8℃的温度条件下保存，这样检测合格后备用。

所述可注射级蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，其冰晶形成之前优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。所述可注射级蔗糖目前在胚胎和卵子低温冻存中有应用。

所述甘露醇注射液在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压和脱水药，作为脱水剂，能够提高细胞外渗透压，导致细胞内水分进入细胞外，1g甘露醇可产生渗透浓度为5.5mOsm。

所述葡萄糖注射液作为细胞能量物质，可经过不需氧的糖酵解途径或需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出较多的能量，以三磷酸腺苷ATP形式贮存起来，供生长、运动这样的生命活动之需。

所述腺苷注射液是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是用于合成ATP三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

所述还原型谷胱甘肽是一种细胞膜稳定剂，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子；所述还原型谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能；它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基；GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。例如当细胞内生成少量H2O2时，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O。

所述海藻糖又称芦糖或蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类；所述海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

所述EDTA-2Na作为促渗剂能通过对钙离子的螯合作用破坏细胞间连接的完整性，松解细胞间的连接，间接促进冻存保护剂向组织内部渗透。

所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：将手术获取的无菌脂肪组织用剪刀剪成糜状，把剪成糜状的无菌脂肪组织转入离心管一中；

步骤2：加入0.9％生理盐水到离心管一中直至浸没剪成糜状的无菌脂肪组织后，混匀离心后收集中层脂肪组织，再把中层脂肪组织从离心管一中转出来并转入离心管二中；

步骤3：加入0.9％生理盐水到离心管二中直至浸没中层脂肪组织后对中层脂肪组织进行清洗，然后离心收集脂肪层；

步骤4：将脂肪层与冻存液按体积比为2：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；

步骤5：将冻存管先置于室温中保持10min，接着在5℃的温度条件下静置35min，然后在-20℃的温度条件下静置75min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把所述冻存管转入液氮中长期保存。

实施例3：

临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

15mmol/L的可注射级蔗糖；

15mmol/L的甘露醇注射液；

1mmol/L的葡萄糖注射液；

1mol/L的腺苷注射液；

0.5mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1mol/L的海藻糖；

0.1mmol/L的EDTA-2Na；

所述15mmol/L的可注射级蔗糖、15mmol/L的甘露醇注射液、1mmol/L的葡萄糖注射液、1mol/L的腺苷注射液、0.5mmol/L的还原型谷胱甘肽、1mol/L的海藻糖和0.1mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的溶剂或稀释剂为乳酸钠林格注射液。所述乳酸钠林格注射液的组份为：在所述乳酸钠林格注射液乳的全量为1000ml的条件下，其组份为3.10g的乳酸钠、6.00g的氯化钠、0.30g的氯化钾、0.20g的氯化钙(CaCl2·2H2O)和剩余量为注射用水。随后还把该临床应用级别的脂肪组织冻存液过滤除菌，取样送检确定无菌后并在2-8℃的温度条件下保存，这样检测合格后备用。

所述可注射级蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，其冰晶形成之前优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。所述可注射级蔗糖目前在胚胎和卵子低温冻存中有应用。

所述甘露醇注射液在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压和脱水药，作为脱水剂，能够提高细胞外渗透压，导致细胞内水分进入细胞外，1g甘露醇可产生渗透浓度为5.5mOsm。

所述葡萄糖注射液作为细胞能量物质，可经过不需氧的糖酵解途径或需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出较多的能量，以三磷酸腺苷ATP形式贮存起来，供生长、运动这样的生命活动之需。

所述腺苷注射液是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是用于合成ATP三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

所述还原型谷胱甘肽是一种细胞膜稳定剂，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子；所述还原型谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能；它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基；GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。例如当细胞内生成少量H2O2时，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O。

所述海藻糖又称芦糖或蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类；所述海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

所述EDTA-2Na作为促渗剂能通过对钙离子的螯合作用破坏细胞间连接的完整性，松解细胞间的连接，间接促进冻存保护剂向组织内部渗透。

所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：将手术获取的无菌脂肪组织用剪刀剪成糜状，把剪成糜状的无菌脂肪组织转入离心管一中；

