KR102405798B1 - Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질을 포함하는 면역 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 결핵 감염 후 화학 요법의 보조 면역 치료제로 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물{Composition for Tuberculosis immunotherapy comprising Rv2882c-Rv2005c fusion protein}

본 발명은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물 및 이를 이용한 결핵 면역 치료 방법에 관한 것이다.

결핵(Tuberculosis, TB)의 감염 원인인 Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률로 주요 공중 보건 문제를 일으키는 주요 병원체이다. 결핵은 매년 약 8백만 명의 신규 감염자가 발생되며 2016년에만 167만명이 결핵으로 목숨을 잃었다. 또한 전 세계 인구의 23%인 약 17억 명의 사람들이 잠복성 결핵 감염(Latent TB infection, LTBI)을 앓고 있으며 평생 활동성 결핵에 걸릴 위험이 있는 것으로 추정된다.

현재 유일한 결핵 백신인 Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Gu

rin (BCG) 백신은 결핵에 대해 제공하는 폐 보호 기능이 충분하지 않고, 특히 BCG는 성인결핵 예방효과는 없다고 알려져 있다. 결핵관리를 위해서 가중 중요한 이슈 중의 하나는 잠복결핵의 재활성화 억제이다. AIDS와 같이 면역기능 약화되는 경우 잠복결핵은 언제든 재 활성될 수 있다. 최근 노령인구의 증가, 항암요법이나 장기이식의 경우나 그리고 류마티스 치료제인 TNF-알파 항체 치료와 같이 면역기능 억제제 사용 빈도가 증가하면서 잠복결핵 재활성화로 인한 결핵이 증가하고 있다. 그러나 BCG 백신은 재활성화 억제효과가 없어서 재활성화 억제 목적의 치료백신개발도 시급히 필요하다.

또한, 결핵은 장기간의 치료기간, 다양한 약제부작용, 약물내성 균의 출현 등으로 치료에 여러 어려움이 있다. 특히 다제내성 결핵(Multi-Drug Resistant tuberculosis)의 출현은 결핵치료를 더욱 어렵게 하고 있다. 다제내성 결핵은 넓은 의미로 2가지 이상의 항결핵 약제에 내성을 보이는 결핵을 말하지만 최근에는 이소니아지드(isoniazid)와 리팜핀(rifampin)에 동시에 내성을 나타내는 경우로 국한시켜 말하는 것이 일반적이다. 그 이유는 현재의 폐결핵 치료의 근간인 단기 요법의 가장 중요한 이론적 근거가 되는 약제가 바로 이 두 가지 약제이며 이 두 가지 약제에 동시에 내성을 갖는 경우와 이들 이외의 다른 약제에 내성을 갖는 경우와는 예후와 치료 면에서 크게 차이가 나기 때문이다. 결핵이 다제내성으로 발전하는 경우 치료과정도 매우 힘들고 성공률도 낮아진다.

다제내성결핵은 약제감수성 결과를 바탕으로 1차 치료제와 2차 치료제를 포함해 최소 4가지 이상의 약제를 결합해 투여한다. 약물치료에 잘 반응할 경우 1년 6개월에서 2년 정도의 약물복용으로 완치 가능하나, 치료에 반응하지 않을 경우 증상이 심해지면서 생명이 위태로워질 수 있으며, 노인의 경우 다제내성결핵이 발병하면 치료가 매우 어려운 실정이다. 또한 약물에 대한 부작용도 치료에 어려움을 더하고 있다.

대표적인 2차 약제인 레보플록사신(levofloxacin)은 말초신경염, 중추신경계 독성, 심근독성, 간독성의 부작용이 보고되었으며, 사이클로세린(cycloserine)은 두통, 우울증, 정신증, 발작증상이, 파라-아미노살리실산(para-aminosalicylic acid)은 속쓰림, 구역, 구토, 간염, 용혈성 빈혈의 부작용이 보고되었다.

최근에는 다제내성결핵의 치료를 위하여 화학요법과 함께 면역 치료제 개발을 위한 노력이 증가하고 있다. 결핵치료에 환자의 면역 반응을 활용하는 방법은 결핵의 진행으로부터 환자를 보호할 수 있으며, 항생제 치료의 속도를 높일 수 있다 (Abate G. et al., 2016).

결핵균이 폐에 감염되면, 수지상세포(dendritic cells, DC)는 박테리아 및 항원을 포식한다. 항원을 흡수한 DC는 이차 림프 *?**?*조직으로 이동하여 분화된다 (Cornelis J. M., 2008). 이후, DC는 MHC 클래스 분자 및 공동 자극 분자를 발현하도록 성숙되고, 감염된 단핵구와 대식세포로 형성된 육아종의 T 세포를 활성화시켜 대식세포로 하여금 결핵균 성장을 억제하도록 한다 (Stefan H.E., 2013). 이때, 육아종의 내부는 저산소증과 영양 결핍에 놓이게 되는데(Javad A., et al., 2017), 이러한 환경에서 결핵균은 잠복성의 휴면상태가 될 수 있다. 이러한 육아종 환경에서 장기간 숨어있는 데에 적응한 결핵균에서 주로 발현되는 항원은 이상적인 백신 표적이 될 수 있다. 이들 항원으로 성숙된 DC에 의해 활성화된 T 세포는 대식세포를 자극하여 세포 내의 박테리아를 죽일 수 있기 때문이다. 면역계를 활성화시키는 많은 마이코박테리아 단백질이 보고되고 있었으나, 아직 결핵에 대한 숙주 방어에서 이들 단백질의 보호 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 발명자들은 결핵균 배양 여과액의 다차원 분획으로부터 강력한 면역 반응성을 갖는 마이코박테리아 항원을 탐색하는 과정에서 활동성 결핵환자의 혈청과 강하게 반응하는 Rv2005c를 발견하였다. Rv2005c는 보편적 스트레스 단백질로(Hingley-Wilson SM et al., 2010), DosR 레귤론-코딩된 단백질 중 하나이며, 레이턴시 관련 항원으로써 이론적으로 가능성이 있는 여러 백신후보 중의 하나로 평가되었지만(Zvi A et al., 2008), 실제 백신가능성을 평가한 보고는 없다. 본 발명에서는 Rv2005c가 DC 성숙 및 Th1 분극을 유도를 통해 저산소상태의 대식세포 내의 결핵균 증식을 유의하게 억제하였으나, 마우스 모델에서 유의한 백신 효능을 나타내지 않았다. 한편, 본 발명자들의 선행연구에서 Rv2882c 단백질이 대식세포를 활성화하여 전염증성 사이토카인을 분비하도록 하고 CD80 및 CD86 동시 자극 분자와 MHC 클래스 I/II 분자를 TLR4, MyD88 와 TRIF를 통해 발현시킴을 확인한 바 있다 (한국등록특허 제1893947호). 이에 본 발명자들은 DC 성숙 및 Th1 분극 유도효과가 뛰어난 Rv2005c를 면역조성물에 이용하는 방법을 연구하는 중 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자 그룹은 선행특허인 한국등록특허 1749165호에서 미성숙 수지상세포(dendritic cells, DC)에 Rv2299c 단백질(HSP90 패밀리) 또는 Rv2299c와 ESAT6를 융합한 단백질을 처리하여 미성숙 수지상 세포(DC)의 성숙화 유도방법을 개시한 바 있으나, 본 발명과는 그 구성에서 차이가 있다.

한국등록특허 제1452983호는 결핵균의 Rv2005c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물과 결핵균의 Rv2005c 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하여 성숙화를 유도하는 방법이 기재되어 있으나, 단일 단백질을 이용하여 미성숙 수지상세포의 분화를 유도하는 점 및 면역 유도 효과에서 본 발명과는 차이가 있다.

한국등록특허 제1270999호, 결핵균의 Rv2299c 단백질을 이용한 수지상 세포의 성숙방법, 2013.05.29. 등록. 한국등록특허 제1749165호, Rv2299c 또는 Rv2299c와 ESAT6 융합한 단백질을 포함하는 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물, 2017. 06. 14. 등록. 한국등록특허 제1452983호, 결핵균의 Rv2005c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 2014. 10. 14. 등록. 한국등록특허 제1893947호, Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물, 2018. 08. 27. 등록. 미국등록특허 제7670609호, Recombinant BCG tuberculosis vaccine designed to elicit immune responses to Mycobacterium tuberculosis in all physiological stages of infection and disease, 2010년 03.02. 등록.

