KR101893947B1 - Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 - Google Patents
Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101893947B1 KR101893947B1 KR1020160070510A KR20160070510A KR101893947B1 KR 101893947 B1 KR101893947 B1 KR 101893947B1 KR 1020160070510 A KR1020160070510 A KR 1020160070510A KR 20160070510 A KR20160070510 A KR 20160070510A KR 101893947 B1 KR101893947 B1 KR 101893947B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rv2882c
- protein
- macrophages
- cells
- bmdm
- Prior art date
Links
- 101100092304 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) frr gene Proteins 0.000 title claims abstract description 146
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 21
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims description 17
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims description 17
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 claims description 15
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims description 12
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 7
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 7
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 9
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 29
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 29
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 29
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 19
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 18
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 17
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 17
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 16
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 15
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 13
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 11
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 10
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 10
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 10
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 10
- 101000595548 Homo sapiens TIR domain-containing adapter molecule 1 Proteins 0.000 description 10
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 10
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 10
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 10
- 102100036073 TIR domain-containing adapter molecule 1 Human genes 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 6
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 5
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N (E)-3-tosylacrylonitrile Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)\C=C\C#N)C=C1 DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 IL-12p70 Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101001043272 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25177 / H37Ra) Lipoprotein LpqH Proteins 0.000 description 2
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000023185 monocyte chemotactic protein-1 production Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- ZEXDYVGDZJBRMO-ACZMJKKPSA-N Ala-Asn-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N ZEXDYVGDZJBRMO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- NYDBKUNVSALYPX-NAKRPEOUSA-N Ala-Ile-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NYDBKUNVSALYPX-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N Ala-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N Arg-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- HJDNZFIYILEIKR-OSUNSFLBSA-N Arg-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HJDNZFIYILEIKR-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N Asn-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N Asn-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IDUUACUJKUXKKD-VEVYYDQMSA-N Asn-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IDUUACUJKUXKKD-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GHWWTICYPDKPTE-NGZCFLSTSA-N Asn-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N GHWWTICYPDKPTE-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YDJVIBMKAMQPPP-LAEOZQHASA-N Asp-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O YDJVIBMKAMQPPP-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001433703 Escherichia coli O111:B4 Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- MLZRSFQRBDNJON-GUBZILKMSA-N Gln-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MLZRSFQRBDNJON-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JXBZEDIQFFCHPZ-PEFMBERDSA-N Gln-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N JXBZEDIQFFCHPZ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N Gln-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- FHPXTPQBODWBIY-CIUDSAMLSA-N Glu-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FHPXTPQBODWBIY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N His-Lys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XKIYNCLILDLGRS-QWRGUYRKSA-N His-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 XKIYNCLILDLGRS-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- AQTWDZDISVGCAC-CFMVVWHZSA-N Ile-Asp-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N AQTWDZDISVGCAC-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N Ile-Lys-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N Leu-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VZBXCMCHIHEPBL-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN VZBXCMCHIHEPBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JHDNAOVJJQSMMM-GMOBBJLQSA-N Met-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N JHDNAOVJJQSMMM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- JQHYVIKEFYETEW-IHRRRGAJSA-N Met-Phe-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JQHYVIKEFYETEW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 101100030428 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100030447 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100352994 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298332 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE57 gene Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N Phe-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- FZXSYIPVAFVYBH-KKUMJFAQSA-N Pro-Tyr-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FZXSYIPVAFVYBH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108060007030 Ribulose-phosphate 3-epimerase Proteins 0.000 description 1
- FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N Ser-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- CYVQBKQYQGEELV-NKIYYHGXSA-N Thr-His-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O CYVQBKQYQGEELV-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N Thr-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N Tyr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003926 antimycobacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008237 glutamyl-valyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007110 pathogen host interaction Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4635—Cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 결핵균의 Rv2882c 단백질을 유효성분으로 포함하는 대식세포의 활성화 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 결핵균의 Rv2882c 단백질을 비활성화된 대식세포에 처리하여 대식세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 또한 상기의 대식세포의 활성화 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 대식세포의 활성화 조성물 및 대식세포를 활성화 시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 결핵균(M.tuberculosis)유래의 Rv2882c 단백질을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화 조성물 및 이를 이용하여 비활성화된 대식세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
결핵(Tuberculosis,TB)은 결핵균 및 다른 마이코박테리움(Mycobacterium)종의 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. TB는 매년 약 8백만명의 신규 감염자가 발생되며 2백만명의 목숨을 앗아가는 개발도상국의 주요 질병이며, 또한 선진국에서도 문제점으로 부각되고 있다. 상당한 기간 동안 감염은 무증상일 수 있으나, 결핵은 가장 공통적인 증상으로서 폐의 급성 염증을 나타내며, 그 결과 발열 및 마른 기침(nonproductive cough)을 유발시킨다. 치료하지 않으면, 일반적으로 심각한 합병증 및 사망을 초래한다.
TB는 장기간에 걸친 항생제 요법을 이용하여 치료될 수 있으나, 이러한 치료법이 결핵의 확산을 막기에는 역부족이다. 감염된 개체들은 증상을 나타내지는 아니하나, 일정 기간 보균상태(contagious)일 수 있다. 게다가 치료 섭생을 엄격하게 따르더라도 환자의 행동을 통제하는 것은 어렵다. 일부 환자들은 치료과정을 끝마치지 못하는데, 이는 효험없는 치료와 약제 내성의 발달을 초래할 수 있다. 나아가 이러한 약물 내성 변종의 출현이 TB 제어를 복잡하게 만들었다. 하지만, 사용되고 있는 유일한 백신인 미코박테리움 보비스 바실러스 칼메테-구에린 (BCG)는 유아기의 가장 심각한 형태의 TB은 예외로 하고, 폐TB로 부터 유효하게 예방할 수 없다. 다양한 새로운 TB 백신이 개발 중이나, 잠재적으로 감염된 개인과 성인에게 안전하고 효과적인 백신이 여전히 시급히 필요하다. 따라서, 결핵균(Mtb)에 대한 면역력을 유도할 수 있는 다양한 미코박테리아 항원의 확인과 정의는 병원체 숙주 상호작용을 좀 더 잘 이해할 수 있게 하며 효과적인 백신 개발을 용이하게 할 수 있다.
대식세포는 미코박테리아에 대한 첫 번째의 방어선이다. 대식세포는 선천 면역과 적응 면역을 연결시키는데 중요하고 Mtb가 생존하는 세포이기도 하다. 미코박테리아 감염 후, 대식세포는 Mtb를 인식하여 탐식한다. 이러한 반응은 세균의 세포내 성장을 제어하기 위한 수용성 항균성 및 선천성 면역 매개체 분비와 같은 복잡한 과정을 개시한다. 특히, Mtb 혹은 그 성분에 의해 활성화된 대식세포는 케모카인과 사이토카인, 가장 중요한 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터류킨-1 패밀리 (IL-1β, IL-18)와 IL-12의 사이토카인을 분비하여 림프구 활성화와 보충을 촉진하고 궁극적으로 육아종 형성을 유도한다. 미코박테리아나 미코박테리아 단백질은 주로 면역 세포에서 발현되는 톨-유사 수용체(TLR)에 의해 인식된다. TLR와 특정 미코박테리아 성분의 상호작용 후, 어댑터 분자 골수 분화 일차 반응 단백질 88 (MyD88)이 중요한 역할을 하는 신호전달 경로가 촉발된다. 또한, 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK)와 NF-κB는 TLR 신호 전달 캐스케이드에 의해 활성화된다. 이러한 TLR2 또는 TLR4 매개 캐드케이드를 통해 다양한 미코박테리아 단백질이 대식세포 또는 수지상 세포의 활성화를 유도하는 것으로 보고되어 있다. 수지상 세포는 T 세포 반응을 개시하는데 필요한 주요 세포로 널리 인정되고 대식세포는 면역반응의 작용 단계에 중요하다. 대식세포를 활성화하여 전염증성 사이토카인을 분비하는 몇몇의 미코박테리아 단백질이 규명되어 있지만, 이러한 미코박테리아 단백질의 TB에 대한 숙주 방어기전에서 이러한 단백질의 방어작용에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
이번 연구에서 우리는 다차원 분획을 통해 Mtb 배양여과액 단백질(CFP)로부터 신규한 대식세포-활성화 미코박테리아 단백질을 확인하였고 그의 면역반응성을 조사하였다. 이에, 새롭게 확인된 Rv2882c 단백질이 대식세포를 활성화하여 전염증성 사이토카인을 분비하도록 하고 CD80 및 CD86 동시 자극 분자와 MHC 클래스 I/II 분자를 TLR4, MyD88 와 TRIF를 통해 발현시킴을 알아냈다. Rv2882c-활성화 대식세포는 효과/기억 T 세포군의 유의한 확산을 유도하였다. 더욱이, 마우스 모델에서 Rv2882c는 BCG 프라임-부스트 백신접종에서 예방효과를 나타내었다.