步骤2：加入0.9％生理盐水到离心管一中直至浸没剪成糜状的无菌脂肪组织后，混匀离心后收集中层脂肪组织，再把中层脂肪组织从离心管一中转出来并转入离心管二中；

步骤3：加入0.9％生理盐水到离心管二中直至浸没中层脂肪组织后对中层脂肪组织进行清洗，然后离心收集脂肪层；

步骤4：将脂肪层与冻存液按体积比为1：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；

步骤5：将冻存管先置于室温中保持10min，接着在8℃的温度条件下静置40min，然后在-20℃的温度条件下静置90min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把所述冻存管转入液氮中长期保存。

取出一支实施例1的冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为A组样品、一支实施例2中冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为B组样品和一支实施例3中冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为C组样品，而利用现有技术的一种方法把脂肪组织与作为冻存液的乳酸钠林格注射液按体积比为1：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；将该冻存管先置于室温中保持10min，接着在8℃的温度条件下静置40min，然后在-20℃的温度条件下静置90min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把该冻存管转入液氮中长期保存，这样就是现有技术的方法一的冻存方法；还利用现有技术的另一种方法把脂肪组织与作为冻存液的混合液按体积比为1：1混匀后倒入冻存管内，该混合液为体积百分比为90％的胎牛血清和体积百分比为10％的DMSO混合而成，拧牢冻存管管盖；将该冻存管先置于室温中保持10min，接着在8℃的温度条件下静置40min，然后在-20℃的温度条件下静置90min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把该冻存管转入液氮中长期保存，这样就是现有技术的方法二的冻存方法，针对现有技术的方法一的冻存方法和现有技术的方法二的冻存方法，分别取出一支现有技术的方法一的冻存方法的冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为对照组1和一支现有技术的方法二的冻存方法的冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为对照组2。

然后用肌酸激酶测定法对A组样品、B组样品、C组样品、对照组1和对照组2分别进行脂肪组织的复苏和组织内细胞活性检测，具体检测方法如下：

1.脂肪组织的复苏，即：

取A组样品、B组样品、C组样品、对照组1和对照组2各自对应的冻存管，分别置入37℃水浴箱中快速解冻，溶解后离心除去上层油脂及下层混合液，加适量9％的生理盐水清洗2遍，再在1800pm的条件下离心10min，分别获得A组样品、B组样品、C组样品、对照组1和对照组2的纯化脂肪组织；

2.利用肌酸激酶测定法对组织内细胞进行活性检测，即：

分别把获得A组样品、B组样品、C组样品、对照组1和对照组2的纯化脂肪组织按照纯化脂肪组织体积(mL)：提取液体积(mL)为1：5的比例进行冰浴匀浆，4℃下10000g离心15min，置冰上取上清加入工作液，3min后在波长340nm下分别测定1min、2min、3min时的吸光值，计算出各条件冻存脂肪组织的组织活力。结果如图1所示，即结果显示A组样品、B组样品、C组样品与对照组1和对照组2相比，其冻存的脂肪组织内细胞的活性显著提高，这里，肌酸激酶是一个与细胞内能量运转和ATP再生有直接关系的重要激酶，主要作用是可逆性地催化肌酸和ATP生成磷酸肌酸和ADP，是一种稳定的间接反映脂肪组织活性的方法。

还进行脂肪间充质干细胞原代分离培养及鉴定，即：

1.脂肪干细胞分离培养，即：

取出一支实施例1的冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为A组样品，将A组样品的脂肪组织复苏后加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃恒温振荡器中消化40min，然后将消化好的组织在1500rpm的条件下离心10min，弃去上清液及上层油脂，加适量无血清培养基重悬，取样台盼蓝染色计数，按密度1×105/ml接种后置于37℃5％CO2孵箱培养，24h后半换液，三天后全换液，之后每3天换液一次，待细胞融合度达80％时，0.25％胰酶消化传代，传至P3代备用。还取出另一支现有技术的方法二的冻存方法的冻存了六个月的脂肪组织的冻存管作为对照组2，用相同方法分离培养该对照组2中冻存的脂肪组织传代至P3备用。