Abate G. et al., Immunotherapy for tuberculosis: future prospects, Immunotargets Ther., 5, 37-45, 2016. Abkhoo J., et al., Transcriptional Responses to Cinnamaldehyde in Mycobacterium tuberculosis, Int. J. Infect., 2017, 4(1), e38980. Arshid Y. et al., HspX protein as a candidate vaccine against Mycobacterium tuberculosis: an overview, Frontiers in Biology, 13(4), 293-296, 2018. Brandt L. et al., Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis, Infect. Immun., 70(2), 672-8, 2002. Brandt L. et al., Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis, Infection and Immunity, 70(2), 672-678, 2002. Chao M. C. et al., Protein Complexes and Proteolytic Activation of the Cell Wall Hydrolase RipA Regulate Septal Resolution in Mycobacteria, Plos one, 9(2), e1003197, 1-17, 2013. Cornelis J. M., et al., Robust T-cell responses and clinical responses following long peptide vaccination against high risk HPV-16, Cancer Immun. Res. 2008, 8(1), 2. Erik C. Hett, Eric J. Rubin, Bacterial Growth and Cell Division: a Mycobacterial Perspective, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72(1), 126-156, 2008. Han-Gyu C. et al., Rv2299c, a novel dendritic cell-activating antigen of Mycobacterium tuberculosis, fused-ESAT-6 subunit vaccine confers improved and durable protection against the hypervirulent strain HN878 in mice, Oncotarget. 8, 19947-19967, 2017. Han-Gyu Choi, et al., Mycobacterium tuberculosis Rv2882c Protein Induces Activation of Macrophages through TLR4 and Exhibits Vaccine Potential, PLoS One, 2016, 11(10): e0164458. Han-Gyu Choi, et al., Rv2299c, a novel dendritic cell-activating antigen of Mycobacterium tuberculosis, fused-ESAT-6 subunit vaccine confers improved and durable protection against the hypervirulent strain HN878 in mice, Oncotarget. 2017, 21; 8(12): 19947-19967. Jonathan M. P. et al., Vaccination against tuberculosis: How can we better BCG?, Microbial Pathogenesis, 2013, 58, 2-16. Khader S. A. et al., IL-23 is required for long-term control of Mycobacterium tuberculosis and B cell follicle formation in the infected lung, J Immunol. 187(10), 5402-72011, 2011. Matthews K. et al., Predominance of interleukin-22 over interleukin-17 at the site of disease in human tuberculosis, Tuberculosis (Edinb), 91(6-3), 587-593, 2011. Michelle B. R. et al., Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis Replicating in Type II Alveolar Epithelial Cells, Plos one, 10(4), e0123745, 1-22, 2015. Mihret A. The role of dendritic cells in Mycobacterium tuberculosis infection. Virulence, 3, 654-9, 2012. Okamoto Y. et al., Essential role of IL-17A in the formation of a mycobacterial infection-induced granuloma in the lung, J Immunol. 184(8), 4414-22, 2010. Ruggiero A. et al., Structure and Functional Regulation of RipA, a Mycobacterial Enzyme Essential for Daughter Cell Separation, Structure, 8(9), 1184-1190, 2010. Stefan H.E, Tuberculosis vaccines: Time to think about the next generation, Seminars in Immunology, 2013, 25(2), 172-181. Teresa M. et al., Mycobacterium bovis BCG-Specific Th17 Cells Confer Partial Protection against Mycobacterium tuberculosis Infection in the Absence of Gamma Interferon, Infection and Immunity, 78(10), 4187-4194, 2010.

본 발명의 목적은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물은 이소니아지드(Isoniazid) 및 리팜핀(Rifampin)에 저항성이 있는 다제내성 결핵 치료에 사용될 수 있다.

또한 상기 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물은 잠재성 또는 휴면성 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물을 이용한 결핵 면역 치료 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물을 제공한다.

상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질의 Rv2882c 및 Rv2005c는 각각 결핵균(M. tuberculosis) 유래의 단백질이다. 상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 암호화될 수 있다. Rv2005c는 결핵균의 휴면, 잠재 및 재 활성화 동안 상향-조절된 단백질이다.

본 발명의 면역 치료용 조성물은 결핵 감염 후 화학 요법의 보조 면역 치료로 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 치료용 조성물을 제공한다. 상기 화학 요법은 이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 에탐부톨(Ethambutol), 피라진아미드(Pyrazinamide), 리파부틴(Rifabutin), 카나마이신(Kanamycin), 아미카신(Amikacin), 카프레오마이신(Capreomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 레보플록사진(Levofloxacin), 목시플록사진(Moxifloxacin), 프로치온아미드(Prothionamide), 시클로세린(Cycloserine), 파스(p-aminosalicyclic acid), 리네졸리드(Linezolid), 델라마니드(Delamanid), 베다퀼린(Bedaquiline), 클로파지민(Clofazimine), 이미페넴(Imipenem/cilastatin), 메로페넴(Meropenem) 및 아목시실린(Amoxicillin/clavulanate)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 약제를 적용하는 것일 수 있다. 특히 본 발명은 이소니아지드(Isoniazid) 및 리팜핀(Rifampin)에 저항성이 있는 다제내성 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 면역 치료용 조성물은 잠재성 또는 휴면성 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 면역 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺TNF-α⁺ 또는 TNF-α⁺IL-2⁺를 포함하는 다기능성 T 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 결핵 면역 치료용 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 결핵 면역 치료용 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 서열 번호 2를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질의 생산에 이용될 수 있으며, 공지의 방법으로 벡터에 삽입되고 대장균 등을 형질 전환시켜 대량배양을 통해 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질의 생산에 사용될 수 있다.

본 발명은 종래 전혀 알려져 있지 않던 재조합 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질를 포함하는 면역 치료용 조성물 및 이를 이용한 결핵 면역 치료 방법을 제공함으로써 결핵 환자의 면역 반응을 효과적으로 활성화 시켜, 결핵의 치료, 특히 다제내성 결핵의 치료에 적용할 수 있다.