결핵균의 경우 병원성 인자들을 분비함으로써 대식세포의 활성화를 방해하는 것으로 알려져 있다. 이는 결핵에 대한 효율적인 치료를 방해하는 문제점이 되어 왔다.
이에 본 발명은 대식세포의 활성화를 유도하는 신규한 미코박테리아 단백질을 사용하여, 기존 약제와 작용기전이 다르고 부작용이 상대적으로 적은 결핵 예방 및 효율적인 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Rv2882c 단백질을 유효성분으로 포함하는 대식세포의 활성화 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 Rv2882c 단백질이 결핵균(M.tuberculosis)유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 대식세포의 활성화 조성물을 제공한다.
상기 Rv2882c 단백질은 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml 양으로 포함되는 것이 바람직하다.
또한 대식세포에 Rv2882c를 처리하여 활성화시키는, 대식세포 활성화 유도 방법을 제공한다.
상기 방법은 Rv2882c 처리 후 세포를 12시간 이상 36시간 이하로 배양하는 것이 바람직하며 상기 Rv2882c 단백질은 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml 양으로 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 Rv2882c 단백질은 대식세포를 활성화시키는 과정 동안 TNF-α, IL-6, IL-12 및 MCP-1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 대식세포의 활성화 유도 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서 상기 대식세포의 활성화는 Rv2882c가 TLR(toll-like receptor)-4를 자극하거나 또는 미토겐-활성화 단백질키나제(MAPK) 및 NF-κB 을 자극하여 일어나는 것을 특징으로 한다.
상기 방법에 의하여 제조된 대식세포는 CD(Cluster of Differentiation)80, CD86, MHC(Major Histocompatibility Complex)-클래스 I, II에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 대식세포의 활성화 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하고자 한다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 종래 전혀 알려져 있지 않던 재조합 Rv2882c를 활용하여 대식세포를 활성화시킴으로써 신체의 면역 반응을 효과적으로 활성화 시킬 수 있다.
도 1A는 재조합 Rv2882c 단백질의 제조 과정에 대한 개략도이며 도 1B는 CFP의 황산 암모늄 침전물을 페닐세파로오스를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 분획한 사진이다.
도 1C는 정제된 재조합 단백질 Rv2882c에 마우스 항-His 항체를 사용하여 (a)SDS-PAGE 및 (b)웨스턴 블롯 분석을 수행한 사진이다.
도 1D는 BMDM 상에서 Rv2882c의 세포독성 효과를 유동세포분석법으로 분석한 사진이다.
도 2A,2B는 재조합 Rv2882c가 대식세포 활성을 유도하고 대식세포 내에서 전염증성 사이토카인을 자극하였는지를 확인하기 위하여, 1, 5 또는 10 ㎍/mL에서 Rv2882c로 24시간 처리된 BMDM의 배양 상청액에서의 사이토카인 수준을 측정한 사진이다.
도 2C는 BMDM을 제조하여 유동세포분석법을 사용하여 표면 마커의 발현을 분석한 그래프이다.
도 3A,B는 WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상 CD80 또는 CD86 수준을 보여주는 막대그래프이다.
도 3C,D는 WT, MyD88-/- 및 TRIF-/- 마우스 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상의 CD80 또는 CD86 발현 수준을 보여주는 막대그래프이다.
도 3E는 WT, TLR2-/- 또는 TLR4-/- 마우스 유래 BMDM에 Rv2882c-처리하여 TLR4와 Rv2882c가 결합함을 증명한 그림이다.
도 3F는 항-His 항체로 면역침강(IP)과 항-TLR2 또는 -TLR4 항체로 면역 블롯팅을 나타낸 사진이다.
도 4A는 Rv2882c 10 ㎍/mL Rv2882c 로 처리된 BMDM에서 시간에 따른 단백질 발현. 세포 용해물에 대한 반응성을 phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2), ERK1/2, phospho-IκB-α (p-IκB-α), IκB-α, phospho-JNK (p-JNK) 및 JNK에 특이한 항체를 사용하여 SDS-PAGE 와 면역 블롯팅으로 분석한 사진이다.
도 4B는 BMDM을 10 ㎍/mL Rv2882c로 24시간 동안 처리하기 전에 p38 (SB203580, 20 μM), ERK1/2 (U0126, 10 μM) 및 NF-κB (Bay11-7082, 5 μM)의 약학적 억제제나 DMSO (운반체 대조군)으로 1시간 동안 처리하여 대식세포의 활성화 정도의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 4C는 배양 배지에서 TNF-α, IL-6 및 MCP-1의 양을 ELISA로 측정한 그래프이다.
도 5A는 세포의 재료 및 제조방법을 나타낸 사진이다.
도 5B,C는 처녀 CD4+ T 세포 (CD4+CD44-CD62L+) 및 효과/기억 CD4+ T 세포(CD4+CD44+CD62L-) 의 수를 유동 세포 계측법으로 측정한 그래프이다.
도 5D,E는 IFN- γ 및 IL-2의 수준을 ELISA에 의해 결정한 그래프이다.
도 6A는 BCG예방 접종에 대 한 일정, Rv2882c 부스팅 및 Mtb 챌린지
도 6B는 각 그룹의 폐와 비장 내 세균 하중을 감염 전용 그룹과 대비하여 평균 (±SEM) log10 CFU/기관 (n = 5)값을 나타낸 그래프이다.
도 6C는 비장 및 폐 세포를 각 그룹의 마우스로부터 수확하고, 사이토카인 수준을 ELISA로 분석한 그래프이다.
도 1C는 정제된 재조합 단백질 Rv2882c에 마우스 항-His 항체를 사용하여 (a)SDS-PAGE 및 (b)웨스턴 블롯 분석을 수행한 사진이다.
도 1D는 BMDM 상에서 Rv2882c의 세포독성 효과를 유동세포분석법으로 분석한 사진이다.
도 2A,2B는 재조합 Rv2882c가 대식세포 활성을 유도하고 대식세포 내에서 전염증성 사이토카인을 자극하였는지를 확인하기 위하여, 1, 5 또는 10 ㎍/mL에서 Rv2882c로 24시간 처리된 BMDM의 배양 상청액에서의 사이토카인 수준을 측정한 사진이다.
도 2C는 BMDM을 제조하여 유동세포분석법을 사용하여 표면 마커의 발현을 분석한 그래프이다.
도 3A,B는 WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상 CD80 또는 CD86 수준을 보여주는 막대그래프이다.
도 3C,D는 WT, MyD88-/- 및 TRIF-/- 마우스 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상의 CD80 또는 CD86 발현 수준을 보여주는 막대그래프이다.
도 3E는 WT, TLR2-/- 또는 TLR4-/- 마우스 유래 BMDM에 Rv2882c-처리하여 TLR4와 Rv2882c가 결합함을 증명한 그림이다.
도 3F는 항-His 항체로 면역침강(IP)과 항-TLR2 또는 -TLR4 항체로 면역 블롯팅을 나타낸 사진이다.
도 4A는 Rv2882c 10 ㎍/mL Rv2882c 로 처리된 BMDM에서 시간에 따른 단백질 발현. 세포 용해물에 대한 반응성을 phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2), ERK1/2, phospho-IκB-α (p-IκB-α), IκB-α, phospho-JNK (p-JNK) 및 JNK에 특이한 항체를 사용하여 SDS-PAGE 와 면역 블롯팅으로 분석한 사진이다.
도 4B는 BMDM을 10 ㎍/mL Rv2882c로 24시간 동안 처리하기 전에 p38 (SB203580, 20 μM), ERK1/2 (U0126, 10 μM) 및 NF-κB (Bay11-7082, 5 μM)의 약학적 억제제나 DMSO (운반체 대조군)으로 1시간 동안 처리하여 대식세포의 활성화 정도의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 4C는 배양 배지에서 TNF-α, IL-6 및 MCP-1의 양을 ELISA로 측정한 그래프이다.
도 5A는 세포의 재료 및 제조방법을 나타낸 사진이다.
도 5B,C는 처녀 CD4+ T 세포 (CD4+CD44-CD62L+) 및 효과/기억 CD4+ T 세포(CD4+CD44+CD62L-) 의 수를 유동 세포 계측법으로 측정한 그래프이다.
도 5D,E는 IFN- γ 및 IL-2의 수준을 ELISA에 의해 결정한 그래프이다.
도 6A는 BCG예방 접종에 대 한 일정, Rv2882c 부스팅 및 Mtb 챌린지
도 6B는 각 그룹의 폐와 비장 내 세균 하중을 감염 전용 그룹과 대비하여 평균 (±SEM) log10 CFU/기관 (n = 5)값을 나타낸 그래프이다.