2.脂肪干细胞鉴定，即：

分别将A组样品和对照组2分离培养的细胞传代至P10代。

3.倒置显微镜下形态学观察：图3为A组样品和对照组2分离培养的P3和P10代细胞100倍照片。A组样品中的P3、P10细胞均呈梭形旋涡状排列生长，传代后的细胞大小形态均一；对照组2中的P3细胞与A组样品中的P3细胞无明显差异，但P10代细胞边缘开始变得模糊，细胞大小不均一。

4.细胞表面标志物检测：流式细胞仪分别检测P3代A组样品和对照组2分离培养的脂肪间充质干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105阳性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR阴性。此代次脂肪干细胞纯度较高，CD73、CD90、CD105应在95％以上，CD14、CD34、CD45、HLA-DR应在2％以下。检测结果如图4所示，成分明确且无动物源组分的A组样品与对照组2的该检测结果无明显差异。

还进行冻存的脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞分化能力检测，即：

1.成骨诱导，即：

细胞准备与诱导：分别取上述脂肪间充质干细胞原代分离培养及鉴定中A组样品与对照组2的消化后或者冻存复苏后的间充质干细胞，传代至P10代，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，台酚蓝染色计数后将细胞接种于六孔板中，每孔约50000个细胞，待细胞长到70％～80％时，加入成骨诱导液继续培养(对照孔加入培养液)，每三天换液，诱导3～4周后，用于组织学检测。

组织学鉴定：弃去诱导液，生理盐水清洗两次；加入10％多聚甲醛，固定30min；弃去固定液，加入茜素红染液，染色60min；用生理盐水洗2-5次，去处残留的染色液和残渣；显微镜下观察结果并进行拍照，成骨诱导结果如图5所示：A组样品中茜素红与钙发生显色反应，产生深红色复合物，成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色，对照组2中无明显深红色钙结节沉积。

2.成脂诱导，即：

细胞准备与诱导：分别取上述脂肪间充质干细胞原代分离培养及鉴定中A组样品与对照组2的消化后或者冻存复苏后的间充质干细胞，传代至P10代，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，台酚蓝染色计数后将细胞接种于六孔板中，每孔约50000个细胞，待细胞长到70％～80％时，加入成脂诱导液继续培养(对照孔加入培养液)，每三天换液，诱导3～4周后，用于组织学检测。

组织学鉴定：弃去诱导液，生理盐水清洗两次；加入10％多聚甲醛，固定30min；弃去固定液，加入油红O染液，染色60min；用生理盐水洗2-5次，去处残留的染色液和残渣；显微镜下观察结果并进行拍照。成脂结果如图6所示：A组样品中的脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色，对照组2中的胞质内无明显鲜红色脂肪。

在步骤5中将冻存管先置于室温中保持10min，接着在2～8℃的温度条件下静置30～40min，然后在-20℃的温度条件下静置60～90min后转入-80℃的温度条件下静置，这样的温度条件变化幅度大，故而在执行过程中需要进行对现场温度进行监测，这样就在步骤5中将冻存管先置于室温的温度条件中保持10min，接着在2～8℃的温度条件下静置30～40min，然后在-20℃的温度条件下静置60～90min后转入-80℃的温度条件下静置的各温度条件下的环境中设置温度传感器，所述温度传感器与微控制器连接，微控制器与无线通信模块连接，无线通信模块能与无线网中的监控平台连接，所述微控制器能够是单片机、处理器、PLC、FPGA芯片或者DSP处理芯片，所述无线通信模块能够是WIFI模块，无线网能够是WLAN网，所述监控平台能够是PC机或者笔记本电脑，这样温度传感器就能把所述各温度条件下的环境中的温度信息传递至微控制器中，再由微控制器传递到所述监控平台里，目前的监控平台与微控制器执行温度信息传递之际，为经微控制器传递要求信息链接的指令就像connect到监控平台，并在监控平台接收时建立双方的信息链路保持相连，在建立信息链路后，微控制器方可把温度信息顺利传递到监控平台，目前，微控制器各次传递温度信息均须传递要求信息链接的指令到监控平台，且于构造信息链路后方传递温度信息到监控平台里，而各次均须传递要求信息链接的指令会增大监控平台的工作量，另外会使得无线网的软硬件设施的耗损。