도 1은 MAPK 경로를 통해 DC 성숙을 유도하는 재조합 Rv2005c 효과를 확인한 결과이다. (A) 정제된 재조합 Rv2005c 단백질의 SDS-PAGE 결과. (B) 항-CD40, 항 -CD80, 항-CD86 또는 항-MHC 클래스 II Ab로 염색된 활성화된 DC의표면 마커의 발현 분석 결과. (C) DC 배양액 내의 TNF-α, IL-1β 및 IL-12p70 수준의 ELISA 측정결과 (n = 5). (D) Rv2005c 처리된 DC에 의해 생산된 phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2), phospho-IκB-α, 및 IκB-α의 면역 블롯팅 분석결과. (E) p38 억제제 (SB203580, 20mM), ERK1/2 억제제 (U0126, 10mM), JNK 억제제 (SP600125, 20mM), IκBα 인산화억제제(Bay11-7082, 20mM) 또는 DMSO (용매 대조군)로 1 시간 DC 전처리 및 10 ㎍/ml Rv2005c로 24 시간 처리 후, 배지 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-12p70의 양을 ELISA로 측정 결과 (* p <0.05, ** p <0.01 또는 *** p <0.001, n.s.: no significant difference ).
도 2는 Rv2005c로 성숙된 DC에 의해 활성화된 T 세포는 세포 내 Mtb 성장을 억제하지 않음을 나타내는 결과이다. (A) 형질 전환 OVA- 특이적 CD4⁺ T 세포를 단리 후, CFSE로 염색하고, Rv2005c (10 ㎍/ml) 또는 LPS (100 ng/ml)로 처리된 DC와 96 시간 동안 공배양한 다음, OVA323-339 (1 ㎍/ml)를 OVA-특이적 CD4⁺ T 세포에 대해 각각 적용, 대조군으로 미처리 DC와 공배양된 T 세포 및 T 세포 사용, OT-II⁺ T 세포의 증식의 유세포 분석 결과. (B) 24 시간 후 수확된 배양 상청액의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 수준 변화 (C) 3 일 동안 1:10의 DC : T 세포 비에서 자극되지 않은 DC 또는 Rv2005c- 자극된 DC에 의해 활성화된 나이브 T 세포 또는 T 세포를 Mtb로 감염된 BMDM과 공 배양 후, BMDM 세포 내의 Mtb 수. (D) (C)의 배양 상청액의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 ELISA 분석 결과.
도 3은 Rv2005c-성숙 DC로 활성화된 T 세포에 의한 Mtb 성장 억제 및 저산소 상태에서의 Rv2005c 효과를 나타낸 결과이다. (A) H37Rv 감염된 BMDM을 0 내지 300 μM CoCl₂ 로 유도된 저산소 상태에서 배양 후, HIF-1α 및 HspX에 대한 항체를 사용한 면역 블롯 분석을 수행한 결과(HIF-1α 및 HspX는 Mtb 저산소증 대조군) (B) H37Rv 감염된 BMDM 0 내지 300 μM CoCl₂로 배양 후, Rv2005c 및 ESAT-6 발현을 확인한 결과 (C) BMDC를 300 μM CoCl₂의 존재하에 24 시간 동안 배양 후 유세포 분석결과 (D) 0일차 BMDC(0’day), Mtb에 의하여 감염된 BMDC(Infection CON), 자극되지 않은 DC로 활성화된 T 세포(untreated DC- T cells)와 공배양된 BMDC, Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2005c DC- T cells)와 공배양된 BMDC (정상산소 조건 N) 및 Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2005c DC- T cells)와 공배양된 BMDC (저산소 조건 H)에서 3일간의 공동 배양한 후 BMDM 내의 박테리아 수를 측정한 결과 (E) (D) 조건에서 각 그룹의 배양 상청액에서의 사이토카인 수준을 측정한 결과
도 4는 Rv2005c의 예방 백신 효능을 평가한 결과이다. (A) Rv2005c의 예방 백신 효능을 평가를 위한 마우스 예방 접종 시간표 (B) Rv2005c 자극에 의한 폐 세포의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 ELISA 결과 (C) Mtb 감염 6 주후, 폐 내의 박테리아 부담 결과 (Log10으로 표시)
도 5는 결핵 감염 모델에서 화학요법 후, Rv2005c의 보조 면역 치료 효능을 나타내는 결과이다. (A) 결핵 감염 모델에서 화학요법 후, Rv2005c의 보조 면역 치료 효능 평가를 위한 시간표 (B) 화학요법 및 Rv2005c 면역 치료에 따른 폐 내의 박테리아 부담 결과 (Log10으로 표시)
도 6은 BCG 부스터 모델에서 BCG 백신 후 Rv2882c의 보조 면역 부스팅 효과를 나타내는 결과이다. (A) BCG 부스터 모델에서 BCG 백신 후, Rv2882c의 보조 면역 부스팅 효능 평가를 위한 시간표 (B) BCG 백신 및 Rv2882c의 부스팅에 따른 폐 내의 박테리아 부담 결과
도 7은 재조합 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 암호화하는 DNA의 염기 서열 (서열번호 2)을 나타낸 것이다.
도 9는 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질-성숙 DC로 활성화된 T 세포에 의한 세포 내 Mtb 성장 억제는 저산소 상태에 의해 향상되는 것을 나타낸 결과이다. (A) 본 발명의 재조합 Rv2882c-Rv2005c 단백질의 SDS-PAGE 결과 (B) Rv2882c-Rv2005c 또는 LPS로 활성화된 BMDC의 배양 배지에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-12p70 수준을 ELISA로 측정한 결과 (C) 3 일 동안 1:10의 DC : T 세포 비에서 자극되지 않은 DC, LPS-자극된 DC 또는 Rv2882c-Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포의 사이토 카인 수준을 측정한 결과 (D) 0일차 BMDC(0’day), Mtb에 의하여 감염된 BMDC(Infection CON), 자극되지 않은 DC로 활성화된 T 세포(untreated DC-T cells)와 공배양된 BMDC, Rv2882c-Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2882c-Rv2005c DC-T cells)와 공배양된 BMDC(정상산소 조건 N) 및 Rv2882c-Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2882c-Rv2005c DC-T cells)와 공배양된 BMDC (저산소 조건 H)에서 3일간의 공동 배양한 후 BMDM 내의 박테리아 수를 측정한 결과
(D) 0일차 BMDC(0’day), Mtb에 의하여 감염된 BMDC(Infection CON), 자극되지 않은 DC로 활성화된 T 세포(untreated DC- T cells)와 공배양된 BMDC, Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2005c DC- T cells)와 공배양된 BMDC (정상산소 조건 N) 및 Rv2005c-자극된 DC에 의해 활성화된 T 세포(Rv2005c DC- T cells)와 공배양된 BMDC (저산소 조건 H)에서 3일간 공동 배양한 후 BMDM 내의 박테리아 수를 측정한 결과 (E) (D) 조건에서 각 그룹의 사이토카인 수준을 측정한 결과
도 10은 본 발명의 Rv2882c-Rv2005c 단백질은 면역 치료 효과를 보여주는 결과이다. (A) Rv2005c-Rv2005c의 예방 백신 효능을 평가를 위한 마우스 예방 접종 시간표 (B) 화학요법 및 Rv2005c-Rv2005c 면역 치료에 따른 폐 내의 박테리아 부담 결과 (Log10으로 표시) (C) Rv2882c-Rv2005c (5 ㎍/ml) 처리한 폐 세포의 사이토카인 수준 변화
도 11은 상기 결핵 감염 모델에서 화학요법 및 Rv2882c-Rv2005c의 보조 면역 치료에 따른 Rv2882c-Rv2005c 특이적 CD4⁺ T 세포의 다기능성 사이토카인 생산을 분석한 결과이다. (A,B) 6, 9, 12, 20 주에서 약물 또는 약물 및 Rv2882c-Rv2005c 군에서 활성화된 CD4⁺CD44⁺CD62^- T세포의 사이토카인 생산 및 다기능성 CD4⁺CD44⁺ T세포의 백분율의 치료 과정 동안의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. 재료 및 방법>

1.1 마우스

특정 병원체 부재 암컷 C57BL/6 (H-2K^b 및 I-A^b), C57BL/6J TLR2 녹아웃 마우스(TLR2^-/-; B6.129-Tlr2^tm1Kir/J) 및 C57BL/10 TLR4 녹아웃 마우스(TLR4^-/-; C57BL/10ScNJ) 마우스, C57BL/6 OT-1 및 OT-2 T 세포 수용체 트랜스제닉 마우스는 5-6주령으로 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. 이들 마우스는 충남대학교 의료연구센터 생물위험동물실에서 장벽하에 유지시키면서 무균의 상업적 마우스식이를 공급하고 물을 임의로 제공하였다. 모든 동물 실험은 충남 대학교 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며(허가 번호 : 201903A-CNU-5), 모든 동물 절차는 한국 식품 의약품 안전청의 지침에 따라 수행되었다.

1.2 감염, 세균 균주 및 세포 제제

1.2.1 마이코박테리아

Mtb H37Rv (ATCC 27294) 및 H37Ra (ATCC 25177)는 American Type Culture Collection (ATCC, VA, Manassas, VA)에서 구입하였고, M. bovis BCG (도쿄 균주)는 한국 결핵 연구소 (KIT)에서 제공받았다. 모든 마이코박테리아는 0.5% 글리세롤, 0.05% 트윈-80 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스), 10% 올레산-알부민-덱스트로스-카탈라제 (OADC; 시그마)가 보충된 7H9 배지에서 성장시켰다.

1.2.2 골수 유래 대식세포( BMDMs )

골수 유래 대식세포(BMDMs)는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (대한민국, 대구)로 C57BL/6 마우스의 대퇴골에서 플러싱하였다. 적혈구는 실온에서 3 분 동안 RBC 용해 완충액(시그마-알드리치)을 적용하여 용해시켰다. 세포를 세척하고 단일 세포 현탁액을 제조한 후, 총 세포를 10% 소태아 혈청, 50 ng/ml 마우스 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 1% 항생제(웰진)를 함유하는 DMEM에 현탁시켰다. 이어서, 세포를 100-mm 플레이트에 넣고 37℃, 5 % CO₂에서 7 일 동안 배양하였다. 배지는 7 일 배양 동안 3 일마다 교체하였다.

1.2.3 골수 유래 수지상 세포 ( BMDC )

골수 유래 수지상 세포 (BMDC)는 10% FBS, 1% 항생제 (웰진), 0.1% 2-머 캅토 에탄올이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 5mM HEPES 완충액, 1% MEM 용액, 20 ng/ml 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 2 ng/ml IL-4. 비접착 세포 및 느슨하게 부착된 증식 DC 응집체는 7 일 또는 8 일에 수확하여 추가 실험에 사용하였다.

1.2.4 마우스 폐, 비장 세포

폐를 멸균 조건 하에서 단리한 후, 0.5 cm 로 절단하고, 5 ml 세포 해리 완충액 (0.1% 콜라게나제 유형 IV를 함유하는 RPMI 배지 (미국, 뉴저지주 워싱턴), 1 mM CaCl₂ 및 1 mM MgCl₂)에서 37℃에서 15 분 동안 교반하였다. 이어서, 멸균 1-ml 시린지를 이용하여 둘베코 인산염 완충 식염수 (PBS) 에서 100-μm 세포 여과기를 통해 폐 세포 및 응집체를 여과하였다.

비장은 RPMI 배지 (웰진)에 부유하여 100-μm 세포 스트레이너 위에서 으깬 후, 적혈구를 실온에서 2 분 동안 RBC 용해 완충제를 사용하여 용해시켰다. 고-그라데이션 자기-활성화 세포 분류기(MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 T 세포 서브 세트를 분획하였다. 세포를 항-마우스 CD4 Ab-코팅된 자기 마이크로 비드 (Miltenyi Biotec)와 함께 인큐베이션 한 다음, 제조업체의 지시에 따라 상자성 컬럼 (LS 컬럼; Miltenyi Biotec)에서 양성 선택 하였다.

1.3 항체 및 시약

재조합 M-CSF는 Peprotech (미국 뉴저지 주 로키 힐)에서 구입하였다. 플루 오레신이소티오시아네이트(FITC)-아넥신 V/PI 키트는 BD Biosciences (BD Pharmingen, San Jose, CA)로부터 구입하였다. E.coli O111 : B4의 LPS는 invivoGen (미국 캘리포니아 샌디에고)에서 구입하였다. 내 독소 필터 (END-X) 및 내 독소 제거수지 (END-X B15)는 케이프 코드의 어소시에이트 (East Falmouth, MA, USA)로부터 입수하였다. 항인산화된 ERK 1/2 모노클로날 Ab, 항인산화된 p38 모노클로날 Ab, 항인산화된 JNK 모노클로날 Ab, 항인산화된 IκB-α 모노클로날 Ab, 항 -IκB-α 모노클로날 Ab 및 항튜불린 폴리클로날 Ab는 셀시그널링테크놀로지(미국, 메사추세츠 댄버스)에서 입수하였다. 항히스티딘(His) Ab는 산타 크루즈 바이오 테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) (미국, 캘리포니아주 산타크루즈)에서 구입 하였다. HRP-접합된 항-마우스 IgG Ab 및 HRP-접합된 항-토끼 Ab는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)으로부터 입수하였다. CD40, CD80, CD86 및 MHC 클래스 II에 대한 피코에리트린 (PE)-공액 mAb 및 CD11b에 대한 알로피코시아닌 (APC)-공액 모노클로날 Ab는 eBioscience (San Diego, CA, USA)로부터 구매하였다. 마우스 TNF-α, IL-1β, IL-12p70, IL-17, IFN-γ, IL-4 및 IL-2 ELISA 키트는 eBioscience에서 입수하였다.