도 6C는 비장 및 폐 세포를 각 그룹의 마우스로부터 수확하고, 사이토카인 수준을 ELISA로 분석한 그래프이다.
현재까지 면역세포에 관한 면역반응에 있어서 결핵균(M.tuberculosis)으로부터 유래된 단백질에 관한 많은 연구가 시행되어 왔지만, Rv2882c에 관한 연구는 알려져 있지 않다.
대식세포는 외래 병원균에 맞서는 첫 번째 세포이고, 따라서 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 특히 활성화된 대식세포는 MHC I형 및 Ⅱ형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+ 및 CD14-을 조절한다. 더 많은 MHC 발현으로 대식세포의 항원밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향조절로, T세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 시그날을 강화한다.
본 발명의 활성화된 대식세포는 재조합 방법으로 제조된 Rv2882c와 접촉시킴으로써 제조할 수 있다. 본 발명은 Rv2882c를 포함하는 조성물을 통해 대식세포를 활성화시킬 수 있다. 유효한 제조합 방법으로 제조된 Rv2882c는 이에 제한되는 것은 아니나 1μg/ml 내지 20μg/ml, 바람직하게는 5μg/ml 내지 10μg/ml 농도로 조성물에 포함될 수 있다.
대식세포의 활성화는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있다. 세포 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 상기 세포들 또한 사이토카인 생성(예 : ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 모니터 할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시 예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
<
실시예
1>
재료 및 방법
1.1 박테리아성 균주, 동물, 감염 및 세포 준비
모든 미코박테리아는 0.5% 글리세롤, 0.5% 트윈-80 (Tween-80) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10% 올레산, 알부민, 덱스트로오스와 카탈라아제 (OADC; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)가 첨가된 7H9 배지에서 성장시켰다. 무병균 C57BL/6 마우스 (암컷, 6주령)을 Charles River Laboratories (Wilmington, MA)로 부터 구입하였고, 5 내지 6주령 C57BL/6J TLR2 녹아웃 (TLR2-/-; B6.129-Tlr2tm1Kir/J) 과 C57BL/10 TLR4 녹아웃 (TLR4-/-; C57BL/10ScNJ) 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. 마우스는 한국 대전에 위치한 충남대학교의 의학연구센터 내 생물재해 동물 룸에서 배리어 조건하에서 유지되었다. 자일라진:졸레틸 (9:1)의 혼합물로 마취 후, 마우스를 마우스 폐 당 106 CFU의 초기 감염 투여량 H37Ra의 현탁액 50-μL으로 기도내 감염시켰다.
BMDM는 둘베코 수정 이글 배지 (DMEM) (Welgene Co., Daegu, Korea)로 C57BL/6 마우스의 대퇴골을 통해 씻겨 내려갔다. 적혈구는 실온에서 3분간 RBC 용해 완충액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 가하여 용해시켰다. 세포를 세척하고 단일 세포 현탁액을 제조 후, 총 세포는 10% 소 태아 혈청, 50 ng/mL 마우스 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 및 1% 항생제 (Welgene)가 포함된 DME에서 현탁시켰다. 그 후 세포를 100-mm 플레이트에 두고 5% CO2, 37°에서 7일 동안 배양시켰다. 배양액은 7일의 배양기간 동안 3일 마다 교체하였다.
폐를 멸균 조건 하에서 분리, 0.5-cm 조각으로 잘라 5 mL 세포분리 완충액 (0.1% 콜라게나제 형 IV (Worthington Biochemical Corporation, NJ, USA), 1 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2을 포함하는 RPMI 배지)에서 37°에서 15분 동안 교반하였다. 그리고, 폐 세포와 응집체를 둘베코 인산 완충 식염수 (PBS)에서 멸균 1-mL 주사기를 사용하여 40-μm 셀 스트레이너를 통해 여과하였다. 비장은 RPMI 배지(Welgene)에서40-μm 셀 스트레이너 위에 으깨졌다. 적혈구는 실온에서 2 분 동안 RBC 용해 완충액을 이용하여 용해시켰다. 고 구배 자기 활성화 세포 분리 (MACS) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany))가 T 세포 서브세트를 분획하기 위해 사용되었다. 세포는 항-마우스 CD4 항체-코팅된 자기 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)로 배양된 후 제조업체의 지침에 따라 상자성 컬럼 (LS columns; Miltenyi Biotec) 위에서 양성적으로 선택되었다.
1.2 항체 및 시약
재조합 M-CSF는 페프로테크 (Rocky Hill, NJ, USA)로 부터 구입하였다. 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC)-아넥신 V/PI 키트는 BD Biosciences (BD Pharmingen, San Jose, CA)로 부터 구입하였다. E. coli O111:B4에서 유래한 LPS는 InvivoGen (San Diego, CA, USA)로 부터 구입하였다. 에도톡신 필터(END-X)와 에도톡신 제거 수지(END-X B15)는 Associates of Cape Cod (East Falmouth, MA, USA)로부터 수득하였다. 항-인산화ERK1/2 모노클로날 항체, 항-ERK1/2 모노클로날 항체, 항-인산화 p38 모노클로날 항체, 항-p38 모노클로날 항체, 항-인산화 JNK 모노클로날 항체, 항-JNK 모노클로날 항체, 항-인산화 IκB-α 모노클로날 항체, anti-IκB-α 모노클로날 항체 및 항-튜뷸린 폴리클로날 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로 부터 얻었다. 항-TLR2, 항-TLR4 및 항-히스티딘 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로 부터 구입하였다. HRP-conjugated 항-마우스 IgG 항체와 HRP-conjugated 항-래빗 항체는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)로 부터 수득하였다. IL-10, IL-12p70, CD80, CD86 및 MHC 클래스 II에 대한 피코에리트린 (PE)-공액 mAb와 F4/80 에 대한 알로피코시아닌-conjugated mAb는 eBioscience (San Diego, CA, USA)로 부터 구입하였다. 마우스 사이토카인 ELISA 키트는 eBioscience로 부터 얻었다.
1.3
Mtb
CFP의 다차원 분획
Mtb H37Rv (ATCC 27294)를 소톤배지에 37°에서 6주 동안 표면배양하고 배양액을 농축(CFP) 하였고 80% 황산암모늄에 침전시킨 후, 전술한 바와 같이 순차적으로 HIC, HAT 및 IEC에 의해 분획하였다. 타겟 단백질 밴드가 연세대 단백질 체학 연구 센터 (연세대학교, 서울, 대한민국)에서 전술된 바와 같이 LC-ESI/MS에 의해 CB 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 확인되었다.
1.4 재조합
Rv2882c의
생성
재조합 Rv2882c 단백질 생성을 위해 Mtb H37Rv (ATCC 27294)부터의 게놈 DNA을 주형으로 이용하고 다음의 프라이머를 이용하여 해당 유전자(frr)를 PCR로 증폭하였다: 정방향, 5′-CATATGATTGATGAGGCTCTCTTCGAC-3′ 그리고 역방향, 5′-AAGCTTGACCTCCAGCAGCTCGCCTTC-3′. 생성된 PCR 생성물을 NdeI 과 HindIII 제한효소를 사용하여 소화시킨 후 pET-22b (+) 벡터 (Novagen, Madison, WI, USA)에 삽입하였다. 재조합 단백질을 전술한 바와 같이 제조하였다 . 정제된 단백질로부터 에도톡신 오염을 제거하기 위해 재조합 단백질을 4°에서 6시간 동안 폴리믹신 B-아가로스 (Sigma Chemical Co.)와 배양하였다. Rv2882c 제제 내 잔류 LPS의 양은 제조사의 지침에 따라 LAL 테스트 키트 (Lonza, Basel, Switzerland) 를 사용하여 평가하였다. 정제된 에도톡신 없는 Rv2882c는 필터 소독되었으며 70°에서 동결되었다. Rv2882c 단백질의 순도는 CB 염색과 항-His 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 평가되었다.