经过改进，提出如下的技术方案解决上述问题：

在步骤5中将冻存管先置于室温的温度条件中保持10min，接着在2～8℃的温度条件下静置30～40min，然后在-20℃的温度条件下静置60～90min后转入-80℃的温度条件下静置的各温度条件下的环境中设置温度传感器，所述温度传感器与微控制器连接，微控制器与无线通信模块连接，无线通信模块能与无线网中的监控平台连接，所述微控制器能够是单片机、处理器、FPGA芯片或者DSP处理芯片，所述无线通信模块能够是WIFI模块，无线网能够是WLAN网，所述监控平台能够是PC机或者笔记本电脑，这样温度传感器就能把所述各温度条件下的环境中的温度信息传递到微控制器中，再由微控制器传递到所述监控平台里；

所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里的方法，包括：

A-1：微控制器在同监控平台构造信息链路之际，获得所述监控平台回传的信息链路时间大小；

微控制器先传递要求信息链接的命令到监控平台，所述要求信息链接的命令为要求握手链接的命令，亦为connect这样的要求链接的命令，监控平台获得到所述要求信息链接的命令后，构造同所述微控制器的信息链路，还获得事先设定的信息链路时间大小，把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器；所述信息链路时间大小是监控平台同所述微控制器维持信息链路保持相连的时段大小；能清楚的是，所述监控平台在获得到所述要求信息链接的命令且构造同所述微控制器的信息链路之际，就能把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器，而所述微控制器获得所述监控平台回传的信息链路时间大小。

A-2：所述微控制器在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点同所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小；

所述温度信息传递命令的激活方式是：使用者在运用微控制器和监控平台执行信息传递之际，经由按压微控制器事先设定的与微控制器连接的开关来激活温度信息传递命令，在侦听到温度信息的传递命令之际，所述微控制器获得现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小，能明白的为，所述现时的时点是在侦听到温度信息的传递命令获得的，而所述信息链路构造完成的起始时点是在微控制器和监控平台顺利完成构造信息链路之际获得的，且在获得到所述起始时点之际贮存所述起始时点，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点，接着凭借获得的所述现时的时点和贮存的所述起始时点，运算出所述现时的时点和贮存的所述起始时点间的时段大小，还获得所述时段大小。

A-3：判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小；

在获得到所述时段大小，把所述时段大小和所述信息链路时间大小执行比较，来判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小。

A-4：如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台；

如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，表示所述微控制器和所述监控平台现下还维持信息链路保持相连，这时，所述微控制器能够传递温度信息到所述监控平台里，所以，所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里。

这样的温度信息传递方法，微控制器在同监控平台构造信息链路之际，先获得所述监控平台回传的信息链路时间大小，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点与所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小，还判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台，而非在温度信息传递旗舰中，各次传递温度信息均须先传递要求信息链接的命令到监控平台，且在构造信息链路后方传递温度信息到监控平台里，本发明在侦听到温度信息的传递命令之际，先判定现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果是，径直传递温度信息至所述监控平台，无须再次构造信息链路，以此降低了无线网的软硬件设备的耗损。

要改善温度信息传递的机动性，在A-3后，所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里的方法还包括：

B-1，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器再次同所述监控平台构造信息链路；

在所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，表示所述监控平台和所述微控制器的信息链路已中断了，这时所述微控制器纵然传递温度信息到所述监控平台，亦是传递不成的，所以，所述微控制器在认定所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，再次同所述监控平台构造信息链路，即所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台，来再次构造和所述监控平台的信息链路，并基于构造的信息链路来传递温度信息。

经由判定所述时段大小和所述信息链路时间大小的大小关系，来认定是不是须再次构造信息链路，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，就再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台来构造信息链路，还凭借再次构造的信息链路传递温度信息，以此改善了温度信息传递的机动性。

要改善温度信息传递的机动性，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器再次同所述监控平台构造信息链路之际，执行如下方式：

所述微控制器重建信息链路次数；在事先设定时段大小里重建的信息链路次数抵达事先设定次数之际，所述微控制器传递要求加大信息链路时间大小的消息到所述监控平台，来让所述监控平台加大所述微控制器当前的信息链路时间大小。

要改善温度信息传递的机动性，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，这里所述微控制器与显示屏连接，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令；且在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令至所述监控平台。