1.4 재조합 단백질의 정제

재조합 Rv2882c-Rv2005c 및 개별 단백질을 생성하기 위해, 상응하는 유전자를 주형으로서 Mtb H37Rv ATCC27294 게놈 DNA 및 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 : Rv2882c-Rv2005c 융합단백을 위해서는, Rv2882c 정방향, 5'-GAATTCGATGATTGATGAGGCTCTTC-3'; Rv2882c 역방향, 5'-AAGCTTGACCTCCAGCAG CTCGCCTTCC-3'; Rv2005c 정방향, 5'-AAGCTTATGTCTAAACCCCGCAAGCAG-3'; Rv2005c 역방향, 5'-GCGGCCGCCGACTGCCG TGCCACGATCAC-3'; Rv2882c단일단백을 위해서는 Rv2882c 정방향, 5'-CATATGATTGATGAGGCTCTCTTCGAC-3'; Rv2882c 역방향, 5'-AAGC TTGACCTCCAGCAGCTCGCCTTC-3'; Rv2005c단일 단백을 위해서는 Rv2005c 정방향, 5'-CATATGTCTAAACCCCGCAAGCAGCAC-3'; Rv2005c 역방향, 5'-AAGCTTCGACTGCCGTGCC ACGATCAC-3' 프라이머를 사용하였다.

Rv2882c-Rv2005c의 PCR 생성물은 EcoR I 및 Hind III 및 Not I로 절단하고, Rv2882c는 Nde I 및 Hind III으로, Rv2005c는 Nde I 및 Hind III으로 절단하였다. 생성물을 pET22b (+) 벡터 (Novagen, Madison, WI, USA)에 삽입하고 생성된 플라스미드를 서열분석 하였다. 모든 재조합 플라스미드를 대장균 BL21 세포로 형질 전환시켰다. 재조합 플라스미드를 함유하는 대장균 세포를 37 ℃ 진탕 배양기에서 성장시켰다. 600 nm의 파장에서 광학 밀도 (OD)가 되었을 때, 이소프로필-D-티오 갈 락토피라노시드 (IPTG; 대전, ELPIS- 바이오텍)를 1mM의 농도로 첨가하였다. 4 내지 6 시간 후, 박테리아 세포를 원심 분리에 의해 수확하고 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 5 mM 이미다졸, 6M 우레아 및 1 mM 페닐 메틸술포닐플루오라이드 (Sigma)에 현탁시켰다. 단일 단백질의 정제를 위해, 우레아를 제외하고는 동일한 조성물이 사용되었다. 초음파 처리에 의한 용해 후, 재조합 단백질을 제조사의 지시에 따라 니켈-니틸 로트리 아세트산 (Ni-NTA) 아가로스 크로마토그래피로 정제하였다 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). 각 정제 단계는 항-His 항체 (Santa Cruz)를 사용하여 쿠마시 브릴리언트 블루 (CB) 스테인 및 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 갖는 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석되었다. 정제된 단백질을 농축시키고 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 투석하였다. PBS는 모든 단일 단백질의 투석에 사용되었다. 내 독소를 제거하기 위해, 투석된 단백질을 폴리믹신 B-아가로스 (PMB, 시그마)와 함께 4 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다. 마지막으로, 정제된 내 독소가 없는 재조합 단백질을 필터 멸균하고 -70 ℃에서 동결시켰다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민 (BSA)을 표준으로 하는 비신코니닉산 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 계산하였다. 모든 단백질의 순도는 항 히스티딘 항체를 사용하여 CB 염색 및 WB에 의해 평가되었다.

1.5 세포 독성 분석

12 웰 플레이트 (5x10⁵ cells/ml)에서 배양된 분리된 BMDM에 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c (10 ㎍/ml), CoCl₂ (300μM) 또는 CoCl₂ (300μM)가 있는 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c(10 ㎍/ml)를 첨가하여 세포 독성 효과를 확인하였다. 처리 24 시간 후, 수확된 BMDM을 PBS를 사용하여 세척하고, FITC-아넥신 V 및 PI (BD Biosciences)로 염색한 후, FACSCanto 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.

1.6 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)

샌드위치 효소-연결 면역 흡착 분석법을 사용하여 배양 배지에서 TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-12p70을 검출하였다. 제조사 (eBioscience 및 BD Biosciences)에 의해 권장된 바에 따라 배양 배지에서 사이토카인의 분석을 수행하였다. 배양 배지 내로 방출된 사이토카인의 수준은 마이크로 플레이트 리더로 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 재조합 사이토카인의 표준 곡선을 사용하여 사이토카인의 농도를 계산하고 그 결과를 밀리 리터당 픽토그램으로 나타내었다.

1.7 유세포 분석

BMDC를 24 시간 동안 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c (10 ㎍/ml)로 자극하였다. 자극된 세포를 수확하고 PBS로 세척하였다. BMDC는 PE-접합된 항-CD40, 항-CD80, 항-CD86, 항-MHC 클래스 I (H-2Kb) 및 항-MHC 클래스 II (1-A/1-E)와 함께 플루오레세인이소시아시아네이트 (FITC)로 염색되었다. 4 ℃에서 30 분 동안 접합된 CD11c 세포를 PBS로 세척하고 250 μl PBS에 현탁시켰다. 형광은 유세포 분석에 의해 측정되었고, 데이터는 Flow Jo (트리 애리조나주 애쉬랜드)를 사용하여 처리되었다.

1.8 웨스턴 블롯 분석

Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c (10 ㎍/ml)로 자극한 후, 배양 배지를 제거하고 BMDC를 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 2 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1% 소듐 데옥시콜레이트 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 얼음상에서 30 분 동안 방치하여 세포를 용해시켰다. 세포 단백질의 농도는 브래드 포드 (Bradford) 분석에 의해 결정되었고, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 폴리비닐리딘디플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 차단하고 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 0.1% 트윈 20 (PBS/T)을 함유하는 PBS로 10 분 동안 3 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 HRP-접합된 2 차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 단백질을 시각화하기 위해 강화 화학 발광 시스템 (ECL; Millipore Corporation, 미국 매사추세츠 주 빌 메리 카)을 사용하여, 화학 발광 필름에 노출시켰다.

1.9 시험관내 T-세포 증식 분석

나이브 T 세포 반응에 참여하는 반응자 T 세포를 BALB/c 마우스로부터 추출된 총 단핵 세포로부터 MACS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 단리하였다. 반응자인 OVA-특이적 CD4⁺ T 세포는 각각 OT-2 마우스의 비장 세포로부터 수득하였다. 이들 T 세포는 1 μM CFSE (Invitrogen)로 염색되었다. 24 시간 동안 10 ㎍/ml의 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c 의 존재하에 OVA 펩티드로 처리된 DC (웰당 2 x 10⁵ 세포)를 CFSE-염색된 CD4⁺ T 세포 (2 x 10⁶)와 DC : T 세포비 1:10로 공동 배양하였다. 공동 배양 3 일 또는 4 일에, 각 T 세포 배치를 PerCP-Cy5.5-접합된 항-CD4⁺ 모노클로날 Ab로 염색하고 유세포 분석법으로 분석하였고, 상청액을 수확하여 ELISA로 IFN-γ, IL-2 및 IL-4의 수준을 분석하였다.

1.10 CoCl ₂ 에 의한 저산소증 유발 BMDM

1.10.1 세포 독성 분석

코발트 클로라이드 (CoCl₂) (0.1-1 mM)를 12-웰 플레이트 (5 x 10⁵ cells/ml)에서 배양된 단리된 BMDM에 첨가하여 CoCl₂의 세포 독성 효과를 조사하였다. 처리 24 시간 후, 수확된 BMDM는 PBS를 사용하여 세척하고, FITC-아넥신 V 및 PI(BD Biosciences)로 염색한 후, FACSCanto 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 분석 하였다.

1.10.2 웨스턴 블롯 분석

BMDM에서 CoCl₂ (Sigma)로 24 시간 처리한 후, 배양 배지를 제거하고 BMDC를 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 2 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1% 소듐 데옥시 콜레이트 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 얼음상에서 30 분 동안 방치하여 세포를 용해시켰다. 세포 단백질의 농도는 브래드 포드 (Bradford) 분석에 의해 결정되었고, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 폴리비닐리딘디플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 차단하고 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 0.1% 트윈 20 (PBS/T)을 함유하는 PBS로 10 분 동안 3 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 HRP-접합된 2 차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 단백질을 시각화하기 위해 강화 화학 발광 시스템 (ECL; Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 빌메리카)을 사용하여, 화학 발광 필름에 노출시켰다.