1.5 세포독성분석
Rv2882c (10 μg/mL)를 12-웰 플레이트 (0.5 ×106 cells/mL)에서 배양된 분리된 BMDM에 첨가하여 Rv2882c의 세포 독성 효과를 조사하였다. 처리 12시간 후 수확된 BMDM을 PBS 를 사용하여 세척하고 FITC-아넥신 V 및 PI (BD Biosciences)으로 염색한 후 FACSCanto 유동세포분석법 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
1.6 사이토카인 측정
전술한 바와 같이 샌드위치 ELISA를 사용하여 배양 상청액에서 IL-6, MCP-1, TNF-α, IL-12p70, IL-10, IFN-γ및 IL-2 의 정도를 판단하였다. 이러한 사이토카인 분석은 항체 제조사 (eBioscience)에서 권고된 대로 실시되었다
1.7
유동세포분석법에 의한
세포내
사이토카인 및 표면 분자 발현분석
단일 세포 현탁액을 GolgiPlug (BD Biosciences) 존재 하에 12 시간 동안 LPS (100 ng/mL) 또는 Rv2882c (10 μg/mL)로 자극하거나 무자극인 채로 두었다. 우선 샘플을 10% (vol/vol) 정상 염소 혈청에 15분 동안 차단하고 4°에서 유동세포분석법 완충액(PBS/2% BSA)에서 4°에서 30분 동안 APC-공액 F4/80 항체로 염색하였다. 적당한 이소타입 정합된 면역글로불린으로 염색된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 제조시의 지침에 따라 Cytofix/Cytoperm 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 고정하고 투과시켰다. 세포 내 사이토카인을 투과성 완충 용액에서 형광-공액 항체 (eBiosciences)를 사용하여 검출하였다. 세포 표면 염색은 특이적으로 표지된 형광-공액 m항체를 사용하여 수행하였고 염색 강도는 유동세포분석법 (FACSCanto, BD Biosciences)를 사용하여 판단하였다. 그 후에 데이터를 최근에 기술된 바와 같이 FlowJo 데이터 분석 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
1.8 풀 다운 분석
BMDM (17)를 용해 완충액 (50 mM 트리스 염화수소, pH 8.0; 137 mM 염화수소; 1 mM EDTA; 1% (vol/vol) 트리톤 X-100; 10% (vol/vol) 글리세롤; 1 mM PMSF; 1 μg/mL 아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴 각각; 1 mM Na3VO4; 및 1 mM NaF)으로 용해하였다. 20 마이크로그램의 His-표지된 Rv2882c 단백질 및 세포 용해물을 혼합하여 4°에서 6시간 동안 배양한 후 제조사 지침에 따라 Ni-NTA 아가로스 비드를 첨가하였다 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). 비드를 용해 완충액에 희석된 세포 용해물과 혼합하고 4°에서 2시간 동안 흔들었다. 배양 후 비드와 세포 용해물의 혼합물을 4°에서 1 분 동안 150 g에서 원심 분리한 후, 비드를 완충액으로 3회 세척하고 원심 분리로 회수하였다. 상청액 제거 후, 비드를 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 끓여 결합 단백질을 항-TLR2, 항-TLR4 및 항-His 항체와 면역 블롯팅에 의해 분석하였다.
1.9 면역 blotting 분석
10 μg/mL Rv2882c로 자극 후, BMDM을 100 μL의 용해 완충액에서 용해하였다. 면역 블롯팅을 전술한 바와 같이 수행하였다. MAPK를 포함한 대상 단백질의 에피토프를 특정한 항체를 사용하여 표지하었고, 밴드는 ECL 어드밴스 키트 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 시각화하였다.
1.10
BMDM을
약학적
시그널링
억제체
처리
본 연구에 사용된 모든 약학적 억제제는 Calbiochem로 부터 구입하였다. 디메틸 술폭시드 (Sigma)를 용매 대조군으로 최종 농도 0.1% (vol/vol)로 배양물에 첨가하였다. BMDM는 PBS를 사용하여 세척하였고 Rv2882c로 24시간 동안 처리 전에 글루타민을 함유하는 DMEM 배지에서 1시간 동안 억제제로 전처리되었다. 억제제는 조심스런 적정에 의해 결정된 다음과 같은 농도로 사용된다: U0126 (10 μM), SB203580 (20 μM), SP600125 (10 μM) 및 Bay11-7082 (5 μM). BMDM의 생존율은 MTT 분석을 사용하여 평가하였다.
1.11
BMDM
에서 체외
Mtb
성장 분석
BMDM을 Mtb로 감염 다중도 1:1 (박테리아 대 BMDM)로 4시간 동안 감염하였다. 그리고 감염된 BMDM을 아미카신 (200 μg/mL) 로 2시간 동안 처리 후 PBS로 2번 세척하였다. 감염된 BMDM을 Rv2882c (10 μg/mL) 또는 LPS (100 ng/mL)로 24시간 동안 처리한 후, CD4+ T 세포와 3시간 동안 공동배양하였다. 세균 부담을 판단하기 위해, 대식세포 배양물의 일부를 0.1% 사포닌을 사용하여 즉시 용해하였다. 상청액과 세포 용해물을 순차적으로 희석하고 10% OADC 농축 배지가 포함된 7H10 agar 플레이트 상에 플레이팅하여 웰 당 세균 부담을 판단하였다.
1.12 BCG
부스팅
백신 예방접종
BCG (5 ×105 CFU/0.2 mL/피하 접종) 백신 접종 후, 마우스는 전체 0.2 mL의 부피로 2주 간격으로 2회 등에 피하 투여된 디메틸 디옥타데실암모늄 브롬화물 (DDA; Sigma-Aldrich)로 유화된 10 μg 의 Rv2882c와 25 μg의 monophosphoryl lipid A (MPL; Sigma-Aldrich)로 면역력을 갖게 되었다. 6주 후, 백신 접종된 마우스를 Mtb H37Ra (ATCC 25177)로 감염시켰다. 간단히, 자일라진:졸레틸 (9:1)의 혼합물로 마취 후, 그룹 당 12 마리의 마우스를 마우스 폐 당 H37Ra 106 CFU의 감염 투여량으로 현탁액 50-μL에 기도내 감염시켰다.
1.13 통계 분석
각 실험은 적어도 3회 반복하여 수행하였으며 일관된 결과를 얻었다. 두 그룹 간 차이의 유의성은 독립 표본 학생 t-테스트에 의해 판단되었고, 세 그룹 이상 간 차이는 GraphPad Prism (version 4.03) 통계적 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트에 따른 일방향 ANOVA로 평가되었다. 그래프 내의 데이터는 평균 ±SD로 나타내었다. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<
실시예
2>
Mtb
배양여과액에서
Rv2882c
단백질 확인
2.1 실험방법.
(도 1A 및 B) CFP의 황산 암모늄 침전물을 페닐세파로오스를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 분획하였다. 주요 분획을 나누고 7분획으로 농축하였다. 각각의 주요 분획은 수산화이회석 크로마토그래피 (HAT)로 더 분획되었다. 용출액을 단백질 밴드 패턴에 따라 5 내지 9 분획으로 모으고 농축시켰다. 세 번째 분획은 DEAE 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다. 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. (도 1C) 재조합 Rv2882c은 BL21 세포에서 생성되었고 NTA 레진을 사용하여 정제되었다. 정제된 단백질에 마우스 항-His 항체를 사용하여 (a) SDS-PAGE 및 (b) 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (도 1D) BMDM 상에서 Rv2882c의 세포독성 효과를 유동세포분석법으로 분석하였다. Rv2882c (10 μg/mL)를 6번째 날에 첨가하고 배양물을 24시간 후에 수확하였다. BMDM을 항-F4/80, 아넥신 V 및PI로 염색하였다. 각 사분면에서 양성인 세포 (아넥신 V- 및 PI-염색된 세포)의 퍼센트가 표시되었다. 결과는 세 번의 실험을 나타낸다.
2.2.
실험결과에 대한 분석
.
복잡한 Mtb항원으로 인한 유용한 항원 스크리닝의 한계를 극복하기 위해 Mtb CFP를 다단계 크로마토그래피로 분획하였다. 그림 1A에 도시된 바와 같이, CFP의 80% 황산 암모늄 침전물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 일곱 분획으로 분리하고 수산화이회석 크로마토그래피 (HAT)와 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 로 더 분획하였다. 각 분획의 대식세포로 하여금 전염증성 사이토카인을 분비하도록 자극할 수 있는 능력을 테스트하였다. 초기 분획 3에서 수득된 100 mM HAT 분획의 IEC 분획 번호 37은 IL-12 분비를 강하게 유도하였고 SDS-PAGE 겔 상에서 단일 밴드로 나타났다 (도 1B). 이 주요 밴드는 액체 크로마토그래피 전자분무 이온화 직렬 질량 분광계 (LC-ESI/MS)에 의해 Rv2882c로 확인되었다. 재조합 Rv2882c 단백질은 대장균으로부터 정제되었고 순도는 SDS-PAGE에 의해 확인되었다. 정제된 단백질은 약 23 kDa의 분자질량을 가지고 항-His 항체와 반응하였다 (도 1C). 에도톡신 함량은 생물학적 내독소 시험(LAL)법에 의해 측정되었고 극히 낮은 내톡신 함량 ((<0.05 EU/mL)을 가진 단백질 만이 후속 실험에 사용되었다. Rv2882c에 대한 세포독성이 대식세포 활성화와 사이토카인 분비에 영향을 미치는지를 판단하기 위하여, 24시간 동안 10 μg/mL Rv2882c로 처리된 골수 유래 대식세포 (BMDMs)의 생존율은 아넥신 V and 프로피디움 요오드화물 (PI) 염색으로 평가되었다. 그림 1D에 도시된 바와 같이, Rv2882c는 BMDMs에 유독하지 않았다.