如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令，亦即在所述时段大小高于所述信息链路时间大小，所述微控制器能明了现时同监控平台已经中断了信息链路，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示给使用者，让使用者选取是不是再次激活要求信息链接的命令，如果在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台。而使用者能在观察到所述通告消息后，另外获知现时的无线网带宽占用率高，不能链接监控平台之际，就能不再激活要求信息链接的命令，降低了无线网的工作量。

经由传递通告消息，来让使用者激活要求信息链接的命令，让使用者在温度信息传递期间，能高效获知现时的温度信息传递条件，改善了使用者运用的实用性。

所述微控制器与闪存连接，所述闪存里贮存有：

获得程序，用来在同监控平台构造信息链路之际，获得所述监控平台回传的信息链路时间大小；

先传递要求信息链接的命令到监控平台，所述要求信息链接的命令为要求握手链接的命令，亦为connect这样的要求链接的命令，监控平台获得到所述要求信息链接的命令后，构造同所述微控制器的信息链路，还获得事先设定的信息链路时间大小，把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器；所述信息链路时间大小是监控平台同所述微控制器维持信息链路保持相连的时段大小；能清楚的是，所述监控平台在获得到所述要求信息链接的命令且构造同所述微控制器的信息链路之际，就能把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器，而所述微控制器获得所述监控平台回传的信息链路时间大小。

处置程序，用来在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点同所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小；

所述温度信息传递命令的激活方式是：使用者在运用微控制器和监控平台执行信息传递之际，经由按压微控制器事先设定的与微控制器连接的开关来激活温度信息传递命令，在侦听到温度信息的传递命令之际，所述微控制器获得现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小，能明白的为，所述现时的时点是在侦听到温度信息的传递命令获得的，而所述信息链路构造完成的起始时点是在微控制器和监控平台顺利完成构造信息链路之际获得的，且在获得到所述起始时点之际贮存所述起始时点，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点，接着凭借获得的所述现时的时点和贮存的所述起始时点，运算出所述现时的时点和贮存的所述起始时点间的时段大小，还获得所述时段大小。

判定程序，用来是不是不大于所述信息链路时间大小；

在获得到所述时段大小，把所述时段大小和所述信息链路时间大小执行比较，来判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小。

传递程序，用来如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台；

如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，表示所述微控制器和所述监控平台现下还维持信息链路保持相连，这时，所述微控制器能够传递温度信息到所述监控平台里，所以，所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里。

这样的闪存，微控制器在同监控平台构造信息链路之际，先获得所述监控平台回传的信息链路时间大小，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点与所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小，还判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台，而非在温度信息传递旗舰中，各次传递温度信息均须先传递要求信息链接的命令到监控平台，且在构造信息链路后方传递温度信息到监控平台里，本发明在侦听到温度信息的传递命令之际，先判定现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果是，径直传递温度信息至所述监控平台，无须再次构造信息链路，以此降低了无线网的软硬件设备的耗损。

所述闪存还贮存有：

构造程序，用来如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器再次同所述监控平台构造信息链路；

在所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，表示所述监控平台和所述微控制器的信息链路已中断了，这时所述微控制器纵然传递温度信息到所述监控平台，亦是传递不成的，所以，所述微控制器在认定所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，再次同所述监控平台构造信息链路，即所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台，来再次构造和所述监控平台的信息链路，并基于构造的信息链路来传递温度信息。

经由判定所述时段大小和所述信息链路时间大小的大小关系，来认定是不是须再次构造信息链路，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，就再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台来构造信息链路，还凭借再次构造的信息链路传递温度信息，以此改善了温度信息传递的机动性。

为提高温度信息传递的机动性，所述闪存贮存有重建程序余传递程序，所述重建程序用来在所述构造程序再次同所述监控平台构造信息链路之际，重建信息链路次数；在事先设定时段大小里重建的信息链路次数抵达事先设定次数之际，所述微控制器传递要求加大信息链路时间大小的消息到所述监控平台，来让所述监控平台加大所述微控制器当前的信息链路时间大小。

要改善温度信息传递的机动性，所述闪存贮存有显示程序与传递进程，所述显示程序用来如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，这里所述微控制器与显示屏连接，那么就对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令；所述传递进程在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令至所述监控平台。