1.10.3 저산소증 유도된 Mtb의 세포 내 생존

BMDM을 Mtb로 4 시간 동안 1 : 1 (박테리아: BMDM)의 다수의 감염으로 감염시켰다. 감염된 BMDM을 2 시간 동안 아미카신 (200 ㎍/ml)으로 처리한 다음 PBS로 2 회 세척하였다. BMDC를 Rv2005c (10 ㎍/ml), Rv2882c-Rv2005c (0.5 ㎍/ml) 또는 LPS (100 ng/ml)로 24 시간 동안 처리한 다음, 3 일 동안 비장세포와 함께 배양하였다. DC-비장세포를 감염된 BMDM과 3 일 동안 공동 배양하였다. 대식세포 배양물은 0.1% 사포닌을 사용하여 즉시 용해시켜 박테리아 부담을 결정하였다. 상청액 및 세포 용해물을 연속 희석하고 10% OADC 농축 배지가 보충된 7H10 한천 플레이트에 플레이팅하여 웰당 박테리아 부담을 결정하였다.

1.11 백신 평가

1.11.1 in vivo 화학 요법 분석

진행성 폐 TB를 유도하기 위해, 마우스 (n = 15/그룹)를 1.2% 2,2,2-트리브로모에탄올 (아베르틴)으로 마취시키고, 작은 중간선 절개를 통해 노출시킨 후, 50 μl 식염수에 포함된 Mtb H37Ra 1 x 10⁴ CFU 를 기관 내(IT)에 접종하였다. Mtb 감염된 동물에서 이 항원 및 화학 요법에 대한 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질에 의한 면역 요법 과정 전후에 생성된 보호 효능 및 면역 반응을 평가하기 위해, 마우스를 무작위로 5 마리씩 그룹으로 나누고, Rv2005c 또는 Rv2882c- Rv2005c 및 보조제, 또는 보조제 단독을 처리하였다. Rv2005c 또는 Rv2882c- Rv2005c는 DDA (250 ㎍/용량/마우스) 및 MPL (25 ㎍/용량/마우스)에 단백질을 유화시켜 5 ㎍/용량/마우스로 투여되었다. 대조군은 보조제 단독으로 면역화되었다. '짧은 기간' 화학 요법으로 감염 3 주 후, 이소니아지드 (INH, 0.1 g/L) 및 리팜핀 (RIF, 0.1 g/L)을 주었으며, 4 주 동안 자유롭게 식수를 제공하였다. 이 마우스를 3, 6, 9, 12 또는 20 주 후에 희생시켜 폐를 분리하였으며, CFU, ELISA 및 FACS 분석에 사용하였다.

1.11.2 항원 특이적 반응 T 세포 분비 사이토카인 수준 분석

감염 후 6, 9, 12 또는 20 주에, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-17 의 ELISA 분석을 위해 마우스를 희생시켰다. 사용된 마우스 폐에서 유래된 각 세포 (5 x 10⁵ cells/well)를 PRMI1640 + 10 % FBS 배지 (음성 대조군) 또는 Rv2005c 또는 Rv2882c-Rv2005c (5 ㎍/ml)와 함께 37 ℃에서 72 시간 동안 3 배수로 각 48 웰 마이크로 타이터 플레이트에서 배양하였다. 배양 배지에서 사이토카인의 분석은 제조사 (eBioscience)에서 권장하는 대로 수행되었다. 배양 배지 내로 방출된 사이토카인의 수준은 마이크로 플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

1.11.3 세포 내 사이토 카인 분석

세포 내 사이토카인 염색을 위하여, 상기 마우스로부터 분리한 단일 세포 현탁액 (2 x 10⁶ 세포)을 GolgiStop (BD Biosciences)의 존재하에 37 ℃에서 12 시간 동안 각각의 항원 (5 ㎍/ml)으로 자극하였다. 이후, 세포를 4 ℃에서 15 분 동안 Fc Block (항-CD16/32)으로 차단한 다음, BV605-접합된 항-CD4, FITC-접합된 항-CD62L 및 PE-접합된 항-CD44 항체로 4 ℃에서 30 분 동안 염색하였다. 이들 세포를 Cytofix/Cytoperm 키트 (BD Biosciences)로 고정 및 투과시켰다. 세포 내 TNF-α, IL-2 및 IFN-γ는 침투 완충액에서 PE Cy7-접합된 항-TNF-α, APC-접합된 항-IL-2 및 PE-접합된 항-IFN-γ 항체를 사용하여 검출하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 항체는 eBioscience (San Diego, CA)에서 구입하였으며, 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 프로그램인 FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA)를 사용하여 Novagen에서 세포를 분석하였다.

1.11.4 세균 수 분석

H37Ra 챌린지 후, 마우스를 CO₂ 로 안락사시키고, 폐를 적출하여 균질화시켰다. 생존 박테리아의 수는 10 % OADC (Difco Laboratories), 암포테리신 B (Sigma-Aldrich, St. Louis) 및 2 ㎍/ml 2-티오펜카르복실산히드라지드 (Sigma-Aldrich)가 보충된 Middlebrook 7H10 한천 (Difco Laboratories, Detroit, MI)에 상기 폐 균질액을 연속 희석하여 플레이팅하고, 37 ℃에서 4 주 배양 후 콜로니를 계수하여 측정하였다. CFU에 대한 데이터 및 폐 염증의 평가는 log₁₀ CFU ± 사분위 범위 (IQR)로 수행되었다.

1.12 통계 분석

모든 실험은 3 회 이상 반복하였다. 샘플 간 비교에 대한 유의 수준은 통계 소프트웨어 (GraphPad Prism Software, 버전 4.03; GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용한 Tukey의 다중 비교 시험 분포로 결정하였다. 그래프의 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, * p <0.05, ** p <0.01 또는 *** p <0.001 로 각 값과의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 2. Rv2005c 의 면역 요법 효과>

2.1 Rv2005c의 식별 및 준비

본 발명자들은 선행실험에서 Mtb 배양 여과 단백질을 생화학적 크로마토그래피로 분별하고, 각 분획의 면역 반응성을 측정한 결과, 활성 TB 환자의 혈청과 강하게 반응 한 단백질로 Rv2005c를 확인하였다. DC에서 이 Rv2005c의 면역학적 활성을 정의하기 위해, 먼저 상기 단백질을 대장균 BL21에서 발현시키고 His-친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 Rv2005c 단백질은 SDS-PAGE상에서 30 kDa에서 주요 단일 밴드로 나타났으며(도 1A (a)) 면역 블롯에서 항-His 항체와 강하게 반응하였다 (도 1A (b)).

2.2 Rv2005c의 DC 성숙 및 활성화 유도

Rv2005c가 DC의 성숙을 유도할 수 있는지 조사하였다. Rv2005c로 처리된 BMDC는 공동-자극 분자 CD40, CD80 및 CD86뿐만 아니라 MHC 클래스 II 분자를 의 용량-의존적 방식으로 발현을 유의하게 향상시켰다(도 1B). 5 ㎍/ml의 농도에서 Rv2005c 활성은 양성 대조군으로 사용된 LPS (100 ng/ml)의 활성과 유사하였다. MAPK 및 NF-κB는 DC의 성숙을 제어하고 전염증성 사이토카인의 분비에 중요한 신호전달분자인 것으로 잘 알려져있다 (Choi H.G., et al., 2017). 따라서, Rv2005c에 반응하는 MAPK 및 NF-κB의 활성화를 조사하였다. 도 1D에서 보는 바와 같이, Rv2005c는 p38 및 ERK 1/2의 인산화뿐만 아니라 DC에서의 IκB-α의 인산화 및 분해를 유발하였다.

또한, p38 억제제 (SB203580), ERK 1/2 억제제 (U0126), JNK 억제제 (SP600125) 및 NF를 포함한 특정 약리학적 억제제를 사용하여 Rv2005c 유도 DC 활성화에서 MAPK 및 NF-κB의 활성화를 확인하였다. 도 1E에서 보는 바와 같이, 모든 억제제는 BMDC에서 Rv2005c-유도된 전염증성 사이토카인의 생성을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 Rv2005c가 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로를 통해 DC 성숙 및 활성화를 유도함을 시사한다.

2.3 Rv2005c에 의해 성숙된 DC에 의하여 활성화된 T 세포의 세포 내 Mtb 성장에 대한 효과 확인

BMDC에서 표면 분자의 발현 증가는 T 세포와의 상호 작용 및 활성화를 촉진한다. BMDC 및 T 세포 상호 작용과 관련하여 Rv2005c 활성을 정확하게 특성화하기 위해, 본 발명자들은 OT-II TCR 형질 전환 CD4⁺ T 세포를 사용하여 동종 MLR(mixed lymphocyte reaction) 분석을 수행하였다. 도 2A에서 보는 바와 같이, OVA_{323 -339}로 펄싱된 BMDC와 함께 배양된 T 세포는 펄싱되지 않은 (no OVA) 대조군에 비하여 세포증식이 관찰되었으며, OVA_{323 -339}로 펄싱된 Rv2005c-처리된 BMDC와 함께 배양된 T 세포는 OVA_{323 -339}로 펄싱되고, 처리되지 않은 BMDC 또는 OVA_{323 -339}로 펄싱되고, LPS-처리된 BMDC와 함께 배양된 T 세포보다 더 세포증식된 것이 관찰되었다.