<
실시예
3>
Rv2882c
가
BMDM
활성화를 유도한다는 사실확인.
3.1 실험방법
(도 2A) BMDM가 100 ng/mL LPS 또는 1, 5, or 10 μg/mL Rv2882c로 24시간 동안 자극하여 생성되었다. (도 2A) 배양 상청액 내의 TNF-α, MCP-1, IL-6, IL-10 및 IL-12p70의 양을 ELISA로 측정하였다. 모든 데이터는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. 처리 데이터와 대조군 데이터 간 차이의 유의적 수준 (일방향 ANOVA 테스트로 결정된 *p < 0.05, **p < 0.01 or ***p < 0.001)이 표시되었고, 유의적으로 차이가 없는 처리는 n.s. 로 표시되었다. (도 2B) F4/80+ BMDMs에서 세포내 IL-12p70 및 IL-10 농도의 점도표. 양성 세포의 퍼센트가 각각의 패널에 나타난다. (도 2A)에 기술된 대로 BMDM을 제조하여 유동세포분석법을 사용하여 표면 마커의 발현을 분석하였다(도 2C). 세포는 F4/80+ BMDMs 상에서 게이팅되었다. BMDM는 항-CD80, 항-CD86 및 항-MHC class II 항체로 염색되었다. 양성 세포의 퍼센트가 각각의 패널에 나타난다. 막대 그래프는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. 처리 데이터와 대조군 데이터 간 차이의 유의적 수준 (일방향 ANOVA 테스트로 결정된 *p < 0.05, **p < 0.01 or ***p < 0.001)이 표시되었다.
3. 2
실험결과에 대한 분석
재조합 Rv2882c가 대식세포 활성을 유도하고 대식세포 내에서 전염증성 사이토카인을 자극하였는지를 확인하기 위하여, 1, 5 또는 10 μg/mL에서 Rv2882c로 24시간 처리된 BMDM의 배양 상청액에서의 사이토카인 수준을 측정하였다. LPS를 양성 대조군으로 사용하였다. Rv2882c는 복용 의존적인 방법으로 TNF-α, IL-6, IL-12 및 MCP-1의 생성을 현저히 증가시켰으나 IL-10의 생성은 그렇지 않았다 (도 2A). 반대로, 미처리 세포나 Rv2882c-처리된 세포에 비하여, LPS는 IL-10 생성만을 현저히 유도하였다. IL-12 및 IL-10에 대한 세포내 염색 역시 BMDM에서 Rv2882c는 TNF-α, IL-6, IL-12 및MCP-1의 생성을 현저히 증가시켰으나 IL-10의 생성은 그렇지 않았고 LPS는 IL-10의 현저한 생성만을 자극하였음을 보여주었다 (도 2B). 다음으로 Rv2882c가 대식세포가 항원을 나타내는 세포 및 포식세포로서 기능하는데 중요한 대식세포 표면 분자의 발현을 조절하는지 조사하였다. 유동세포분석법에 따르면 미처리 세포에서의 발현 수준과 비교하였을 때 Rv2882c 가 복용의존적인 방법으로 CD80, CD86 및 MHC 클래스 II 분자의 발현을 현저히 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2C). 이러한 효과는 양성 대조군으로 사용된 LPS의 효과와 비교할만한 것이었다. LPS가 정제된 재조합 단백질에서 제거되었으나, Rv2882c-유도 대식세포 활성화가 LPS 오염에 기여할 수 있는지를 테스트하였다. Rv2882c 단백질의 프로테이나제 K 분해 및 가열 변성 모두 TNF-α, IL-6 및 MCP-1 생성을 막았다 (도 7). 더욱이, 폴리믹신 B와 BMDM의 전배양은 Rv2882c-유도 사이토카인 생성을 억제하지 않았고 LPS의 자극 효과를 감소시켰다 (도 7). 이는 Rv2882c의 생물학적 활성이 LPS 오염의 결과가 아님을 보여준다. 이러한 결과는 Rv2882c가 대식세포 활성화를 효과적으로 유도하고 항원제시세포로서의 기능적인 역할을 촉진함을 제시한다.
<
실시예
4>
Rv2882c는
TLR4
경로를 통하여 대식세포 활성화를 유도한다.
4.1 실험방법
(도 3의 A, B) 막대 그래프는 WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상 CD80 또는 CD86 수준을 보여준다. WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 마우스 유래 BMDM를 Rv2882c (10 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 양성 세포의 퍼센트가 각각의 패널에 나타난다. 막대 그래프는 세 번의 독립적인 실험에서 F4/80+ 세포 상의 표면 분자의 평균값 ±SEM을 보여준다. 상청액을 ELISA로 측정하였다. 모든 데이터는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. ***p < 0.001= Rv2882c-처리 WT BMDM 값과 비교하여, 처리 값의 유의성. (도 3의 C, D) 막대 그래프는 WT, MyD88-/- 및 TRIF-/- 마우스 유래 Rv2882c-처리 F4/80+-게이팅 BMDM 상의 CD80 또는 CD86 발현 수준을 보여준다. MyD88-/- 및 TRIF-/- 마우스 유래 BMDM를 Rv2882c (10 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 양성 세포의 퍼센트가 각각의 패널에 나타난다. 막대 그래프는 세 번의 독립적인 실험에서 F4/80+ 세포 상의 표면 분자의 평균값 ±SEM을 보여준다. 상청액을 ELISA로 측정하였다. 모든 데이터는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. ***p < 0.001= Rv2882c-처리 WT BMDM 값과 비교하여, 처리 값의 유의성. (도 3의 E) WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 마우스 유래 BMDM를 Rv2882c (10 μg/mL)로 1시간 동안 처리하였고 FITC-공액 항-His 모노클로날 항체(mAb)로 염색하였다. T 양성 세포의 퍼센트가 각각의 패널에 나타난다. 막대 그래프는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. ***p < 0.001= Rv2882c-처리 WT BMDM 값고 과 비교하여, Rv2882c-처리 TLR4-/- BMDM 값의 유의성. (도 3의 F) 항-His 항체로 면역침강(IP)과 항-TLR2 또는 -TLR4 항체로 면역 블롯팅 (IB). BMDM을 Rv2882c (10 μg/mL)로 6시간 동안 처리하였다. 세포를 수확하여 세포 용해물을 항-마우스 IgG, 항-His, 항-TLR2, 또는 항-TLR4로 면역침강하는데 사용하였다. 그 후, 단백질을 항-TLR2 또는 항-TLR4 항체로 면역 블롯팅으로 시각화하였다. 보여지는 총합은 평균 세포 용해물(투입)을 나타낸다.
4.2
실험결과에 대한 분석
.
몇몇의 미코박테리아 단백질은 TLR2- 및/또는 TLR4-의존적 신호 전달 경로를 통해 대식세포를 활성화하는 것으로 알려져 있다. Rv2882c-유도 대식세포 활성화가 TLR-의존적인지 확인하기 위하여 C57BL/6J 야생형 (WT), TLR2-/- 및 TLR4-/- 마우스로부터 BMDM을 제조하고 Rv2882c로 24시간 동안 처리하였다. CD80 및 CD86과 같은 표면 분자의 발현과 전염증성 사이토카인의 생성은 TLR4-/- 마우스에서는 Rv2882c-처리 BMDM가 크게 감소하였으나 WT or TLR2-/- 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 3A 및 B). TLR은 MyD88 및 TRIF와 같은 Toll/IL-1 receptor (TIR) domain-containing adaptor를 통해 신호전달 캐스케이드를 개시함으로써 선천성 면역 반응을 촉진하는데 중요하다. MyD88는 모든 TLR에 공통적이나 TRIF는 MyD88-비의존적 신호전달 경로의 TLR4-매개 활성화에 필수적이다. 예상된 대로, WT 마우스와 비교하여, 표면 분자의 Rv2882c-유도 발현과 전염증성 사이토카인의 생성은 MyD88-/- and TRIF-/- 마우스에서 BMDM가 크게 감소하였다. TLR4-/- 마우스에서는 Rv2882c-처리 BMDM가 크게 감소하였으나 WT or TLR2-/- 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 3C 및 D). 다음으로, Alexa488-공액 항-His 다중클론성 항체를 사용하여 Rv2882c가 TLR4를 통하여 대식세포 표면에 결합할 수 있는지 시험하였다. 유동세포분석법은 Rv2882c가 TLR4-/- 대식세포 표면이 아닌 WT 및 TLR2-/- 대식세포 표면에 결합함을 나타냈다 (도 3E). 우리는 항-TLR2 또는 항-TLR4 항체 및 항-His 항체로 면역침전 반응을 수행하여 Rv2882c 와 TLR4의 상호작용을 확인하였다 (도 3F). 이러한 발견으로 Rv2882c가 TLR4를 통해 대식세포 활성화를 유도하여 세포 표면 분자의 발현과 전염증성 사이토카인의 생성을 증가시킴을 알 수 있다.