如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令，亦即在所述时段大小高于所述信息链路时间大小，所述微控制器能明了现时同监控平台已经中断了信息链路，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示给使用者，让使用者选取是不是再次激活要求信息链接的命令，如果在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台。而使用者能在观察到所述通告消息后，另外获知现时的无线网带宽占用率高，不能链接监控平台之际，就能不再激活要求信息链接的命令，降低了无线网的工作量。

经由传递通告消息，来让使用者激活要求信息链接的命令，让使用者在温度信息传递期间，能高效获知现时的温度信息传递条件，改善了使用者运用的实用性。

以上以用实施例说明的方式对本发明作了描述，本领域的技术人员应当理解，本公开不限于以上描述的实施例，在不偏离本发明的范围的情况下，可以做出各种变化、改变和替换。

Claims (10)

1.一种临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，包括：

15mmol/L～50mmol/L的蔗糖；

15mmol/L～50mmol/L的甘露醇注射液；

1mmol/L～5mmol/L的葡萄糖注射液；

1mol/L～3mol/L的腺苷注射液；

0.5mmol/L～5mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1mol/L～4.5mol/L的海藻糖；

0.1mmol/L～1mmol/L的EDTA-2Na；

所述15mmol/L～50mmol/L的蔗糖、15mmol/L～50mmol/L的甘露醇注射液、1mmol/L～5mmol/L的葡萄糖注射液、1mol/L～3mol/L的腺苷注射液、0.5mmol/L～5mmol/L的还原型谷胱甘肽、1mol/L～4.5mol/L的海藻糖和0.1mmol/L～1mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液。

2.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，其冰晶形成之前优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。

3.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述甘露醇注射液在医药上是利尿剂，降低颅内压和脱水药，作为脱水剂，能够提高细胞外渗透压，导致细胞内水分进入细胞外，1g甘露醇可产生渗透浓度为5.5mOsm。

4.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述葡萄糖注射液作为细胞能量物质，可经过不需氧的糖酵解途径或需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出能量，以三磷酸腺苷ATP形式贮存起来，供生长、运动这样的生命活动之需。

5.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述腺苷注射液是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是用于合成ATP三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

6.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述还原型谷胱甘肽是一种细胞膜稳定剂，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子；所述还原型谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能；它的生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基；GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。

7.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述海藻糖又称芦糖或蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类；所述海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜。

8.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述EDTA-2Na作为促渗剂能通过对钙离子的螯合作用破坏细胞间连接的完整性，松解细胞间的连接，间接促进冻存保护剂向组织内部渗透。

9.根据权利要求1所述的临床应用级别的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液，包括：

20mmol/L的蔗糖；

20mmol/L的甘露醇注射液；

5mmol/L的葡萄糖注射液；

2mol/L的腺苷注射液；

3mmol/L的还原型谷胱甘肽；

1.2mol/L的海藻糖；

0.3mmol/L的EDTA-2Na；

所述20mmol/L的蔗糖、20mmol/L的甘露醇注射液、5mmol/L的葡萄糖注射液、2mol/L的腺苷注射液、3mmol/L的还原型谷胱甘肽、1.2mol/L的海藻糖和0.3mmol/L的EDTA-2Na混合而成混合液，该混合液为临床应用级别的脂肪组织冻存液，所述临床应用级别的脂肪组织冻存液的溶剂或稀释剂为乳酸钠林格注射液。

10.一种临床应用级别的脂肪组织冻存液的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将手术获取的无菌脂肪组织用剪刀剪成糜状，把剪成糜状的无菌脂肪组织转入离心管一中；

步骤2：加入0.9％生理盐水到离心管一中直至浸没剪成糜状的无菌脂肪组织后，混匀离心后收集中层脂肪组织，再把中层脂肪组织从离心管一中转出来并转入离心管二中；

步骤3：加入0.9％生理盐水到离心管二中直至浸没中层脂肪组织后对中层脂肪组织进行清洗，然后离心收集脂肪层；

步骤4：将脂肪层与冻存液按体积比为(1～2)：1混匀后倒入冻存管内，拧牢冻存管管盖；

步骤5：将冻存管先置于室温中保持10min，接着在2～8℃的温度条件下静置30～40min，然后在-20℃的温度条件下静置60～90min后转入-80℃的温度条件下静置，隔夜后再把所述冻存管转入液氮中长期保存。