또한, 도 2B에서 보는 바와 같이, Rv2005c-처리된 BMDC로 프라이밍된 나이브 CD4⁺ T 세포는, 처리되지 않은 BMDC 또는 LPS-처리된 BMDC로 프라이밍된 것보다 유의하게 더 높은 수준의 IFN-γ 및 IL-2를 생성하였다. 그러나 IL-4의 생성에는 차이가 없었다 (도 2B).

다음으로, Rv2005c-성숙 BMDC가 실제로 Mtb의 제어에 역할을 할 수 있는지 테스트했다. 감염되지 않은 마우스로부터의 나이브 비장 T 세포를 72 시간 동안 Rv2005c-성숙 DC와의 공동 배양으로 활성화시킨 다음, Mtb-감염된 골수-유래 대식세포 (BMDM)에 첨가하였다. 도 2C에 도시된 바와 같이, Rv2005c-성숙 BMDC에 의해 활성화된 T 세포는 일부 박테리아 성장 억제를 나타내었지만, 미처리 DC 또는 감염 대조군과 비교할 때 유의한 억제를 나타내지 않았다.

또한, 도 2D에서 보는 바와 같이, Rv2005c-성숙 DC에 의한 T 세포는 처리되지 않은 DC로 활성화된 T 세포와 비교하여 BMDM에서 유의하게 IFN-γ 및 IL-2 생성을 유도하였으나, IL-4는 유도하지 않았다 (도 2D).

2.4 결핵균이 감염된 대식세포를 저산소 조건에 노출되는 경우 Rv2005c의 발현증가와 세포 내 결핵균 증식억제 효과

Rv2005c는 저산소증에 의해 유도된 Mtb 유전자 중 하나이며, 휴면 및 재활성화 동안 상향-조절되는 단백질이다. 따라서, 본 발명자들은 Rv2005c가 저산소 상태를 유도하는 CoCl₂로 처리된 대식세포의 세포 내 환경에서 발현될 수 있음을 조사하였다. 상이한 CoCl₂ 농도로 24 시간 동안 배양된 Mtb 감염 BMDM에서 HIF-1α 및 HspX (Rv2031c)의 발현을 측정하였다. HIF-1α 및 HspX는 각각 저산소증에 의해 진핵 세포 및 Mtb에서 유도되는 전형적인 단백질이다. 면역 블롯 분석은 300 μM CoCl₂로 처리된 대식세포에서 두 단백질의 발현이 명확하게 유도된 것으로 나타났다 (도 3A).

Rv2005c는 CoCl₂ 처리없이 Mtb-감염된 대식세포에서 약하게 발현되었지만, CoCl₂ 처리에 의해 용량 의존적 방식으로 발현이 증가하였다 (도 3B). 이는 Rv2005c 발현이 스트레스 조건 하에서 Mtb에서 향상됨을 나타낸다. CoCl₂ 처리에 의하여 T 세포-자극 Mtb 항원 중 하나인 ESAT-6 발현에는 차이가 없었다.

또한 CoCl₂가 BMDMs에서 세포 독성을 나타내는지 확인하였다. 도 3C에 도시된 바와 같이, CoCl₂ 는 300 μM에서 Mtb 감염 및/또는 Rv2005c 처리와 상관없이 BMDM에서 세포 독성을 나타내지 않았으며, 이는 CoCl₂ 단독으로 본 분석 시스템에서 세포 생존에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.

CoCl₂ 처리 조건 하에서도 상기 실시예 2.3과 동일한 실험을 반복하였다. Rv2005c-성숙 DC에 의해 활성화된 T 세포는 대식세포에서 Mtb의 성장을 억제하지 않았지만, 저산소 조건에서는 박테리아 성장을 유의하게 억제하였다 (도 3D). 또한, 대조군 또는 정상산소 상태의 경우보다 저산소 조건에서 Rv2005c-성숙 DC로 활성화된 T 세포는 Mtb-감염 대식세포에서 유의하게 더 높은 IFN-γ 및 IL-2 생성을 유도하였다 (도 3E). 이러한 결과는 저산소 조건에서는 대식 세포 표면에 Mtb에서 발현되는 Rv2005c의 펩타이드를 제시할 수 있고, DC에 의해 활성화된 Rv2005c 관련 T 세포와 상호 작용할 수 있는 것으로 해석된다.

2.5 Rv2005c의 직접적인 백신 효능과 BCG 부스팅 효능 평가

마우스 모델에서 Rv2005c의 직접 백신 효과를 테스트하였다. 도 4A는 Rv2005c의 예방 백신 효능을 평가를 위한 마우스 예방 접종 시간표이다. BCG 대조군 마우스는 BCG로 0주에 1회 면역시켰으며, 감염대조군은 면역시키지 않았다. MPL 대조군은 Rv2005c 현탁 어주번트만으로 면역시켰으며, Rv2005c/MPL-DDA 실험군은 마우스를 Rv2005c/MPL-DDA로 2 주 간격으로 3 회(0, 2, 4 주) 면역시키고 최종 면역화 후 6 주 후에 모든 군에 1 x 10⁶ CFU의 Mtb H37Ra를 기관 내 감염시켰다. 감염 6 주 후, 마우스를 희생시키고 폐에서의 박테리아 부담 및 사이토카인 수준을 평가하였다.

도 4B에서 보는 바와 같이, Rv2005c로 면역화된 마우스에서 Rv2005c-특이적 IFN-γ 생산이 확인되었다. 그러나 도 4C에 도시된 바와 같이, 폐에서의 박테리아 부담은 감염 대조군과 비교하여 BCG-면역화 그룹에서 현저하게 감소되었지만, 어주번트, 또는 Rv2005c로 면역화된 마우스에서는 감소되지 않았다.

BCG를 접종한 후 12주부터 3주 간격으로 Rv2005c/PML-DDA로 3회 면역하고, 마지막 면역 후 4주 뒤에 결핵균을 감염시키고, 16주 후에 마우스를 희생하여 폐에서 박테리아 부담을 측정한 결과 BCG 단독에 비해 Rv2005c로 부스팅 한 경우 균 증식을 유의하게 감소키지 못하였다. 이는 Rv2005c단독으로는 BCG 부스팅 효과가 없음을 시사한다.

2.6 Rv2005c의 화학요법 후의 보조 면역 치료 효능 평가

결핵 감염 모델에서 화학요법 후, Rv2005c의 보조 면역 치료 효능을 조사하였다. 도 5A는 결핵 감염 모델에서 화학요법 후, Rv2005c의 보조 면역 치료 효능 평가의 시간표를 도시한 것이다. 마우스를 Mtb (1 x 10⁶ CFU/마우스)로 감염시키고, 감염 후 3 주 후, 마우스를 4 주 동안 이소니아지드(isoniazid, INH) 및 리팜핀( rifampicin, RIF)으로 처리하여 화학요법을 수행하였다. 화학요법 동안 또는 화학요법 후에 Rv2005c/MPL-DDA로 3 회 면역시키고, 화학요법 및 Rv2005c 면역 치료에 따른 폐 내의 박테리아 부담을 측정하였다. 도 5B에서 보는 바와 같이, 화학요법 및 Rv2005c 면역 치료를 하지 않은 마우스 폐(Infection)의 박테리아 수는 감염 후 16 주까지 약간 감소 된 상태로 유지되었지만, 화학 요법(Chemotherapy)을 수행한 경우, 화학 요법의 종료 시간인 감염 후 7 주에 폐에서 검출 할 수없는 박테리아 수를 초래 하였다 (도 5B). 그러나, 화학 요법 종료 후 어주번트(chemotherapy+Adjuvant)만을 접종한 경우 9 주째에 폐에서 박테리아가 빠르게 재성장하였고, 이는 화학요법이 수행되지 않은 마우스의 폐(Infection)와 유사한 박테리아 수에 도달하였다. 뿐만 아니라 Rv2005c-면역화된 마우스(Chemotherapy+ Rv2005c/adjuvant)에서도 같은 패턴을 보여, Rv2005c-면역화가 화학요법 후 박테리아 재성장을 억제하지 못하는 것을 나타내었다 (도 5B).

< 실시예 3. Rv2882c 의 면역 요법 효과>

본 발명자들은 선행연구에서 Rv2882c 단백질을 유효성분으로 포함하는 대식세포의 활성화 조성물을 개시한 바 있다 (한국 등록특허 제1893947호). Rv2882c는 결핵균(M.tuberculosis)유래의 단백질로, 대식세포 활성을 유도하고 대식세포 내에서 전염증성 사이토카인을 자극하였으며, BCG 부스터 모델에서 결핵균으로 첼린지후 6주에는 Rv2882c는 일정한 BCG 부스팅 효과를 나타낸다.