<
실시예
5>
Rv2882c가
미토겐
-활성화 단백질
키나제
(
MAPK
)와
NF
-
κB
경로를 통해 대식세포 활성을 유도한다.
5.1 실험방법
(도 4A) Rv2882c 10 μg/mL Rv2882c 로 처리된 BMDM에서 시간에 따른 단백질 발현. 세포 용해물에 phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2), ERK1/2, phospho-IκB-α (p-IκB-α), IκB-α, phospho-JNK (p-JNK) 및 JNK에 특이한 항체를 사용하여 SDS-PAGE 와 면역 블롯팅을 수행하였다. -튜블린을 시토졸 분획의 부하 대조군으로 사용하였다. (도 4B) BMDM을 10 μg/mL Rv2882c로 24시간 동안 처리하기 전에 p38 (SB203580, 20 μM), ERK1/2 (U0126, 10 μM) 및 NF-κκB (Bay11-7082, 5 μM)의 약학적 억제제나 DMSO (운반체 대조군)으로 1시간 동안 처리하였다. (도 4C) 배양 배지에서 TNF-α, IL-6 및 MCP-1의 양을 ELISA로 측정하였다. 보여지는 데이터는 평균값 ±SD (n = 3)으로 나타내었다. 세 개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 플롯이 도시된다. ***p < 0.001 = 독립 표본 학생 t-테스트로 측정된 대로, Rv2882c-처리 BMDM 값과 Rv2882c 와 약학적 억제제로 처리된 BMDM 값 간의 유의한 차이를 보여준다.
5.2
실험결과에 대한 분석
MAPK 와 NF-κB는 대식세포 내에서 전염증성 사이토카인의 생성을 포함한 면역 반응을 유도하는 데 중요한 요소이다. 따라서, Rv2882c에 대응한 MAPK 와 NF-κB의 활성화를 조사하였다. BMDM에서 ERK1/2, p38, JNK 및 NF-κB의 인산화 프로파일을 분석하기 위한 면역 블롯팅은 대식세포에서 p38, ERK1/2 및 JNK을 포함하여 MAPK의 인산화를 촉발하였음을 보여준다 (도 4A). 또한, Rv2882c는 IκB-α의 인산화와 분해를 유도하였고 p65의 시토졸로부터 핵으로의 유의한 전위를 유도하였다. 폴리믹신 B 처리는 MAPK 와 NF-κB의 Rv2882c-유도 인산화에 영향을 미치지 않았으나 LPS-유도 인산화를 저해하지 않았다. 다음으로, 대식세포의 Rv2882c-유도 활성화를 위한 MAPK 와 NF-κB 활성의 중요성을 매우 특이한 키나제 억제제를 사용하여 조사하였다. Rv2882c-유도 전염증성 사이토카인 생성은 테스트된 약학적 억제제에 의해 크게 감소하였고 대식세포의 표면에 동시 자극 분자의 발현이 이러한 억제제에 의해 현저히 차단되었다 (도 4B 및 C). 이러한 결과는 MAPK 와 NF-κB 신호전달 경로가 Rv2882c-유도 대식세포 활성화에 필수적이라는 것을 제시한다.
<
실시예
6>
Rv2882c가
효과/기억
T세포군의
확장을 유도한다.
6.1 실험방법
세포는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 제조한다. (도 5A) 세포 내 사이토카인 및 전사 인자를 평가하기 위하여 전략을 게이팅한다. 모든 샘플은 표면 분자를 위해 염색되고 포워드 산란 (FSC) 및 측면 산란 (SSC)에 기초하여 게이팅된다. T세포는 CD4+ T 세포의 표면 발현 패턴에 기초하여 FSC 대 SSC에 의해 림프구 게이트로부터 게이팅된다. CD4+ T 세포를 사용하여, CD62L 및 CD44에 대한 특정 세포 염색은 자극된 비장 세포 또는 폐에 나타난다. BMDM은 24시간 동안 Rv2882c (10 μg/mL) 또는 LPS (100 ng/mL)로 처리하였다. 다음으로, Mtb-감염된 마우스의 폐 (도 5B, D) 또는 비장 (도 5C, E)에서 얻은 배지 또는 CD4+ T 세포를 각각의 웰에 첨가하고 3일간 배양하였다. (도 5B and C) 처녀 CD4+ T 세포 (CD4+CD44-CD62L+) 및 효과/기억 CD4+ T 세포(CD4+CD44+CD62L-) 의 수를 유동 세포 계측법으로 측정하였다. (도 5D 및 E) IFN- γ 및 IL-2의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 제시된 데이터는 일방향 ANOVA에 의해 측정된 ±SD (n = 15) 평균값; *p < 0.05, **p < 0.01 또는 ***p < 0.001 = Rv2882c-처리 및 미처리 또는 Rv2882c-처리 및 Ag85B-처리 세포 간의 상당한 차이를 나타낸다. 유의한 효과가 없는 처리는 n.s.로 표시한다.
6.2.
실험결과에 대한 분석
.
Rv2882c에 의해 활성화된 대식세포가 Mtb-감염 마우스에서 효과/기억 T 세포군을 특별히 유도하는지 평가하기 위하여, 유동세포분석법을 이용하여 CD4+ T 세포 상에서 CD62L 및 CD44의 표면 발현 수준을 분석하였다. 처녀 T세포는 CD62LhighCD44low 표현형을 나타낸다고 알려져 있으며, 효과/기억 T세포는 CD62LlowCD44high 표현형을 나타낸다고 알려져 있다. Mtb H37Ra-감염 WT 마우스 유래 비장 또는 폐 세포 현탁액에서 MACS를 통해 분리되었고 감염 후 4주에 미감염 마우스 유래 Rv2882c-처리 BMDM과 3일 동안 공동배양 되었다. 그림 5A에 도시된 바와 같이, CD4 표지 세포를 게이팅하여 FACS 분석으로 T 세포 표면 상의 분자를 평가하였다. 항원 85B (Ag85B)는 강력한 백신 성분으로서 제어 항원으로 사용되었다. LPS- 또는 Ag85B-처리 대식세포와 비교하여, 마우스의 폐와 비장으로부터 Rv2882c-처리 대식세포가 효과/기억 (CD62Llow/CD44high) T 세포군의 현저한 확산을 유도하였고, 비장과 폐에서 처녀 (CD62Lhigh/CD44low) T 세포군은 Rv2882c-처리 대식세포와 공동 배양물에서 현저하게 감소하였다 (도 5B 및 C). 또한, IFN-γ 및 IL-2 수준에 ELISA를 수행하여 Th1 세포의 효과 및 기억 세포로의 분화와 관련된 사이토카인의 생성을 평가하였다. 효과/기억 T 세포의 반응 패턴과 유사하게, Rv2882c-처리 대식세포와 공동 배양한 폐 및 비장의 T 세포는 LPS- 또는 Ag85-처리 대식세포와 비교하여 현저하게 높은 IFN-γ 및 IL-2 수준을 생성하였다 (도 5D 및 E). 이러한 데이터는 Rv2882c가 효과/기억 T 세포의 확산 및 발달을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
<
실시예
7>
Rv2882c로
BCG를
부스팅하는
것은 백신의 예방 효과를 향상시킨다.
7.1 실험방법.
감염 절차는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 제조한다. 챌린지 후 4주가 경과한 뒤, 동물의 비장과 폐를 수확하고 기관 당 세균 수 (CFU)를 세었다. (도 6A) BCG예방 접종에 대 한 일정, Rv2882c 부스팅 및 Mtb 챌린지. (도 6B) 각 그룹의 폐와 비장 내 세균 하중을 감염 전용 그룹과 대비하여 평균 (±SEM) log10 CFU/기관 (n = 5); *p < 0.05; **p < 0.01; ***P < 0.001로 나타낸다. (도 6C) 비장 및 폐 세포를 각 그룹의 마우스로부터 수확하고, 사이토카인 수준을 ELISA로 분석하였다. 예방 접종된 각 그룹의 폐 및 비장 세포를 3일 동안 Ag85B (10 μg/mL) 또는 Rv2882c (10 μg/mL)로 자극하였다.
7.2
실험결과에 대한 분석
.
Rv2882c가 백신으로 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 우리는 BCG 단독 예방 접종에 비해 Rv2882c와 BCG 부스트에 후속하는 Mtb H37Ra-챌린지에 대한 예방 수준을 조사하였다. Mtb H37Rv 및 H37Ra 균주는 같은 부모 균주에서 유래하지만 실험 동물에서의 독성에 차이가 있다. 감염의 위험이 없기 때문에 실험에 무병원성 H37Ra 균주를 사용하는 것이 용이하다. 마우스 모델 및 H37Ra 균주를 사용하여 백신 효과를 테스트할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 우리는 우선 마우스에서 이 균주의 지속성을 조사하였다. 마우스의 폐에서 Mtb H37Ra 성장은 기관 내 감염 후 3주 시점에서 정점에 도달하였으며, 그들의 숫자는 26주까지 마우스의 폐와 비장에 (1 로그 이내로) 유지되었다. 이는 Mtb H37Ra가 생존가능하며 백신 후보 스크리닝에 사용될 수 있음을 나타낸다. 그림 6A에 도시된 바와 같이, 모든 마우스는 접종되고 기관 내에서 Mtb H37Ra로 챌린지되었다. 폐와 비장의 미코박테리아 부담은 후-챌린지 4주 시점에서 측정하였다. Ag85B는 대조 항원으로 포함된다. BCG 백신은 비-백신 접종 군에 비해 폐 (1.76 log10)와 비장 (-1.19 log10)의 세균 하중을 크게 감소시켰다 (그림 6B). 항원-부스트 그룹의 세균 하중도 비접종 그룹에 비해 크게 감소하였다. Ab85B-부스트 마우스는 BCG-접종 마우스에 비해 약간 낮은 세균 수를 갖지만, 이 차이는 유의하지 않다. 흥미롭게도, Rv2882c-부스트 마우스는 BCG-접종 마우스보다 훨씬 낮은 세균 수를 갖는다 (P < 0.05). Rv2882c-부스트 마우스가 Ag85B-부스트 마우스보다 약간 낮은 세균 수를 갖더라도 이들 그룹 사이의 수는 유의한 차이를 갖지 않는다. Th1-매개 면역 반응은 Mtb에 대한 예방 면역에 있어서 중요한 역할을 한다. Mtb 챌린지 후 4주가 되는 시점에서, 비장 세포 또는 폐 세포는 시험관 내에서 Ag85B 또는 Rv2882c로 자극되고, 생성된 사이토카인은 ELISA에 의해 결정되었다. 특히, 자극 항원은 해당 항원-부스트 마우스에서 얻은 세포에서 사이토카인 생성을 유도하였다 (그림 6C). 폐 세포에서의 Ag85B-유도 IFN-γ 생산과 비장 세포에서의 IL-2 생산은 BCG 단독 또는 Rv2882c-부스트 마우스보다 크게 높았다. BCG 단독 또는 Rv2882c-부스트 마우스에 비해 Rv2882c는 Rv2882c-부스트 마우스에서 얻은 폐 세포 및 비장 세포에서 유의하게 더 높은 IL-2 및 IFN-γγ 생산을 유도하였다. 이러한 결과는 Rv2882c와 함께 BCG를 부스팅하는 것이 우리 모델에서 단기 예방 효과 및 Th1 사이토카인 반응을 이끌어냄을 시사한다.
<
실시예
8>
전체적인 실험에 대한 결과 고찰
대식세포는 병원체의 인식과 대응에 중요한 역할을 하는 TLR과 식세포 수용체를 발현시키며, 타고난 면역 반응의 개시에 필수적이다. 많은 미코박테리아 성분은 대식세포의 강력한 활성체이며 타고난 면역 반응을 자극하는 리간드로서 작용한다. 미코박테리아 또는 그 구성요소에 의한 TLR 결찰은 병원균에 대한 적응 면역 반응을 유도하는데 매우 중요한 전염증성 사이토카인과 케모카인의 생산을 끌어내는 대식세포 및 수지상 세포 내에서의 시그널 캐스케이드를 개시한다. 본 연구에서, 우리는 새로 확인된 Mtb 단백질인 Rv2882c가 대식세포로 하여금 전염증성 사이토카인을 생산하고 동시 자극 및 MHC 분자를 TLR4 경로를 통해 발현시키도록 강하게 활성화시킴을 보여줌을 확인하였다.
이전에, 우리는 다단계 크로마토그래피로 Mtb CFP를 분별하고 자신의 면역 반응성을 결정하는 것이 복잡한 Mtb 항원 시스템에서 단백질을 식별하는데 있어서 강력한 접근임을 발견하였다. 본 연구에서, 우리는 Mtb CFP의 다차원 분류를 통하여 신규한 대식세포-활성화 단백질인 Rv2882c를 확인하였다. Rv2882c는 막 분획 및 Mtb H37Rv의 배양여액에서 발견되는 리보솜 재활용 인자이다. 그러나, 미코박테리아 감염 동안 Rv2882c의 기능적 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없으며, 그 면역학적 특성도 입증되지 않았다.
우리는 전염증성 사이토카인 TNF-, IL-6 및 MCP-1 수준이 Rv2882c 단백질로 자극된 BMDM에서 증가된 것으로 나타났다. 중요한 전염증성 사이토카인인 TNF-은 미코박테리아 감염에 대한 숙주 예방 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 추가로, MCP-1은 실질적으로 숙주 항-미코박테리아성 염증 반응에 기여한다. Rv2882c는 또한 미코박테리아에 대한 숙주 방어의 핵심 선수인 IL-12p70 분비를 증가시키는 반면, 면역-조절 사이토카인인 IL-10 분비를 유도하지는 않는다. IL-12는 Mtb 감염 제어에 필수적인 IFN-γ-생산 T 세포의 생성을 구동하는 핵심 요소이다. IFN-γ/IL-12 면역 축의 예방 역할은 잘 성립되었다. 이를 종합하면, 우리 데이터는 Rv2882c 단백질이 대식세포를 활성화하고 Th1 유형 면역 반응을 구동함을 시사한다.
대식세포는 식균 작용, T세포에 대한 항원 제시 및 효과 T세포 반응 향상에 의한 주된 면역 조절기이다. 고도의 다형성 MHC 클래스 I 및 II 분자와 동시 자극 분자는 이러한 반응에 관여한다. 본 연구에서, Rv2882c는 대식세포를 자극하고, 그로 인해 CD80, CD86 및 MHC 클래스 II 분자의 발현을 증가시킨다. 이들 데이터는 Rv2882c가 미코박테리아에 대한 방어 면역을 위해 T세포를 활성화하는 대식세포의 능력을 개선함을 시사한다. 본 연구에서, Rv2882c-활성화 대식세포는 동일한 소스에서 얻은 Ag85B-활성화 대식세포의 효과에 비해 효과/기억 T세포 인구의 유의한 증대 및 Mtb-감염 마우스에서 얻은 비장 또는 폐 세포와의 공동배양에서의 IFN-γ 및 IL-2의 생산을 유도한다. 예상한 바와 같이, LPS-활성화 대식세포는 효과/기억 T 세포 반응을 유도하지 않았다.
본 연구에서, 면역 침강 분석 및 TLR4 또는 TLR2 녹아웃 마우스를 사용하는 실험에 의해, 우리는 TLR4, MyD88 및 TRIF가 대식세포의 Rv2882c 활성화를 매개하고, Rv2882c가 NF-kB 및 MAPK 신호 전달 경로를 통해 동시 자극 분자 및 전염증성 사이토카인 발현을 증가시킴을 알 수 있다. 몇몇의 미코박테리아 성분은 TLR2- 또는 TLR4-매개 경로를 통하여 대식세포 또는 수지상 세포의 활성화를 유도하는 것으로 보고되었다 대부분의 PE/PPE 단백질 및 19-kDa 리포단백질의 경우 TLR2, 그리고 열처리 단백질 65, RpfE 및 Rv0652의 경우 TLR4. TLR은 Th1 또는 Th2 면역 반응을 구동하는 수지상 세포의 활성화뿐만 아니라 항염증성 사이토카인 IL-10 또는 전염증성 사이토카인을 분비하는 대식세포의 활성화를 포함하는 다양한 반응을 이끌어낸다. 이는 개별 항원이 대식세포 및 수지상 세포에 다른 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 다른 연구는 미코박테리아 또는 그 구성요소가 MAPK 및 NF-kB을 포함하는 세포 내 신호 전달 경로를 유발함을 보여준다. Rv2882c 와 LPS, 그리고 주로 TLR4에 의한 Rv2882c의 시그널링에 의해 유도되는 반응의 유사성은 단백질 제조에 있어서 LPS 오염의 가능성을 시사한다. 그러나, 여러 줄의 증거가 TLR4를 통한 시그널링과 대식세포의 활성화는 LPS오염 보다는 Rv2882c에 기인함을 나타낸다. MyD88은 Mtb에 대한 타고난 면역 반응을 개시하는데 중요한 역할을 한다. MyD88 이외에, TLR4는 어댑터 분자 TRIF에 의해 매개되는 제2의 경로를 통해 세포 내 시그널링을 유도할 수 있다. 여기서, 우리는 또한 Rv2882c가 MyD88 및 TRIF를 통해 TNF-α 및 MCP-1 생산을 유도함을 알 수 있다.