이에 본 발명에서는 장기간의 BCG 부팅 유지 효과를 측정하였다. 도 6은 BCG 부스터 모델에서 BCG 백신 후 Rv2882c의 보조 면역 부스팅 효과를 나타내는 결과이다. BCG 백신화 후, 12, 15, 18 주에 Rv2882c를 이용하여 부스팅하고 4 주 후에 Mtb를 감염시켰다 (도 6A). 도 6B에서 보는 바와 같이, 결핵균으로 첼린지 후 16주 후에는 감염군에 비해 BCG 단독 접종군에서 폐의 박테리아 부담이 유의하게 감소하였다. BCG 백신 후 Rv2882c로 부스팅 시킨 쥐에서도 감염군에 비해 유의하게 박테리아 부담이 경감되었고, BCG 단독보다는 균 부담이 낮았지만 통계학적으로 유의성이 없었다. 이는 장기간의 Rv2882c 자체의 BCG 부스팅 효과는 현저하지 않음을 의미한다 (도 6B).

< 실시예 4. Rv2882c - Rv2005c 융합 단백질의 면역 치료 효과>

4.1 Rv2882c - Rv2005c 융합 단백질의 식별 및 준비

실시예 2에서 본 바와 같이 Rv2005c 단독은 마우스 모델에서 백신 효능을 유도할 수 없었다. 이 단백질은 휴면 및 재활성화 동안 발현되는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 Rv2005c에 기초한 치료 백신을 구축하기 위해, 일정의 BCG 부스팅 효과를 갖는 대식세포 활성화 단백질 Rv2882c에 Rv2005c를 융합시켜 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 제작하고 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 면역 조성물의 화학요법 후 면역 치료 효과를 확인하였다. 재조합 태그가 부착된 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 대장균 초음파 추출물로부터 정제하였다. 도 7 및 8은 재조합 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 1) 및 이를 암호화하는 DNA의 염기서열 (서열번호 2)을 나타낸 것이다. 정제된 융합 단백질은 SDS-PAGE에서 50 kDa에서 주요 단일 밴드를 나타냈다 (도 9A).

4.2 Rv2882c - Rv2005c 융합 단백질-성숙 DC로 활성화된 T 세포에 의한 세포 내 Mtb 성장 억제 효과

본 발명자들은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질이 DC를 활성화시킬 수 있는지 확인하였다. Rv2882c-Rv2005c는 BMDC를 자극하여 미처리 BMDC와 비교하여 유의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-12p70을 생성하였다 (도 9B). 0.5 ㎍/ml의 농도에서, Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질은 LPS (100 ng/ml)와 비슷한 활성을 나타냈다. 또한 IFN-γ, IL-2 및 IL-17A는 미처리 DC 또는 LPS-처리 DC에서보다 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질-성숙 DC에 의해 활성화된 T 세포에서 현저하게 생성되었다 (도 9C).

또한, Rv2882c-Rv2005c-성숙된 DC에 의해 활성화된 T 세포가 Mtb 성장의 억제에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. 도 9D에 도시된 바와 같이, Rv2882c-Rv2005c-성숙 DC에 의해 활성화된 T 세포는 감염 대조군(Infection CON) 또는 처리되지 않은 DC(untreated DC-T cells)에 의해 활성화된 T 세포와 비교하여 대식세포에서 Mtb 성장을 유의하게 억제하였다. 또한 Normoxia 상태와 비교하여 CoCl₂로 저산소 유도된 경우, Rv2882c-Rv2005c-성숙된 DC에 의해 활성화된 T 세포가 대식세포(BMDM) 내의 박테리아 수를 감소시킴으로써 항미코박테리아 활성을 향상시키는 것을 확인하였다. 한편 선행실험에서 CoCl₂는 300 μM까지 세포독성을 나타내지 않았다.

4.3 Rv2882c - Rv2005c 융합 단백질의 결핵 감염 모델에서 화학요법 및 Rv2882c - Rv2005c의 보조 면역 치료 효과

본 발명자들은 Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 면역 조성물의 화학요법 후 면역 치료 효과를 확인하였다. 도 10A에서 보는 바와 같이, 마우스를 Mtb (1 x 10⁴ CFU/마우스)로 감염시키고, INH 및 RIF로 처리한 후, 실시예 1에서 제작된 재조합 Rv2882c-Rv2005c를 MPL-DDA 어주번트와 함께, 또는 어주번트만으로 3회 면역하고 폐의 박테리아 부담을 측정하였다. Mtb 감염 후, 3 주 후부터 7 주까지 INH 및 RIF로 화학 요법을 시행하였으며, 화학 요법 시행 중 및 후에 걸쳐 4, 7, 10 주에 Rv2882c-Rv2005c/MPL-DDA 또는 MPL-DDA로 3회 면역 치료를 실시하였다. 폐 내의 박테리아 부담 및 사이토카인 분석은 Mtb 감염 후 3, 6, 9, 12, 20주에 마우스 일부를 희생시켜 측정하였다.

도 10B에서 보는 바와 같이, Mtb 감염 후, 폐 내의 박테리아 부담은 증가하였고 20주가 될 때까지 조금 감소하는 경향을 보였으며, 화학 요법을 시행하는 경우, 화학 요법 기간에는 박테리아가 검출되지 않는 수준으로 감소하였다가(6, 9주), 화학 요법을 중지시킨 후에는 화학요법을 시행하지 않은 대조군(Infection) 수준으로 박테리아 부담이 증가하였다. 이러한 경우, 결핵은 INH 및 RIF에 내성을 나타내는 다제내성 결핵으로 또는 잠복결핵이 재활성화된 것으로 간주된다. 그러나 화학요법 시행 1 주 후부터 시작한 본 발명의 Rv2882c-Rv2005c을 포함하는 면역 치료를 수행한 경우, 폐 내의 박테리아 부담은 어주번트만을 주입한 경우에 비해 현격히 감소하였다 (도 10C). 즉, 감염 후 12 주 및 20 주에 MPL 단독 면역 마우스에서 박테리아가 빠르게 재성장 하였지만, Rv2882c-Rv2005c 면역 마우스에서는 박테리아 성장이 유의하게 억제되었으며, 이러한 발견은 Rv2882c-Rv2005c 면역 요법이 화학 요법의 보조제로서 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 재활성화도 유의하게 억제할 수 있음을 시사한다.

감염 후 6, 9, 12 및 20 주에 Rv2882c-Rv2005c로 재자극된 폐 세포의 배양 상청액에서 사이토카인을 측정한 결과, 도 10C에서 보는 바와 같이, IFN-γ, IL-2 및 IL-17의 생성은 Rv2882c-Rv2005c 면역화된 마우스에서 유의하게 더 높았으며, 감염 후 12 주째에 최종 면역화 2 주 후인 피크에 도달하였다.

4.3 Rv2882c - Rv2005c 융합 단백질의 결핵 감염 모델에서 다기능 T 세포의 발현 효과

도 11은 상기 결핵 감염 모델에서 화학요법 및 Rv2882c-Rv2005c의 보조 면역 치료 시간표에 따라 6, 9, 12, 20 주에서 수득한 T 세포를 Rv2882c-Rv2005c로 시험 관내 자극 후, 사이토카인 분비 T 세포의 빈도를 평가한 결과이다. (A,B) 6, 9, 12, 20 주의 요법 및 면역치료 과정 동안 약물 또는 약물 및 Rv2882c-Rv2005c 군에서 활성화된 CD4⁺CD44⁺CD62^- T세포의 사이토카인 생산 및 다기능성 CD4⁺CD44⁺ T세포의 백분율 변화를 그래프로 나타낸 것이다.

항원-특이적 IFN-γ⁺IL-2⁺ T 세포는 어주번트(G3) 또는 Rv2882c-Rv2005c(G4)로 제 1 면역화된 마우스에서 백신화 2 주 후(감염 후 6 주)에 감염그룹(G1) 및 화학 요법만 수행한 그룹(G2)에 비하여 현저히 증가하였다 (도 11A). 화학 요법 시행이 종료된 감염 후 9 주, 즉 Mtb가 아직 재성장하지 않았을 때에는 항원-특이적 IFN-γ⁺ T 세포가 확장되었으며, 12 주 및 20 주에는, IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺TNF-α⁺ 또는 TNF-α⁺IL-2⁺를 포함하는 다기능성 T 세포가 Rv2882c-Rv2005c 면역화된 마우스에서 유의하게 증가하였고 감염 후 12 주에 가장 높은 수준으로 나타났다 (도 11B). IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-2⁺ T 세포는 감염 12 주 후 Rv2882c-Rv2005c 면역화된 마우스에서 다 기능성 T 세포 중에서 가장 높았으며 (도 11B), IFN-γ⁺TNF-α⁺ T 세포는 감염 후 20 주까지 지속되었다. 즉, 화학 요법 시행 후, 본 발명의 Rv2882c-Rv2005c를 보조 면역 치료제로 사용한 경우, 다기능성 T 세포가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

여러 TB 백신이 임상 시험에 참여하고 있지만 Ag85 또는 ESAT-6과 같은 소수의 항원만 적용되어 왔다. 특히 Mtb의 휴면 또는 재활성 동안 상향 조절되는 항원을 활용함으로써 Mtb 의 각 일정 단계에 대하여 좋은 백신을 제조할 수 있다. 그러나, 휴면 또는 재활성 동안 상향 조절되는 Rv2005c 항원은 저산소 미세 환경인 육아종에 위치한 Mtb에서 발현되어 면역 치료제 개발에 유용할 것으로 추측되었다. 그러나 실제로 Rv2005c 항원은 마우스 모델에서 백신 효능, BCG-프라임 부스팅 효과 및 치료 효능을 나타내지 않아 이를 이용한 백신 개발에 어려움이 있었다. 본 발명은 Rv2005c를 강력한 대식세포 활성화 및 BCG 부스팅 효능을 유도하는 Rv2882c와 융합하여 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질로 제작하여 INH 및 RIF에도 재양성되는 Mtb에 대하여 면역 치료 효과를 높일 수 있는 면역 치료제에 이용함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

<110> Chungnam National University Foundation of Research and Business <120> Composition for Tuberculosis immunotherapy comprising Rv2882c-Rv2005c fusion protein <130> DPC-20-0038 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tuberculosis Rv2882c-Rv2550c fusion protein <400> 1 Met Ile Asp Glu Ala Leu Phe Asp Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala 1 5 10 15 Val Ala Val Ala Arg Asp Asp Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Arg Ala 20 25 30 Asn Pro Gly Met Phe Ser Arg Ile Thr Ile Asp Tyr Tyr Gly Ala Ala 35 40 45 Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ala Ser Ile Asn Val Pro Glu Ala Arg Leu 50 55 60 Val Val Ile Lys Pro Tyr Glu Ala Asn Gln Leu Arg Ala Ile Glu Thr 65 70 75 80 Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Ile Arg Val Ala Val Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Glu 100 105 110 Leu Val Lys Gln Ala Lys His Lys Gly Glu Glu Ala Lys Val Ser Val 115 120 125 Arg Asn Ile Arg Arg Lys Ala Met Glu Glu Leu His Arg Ile Arg Lys 130 135 140 Glu Gly Glu Ala Gly Glu Asp Glu Val Gly Arg Ala Glu Lys Asp Leu 145 150 155 160 Asp Lys Thr Thr His Gln Tyr Val Thr Gln Ile Asp Glu Leu Val Lys 165 170 175 His Lys Glu Gly Glu Leu Leu Glu Val Lys Leu Met Ser Lys Pro Arg 180 185 190 Lys Gln His Gly Val Val Val Gly Val Asp Gly Ser Leu Glu Ser Asp 195 200 205 Ala Ala Ala Cys Trp Gly Ala Thr Asp Ala Ala Met Arg Asn Ile Pro 210 215 220 Leu Thr Val Val His Val Val Asn Ala Asp Val Ala Thr Trp Pro Pro 225 230 235 240 Met Pro Tyr Pro Glu Thr Trp Gly Val Trp Gln Glu Asp Glu Gly Arg 245 250 255 Gln Ile Val Ala Asn Ala Val Lys Leu Ala Lys Glu Ala Val Gly Ala 260 265 270 Asp Arg Lys Leu Ser Val Lys Ser Glu Leu Val Phe Ser Thr Pro Val 275 280 285 Pro Thr Met Val Glu Ile Ser Asn Glu Ala Glu Met Val Val Leu Gly 290 295 300 Ser Ser Gly Arg Gly Ala Leu Ala Arg Gly Leu Leu Gly Ser Val Ser 305 310 315 320 Ser Ser Leu Val Arg Arg Ala Gly Cys Pro Val Ala Val Ile His Ser 325 330 335 Asp Asp Ala Val Ile Pro Asp Pro Gln His Ala Pro Val Leu Val Gly 340 345 350 Ile Asp Gly Ser Pro Val Ser Glu Leu Ala Thr Ala Val Ala Phe Asp 355 360 365 Glu Ala Ser Arg Arg Gly Val Glu Leu Ile Ala Val His Ala Trp Ser 370 375 380 Asp Val Glu Val Val Glu Leu Pro Gly Leu Asp Phe Ser Ala Val Gln 385 390 395 400 Gln Glu Ala Glu Leu Ser Leu Ala Glu Arg Leu Ala Gly Trp Gln Glu 405 410 415 Arg Tyr Pro Asp Val Pro Val Ser Arg Val Val Val Cys Asp Arg Pro 420 425 430 Ala Arg Lys Leu Val Gln Lys Ser Ala Ser Ala Gln Leu Val Val Val 435 440 445 Gly Ser His Gly Arg Gly Gly Leu Thr Gly Met Leu Leu Gly Ser Val 450 455 460 Ser Asn Ala Val Leu His Ala Ala Arg Val Pro Val Ile Val Ala Arg 465 470 475 480 Gln Ser Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 485 490 <210> 2 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA coding for Tuberculosis Rv2882c-Rv2550c fusion protein <400> 2 atgattgatg aggctctctt cgacgccgaa gagaaaatgg agaaggctgt ggcggtggca 60 cgtgacgacc tgtcaactat ccgtaccggc cgcgccaacc ctggcatgtt ctctcggatc 120 accatcgact actacggtgc ggccaccccg atcacgcaac tggccagcat caatgtcccc 180 gaggcgcggc tagtcgtgat aaagccgtat gaagccaatc agttgcgcgc tatcgagact 240 gcaattcgca actccgacct tggagtgaat cccaccaacg acggcgccct tattcgcgtg 300 gccgtaccgc agctcaccga agaacgtcgg cgagagctgg tcaaacaggc aaagcataag 360 ggggaggagg ccaaggtttc ggtgcgtaat atccgtcgca aagcgatgga ggaactccat 420 cgcatccgta aggaaggcga ggccggcgag gatgaggtcg gtcgcgcaga aaaggatctc 480 gacaagacca cgcaccaata cgtcacccaa attgatgagc tggttaaaca caaagaaggc 540 gagctgctgg aggtcaagct tatgtctaaa ccccgcaagc agcacggagt tgtcgtcggg 600 gtagatggtt cgctcgaatc ggatgccgcc gcctgttggg gtgccaccga tgcggcgatg 660 aggaacattc cgctgaccgt ggtccacgtg gtgaacgccg atgtagcgac gtggccgccg 720 atgccgtatc cggagacctg gggggtttgg caggaggacg agggtcgcca gatcgtcgcc 780 aacgccgtca agctcgccaa agaggcggtt ggagcggatc gaaagctcag cgtaaagagc 840 gagctcgtat tttccacgcc ggtacctacc atggttgaaa tctccaacga ggcagagatg 900 gtggtgttgg gcagctcggg ccggggagcg ctggcccgag gcttgctcgg ttcggtcagc 960 tcgagcctgg tgcgacgcgc cgggtgcccg gtcgcggtca tccacagcga tgatgcggtg 1020 atccctgatc cgcagcacgc tcccgtgctg gtgggaatcg acggttcgcc ggtttcggag 1080 cttgcgacgg cggtggcatt tgacgaggcg tcgcgccgcg gcgtcgaact gatcgccgtg 1140 cacgcgtgga gtgacgtcga agtggtggaa cttccgggtt tggacttctc ggctgtacag 1200 caggaagcgg agcttagtct cgccgaacgc ttggcaggtt ggcaagaacg ctatcccgat 1260 gtgccggtga gccgggttgt cgtttgcgat cgcccggcgc ggaagctggt gcaaaagtcg 1320 gcgtccgccc agcttgtcgt cgttggcagt catggccgag gtggcttgac cggcatgctt 1380 ctggggtcgg tcagtaacgc ggtcttacac gccgcgcggg tgccagtgat cgtggcacgg 1440 cagtcggcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact ga 1482

Claims (11)

1. Rv2882c-Rv2005c 융합단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질의 Rv2882c 및 Rv2005c는 각각 결핵균(M. tuberculosis) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 Rv2882c-Rv2005c 융합단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 결핵 면역 치료용 조성물은 결핵 감염 후 화학 요법의 보조 면역 치료로 사용되는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 화학 요법은 이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 에탐부톨(Ethambutol), 피라진아미드(Pyrazinamide), 리파부틴(Rifabutin), 카나마이신(Kanamycin), 아미카신(Amikacin), 카프레오마이신(Capreomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 레보플록사진(Levofloxacin), 목시플록사진(Moxifloxacin), 프로치온아미드(Prothionamide), 시클로세린(Cycloserine), 파스(p-aminosalicyclic acid), 리네졸리드(Linezolid), 델라마니드(Delamanid), 베다퀼린(Bedaquiline), 클로파지민(Clofazimine), 이미페넴(Imipenem/cilastatin), 메로페넴(Meropenem) 및 아목시실린(Amoxicillin/clavulanate)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 약제를 적용하는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 결핵 면역 치료용 조성물은 이소니아지드(Isoniazid) 및 리팜핀(Rifampin)에 저항성이 있는 다제내성 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 면역 치료용 조성물은 잠재성 또는 휴면성 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 면역 치료용 조성물은 IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺IL-2⁺, IFN-γ⁺TNF-α⁺ 또는 TNF-α⁺IL-2⁺를 포함하는 다기능성 T 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 결핵 면역 치료용 조성물.
10. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 결핵 면역 치료용 재조합 폴리펩타이드.
11. 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 결핵 면역 치료용 폴리뉴클레오타이드.

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