최근, 19-kDa 리포단백질이 인간 대식세포에서 자식 작용 유도를 통해 항-미코박테리아 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 리포단백질은 장기간 단백질에 노출된 뒤, 대식세포에서 MHC-II 발현과 IFN-γ-규제 MHC-II 항원 처리를 억제한다; 이는 또한 CD4+ T 세포 활성화도 억제한다. PPE18는 이후 IL-10을 분비하는 대식세포를 활성화하고, Rv1917c는 Th2 면역 반응을 구동하기 위하여 수지상 세포의 성숙을 유도한다. 따라서, 이들 단백질은 TB 백신에 포함되기에 적합하지 않을 수 있다. 대조적으로, PPE57 또는 PPE26 단백질을 과발현하는 재조합 BCG는 대식세포의 TLR-의존성 활성화를 유도하고 Th1 면역 반응을 구동하여 마우스의 Mtb에 대한 백신의 예방 효과를 개선시키는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서, Rv2882c는 대식세포 활성화를 유도하여 전염증성 사이토카인 분비, 효과/기억 T세포 인구 증가 및 Th1 면역 반응 유도를 이끌어냈으며, 이는 이 단백질이 유용한 백신 항원이 될 수 있음을 시사한다. 따라서, 우리는 무병원성 Mtb H37Ra를 사용하여 설립 모델에서 BCG 부스터로서의 Rv2882c의 예방 효과를 테스트하였다. 사실, BCG 백신 단독 또는 Ag85-부스팅과 함께하는 경우 우리 테스트 시스템에서 상당한 효능이 있는 것으로 드러났다. 이는 이것이 단백질이 백신 잠재성을 가지고 있는지 여부를 테스트하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 우리는 Rv2882c로 BCG를 부스팅하는 것이 BCG 단독 사용 또는 Ag85B-부스트 뒤 BCG-프라임 사용에 비해 백신의 예방 효과가 개선되었음을 보여준다. 그러나, 본 연구의 한계는 우리가 Rv2882c의 단기 예방 효과만 결정하고 백신 효과가 무병원성 Mtb 균주에 대해서만 평가되었다는 것이다. 따라서, 이 단백질의 백신 효과 및 Mtb H37Rv에 대한 Rv2882c의 예방 메커니즘에 대한 추가 연구가 진행되고 있다. 종합적으로, 본 연구에 제시된 데이터는 신규한 면역 자극성 항원 Rv2882c가 효과적인 TB 백신의 합리적인 설계를 위한 후보가 되어야 함을 시사한다.
<
실시예
9>
Rv2882c
아미노산 서열
MIDEALFDAEEKMEKAVAVARDDLSTIRTGRANPGMFSRITIDYYGAATPITQLASINVP
EARLVVIKPYEANQLRAIETAIRNSDLGVNPTNDGALIRVAVPQLTEERRRELVKQAKHK
GEEAKVSVRNIRRKAMEELHRIRKEGEAGEDEVGRAEKDLDKTTHQYVTQIDELVKHKEG
ELLEV
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)
Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> Active compositions of macrophage containing the Rv2882c protein
<130> P16289
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Rv2882c
<400> 1
Met Ile Asp Glu Ala Leu Phe Asp Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala
1 5 10 15
Val Ala Val Ala Arg Asp Asp Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Arg Ala
20 25 30
Asn Pro Gly Met Phe Ser Arg Ile Thr Ile Asp Tyr Tyr Gly Ala Ala
35 40 45
Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ala Ser Ile Asn Val Pro Glu Ala Arg Leu
50 55 60
Val Val Ile Lys Pro Tyr Glu Ala Asn Gln Leu Arg Ala Ile Glu Thr
65 70 75 80
Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Ala
85 90 95
Leu Ile Arg Val Ala Val Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Glu
100 105 110
Leu Val Lys Gln Ala Lys His Lys Gly Glu Glu Ala Lys Val Ser Val
115 120 125
Arg Asn Ile Arg Arg Lys Ala Met Glu Glu Leu His Arg Ile Arg Lys
130 135 140
Glu Gly Glu Ala Gly Glu Asp Glu Val Gly Arg Ala Glu Lys Asp Leu
145 150 155 160
Asp Lys Thr Thr His Gln Tyr Val Thr Gln Ile Asp Glu Leu Val Lys
165 170 175
His Lys Glu Gly Glu Leu Leu Glu Val
180 185
Claims (11)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Rv2882c 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Rv2882c 단백질은 결핵균(M.tuberculosis)유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 결핵 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Rv2882c 단백질은 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 결핵 예방 또는 치료용 조성물.
- 생체외(in vitro)에서, 대식세포에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Rv2882c 단백질을 처리하여 활성화시키는, 대식세포 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 Rv2882c 단백질 처리 후 세포를 12시간 이상 36시간 이하로 배양하는 것을 특징으로 하는 대식세포 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 Rv2882c 단백질은 대식세포를 활성화시키는 과정 동안 TNF-α, IL-6, IL-12 및 MCP-1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 대식세포의 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 Rv2882c 단백질은 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 대식세포의 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대식세포의 활성화는 Rv2882c 단백질이 TLR(toll-like receptor)-4를 자극하여 일어나는 것을 특징으로 하는 대식세포의 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대식세포의 활성화는 미토겐-활성화 단백질키나제(MAPK) 및 NF-κB 을 자극하여 일어나는 것을 특징으로 하는 대식세포의 활성화 유도 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대식세포는 CD(Cluster of Differentiation)80, CD86, MHC(Major Histocompatibility Complex)-클래스 I, II에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 대식세포의 활성화 유도 방법.
- 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160070510A KR101893947B1 (ko) | 2016-06-07 | 2016-06-07 | Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160070510A KR101893947B1 (ko) | 2016-06-07 | 2016-06-07 | Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170138294A KR20170138294A (ko) | 2017-12-15 |
| KR101893947B1 true KR101893947B1 (ko) | 2018-08-31 |
Family
ID=60954406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160070510A KR101893947B1 (ko) | 2016-06-07 | 2016-06-07 | Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101893947B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200065257A (ko) | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 충남대학교산학협력단 | Rv3463 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 백신 조성물 |
| KR20210157659A (ko) | 2020-06-22 | 2021-12-29 | 충남대학교산학협력단 | Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007108829A2 (en) * | 2005-10-26 | 2007-09-27 | Gene Therapy Systems, Inc. | Tuberculosis nucleic acids, polypeptides and immunogenic compositions |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120012297A (ko) | 2010-07-30 | 2012-02-09 | 이윤열 | 체감형 역사 실연 시스템 및 그 이용방법 |
| KR101230904B1 (ko) | 2011-02-07 | 2013-02-08 | 현대자동차주식회사 | 사이드 도어글래스 제어장치 및 방법 |
-
2016
- 2016-06-07 KR KR1020160070510A patent/KR101893947B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007108829A2 (en) * | 2005-10-26 | 2007-09-27 | Gene Therapy Systems, Inc. | Tuberculosis nucleic acids, polypeptides and immunogenic compositions |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200065257A (ko) | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 충남대학교산학협력단 | Rv3463 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 백신 조성물 |
| KR20210157659A (ko) | 2020-06-22 | 2021-12-29 | 충남대학교산학협력단 | Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물 |
| KR102405798B1 (ko) | 2020-06-22 | 2022-06-08 | 주식회사 미코라파 | Rv2882c-Rv2005c 융합 단백질을 포함하는 결핵 면역 치료용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170138294A (ko) | 2017-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Choi et al. | Mycobacterium tuberculosis RpfE promotes simultaneous Th1‐and Th17‐type T‐cell immunity via TLR4‐dependent maturation of dendritic cells | |
| Kim et al. | Mycobacterium tuberculosis RpfB drives Th1-type T cell immunity via a TLR4-dependent activation of dendritic cells | |
| Cheng et al. | Periodontitis‐associated pathogens P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans activate human CD14+ monocytes leading to enhanced Th17/IL‐17 responses | |
| Byun et al. | Mycobacterium tuberculosis Rv0577, a novel TLR2 agonist, induces maturation of dendritic cells and drives Th1 immune response | |
| Amedei et al. | The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses | |
| Romero-Adrian et al. | Role of cytokines and other factors involved in the Mycobacterium tuberculosis infection | |
| Wang et al. | Early secreted antigenic target of 6-kDa protein of Mycobacterium tuberculosis primes dendritic cells to stimulate Th17 and inhibit Th1 immune responses | |
| Kim et al. | Mycobacterium tuberculosis GrpE, a heat-shock stress responsive chaperone, promotes Th1-biased T cell immune response via TLR4-mediated activation of dendritic cells | |
| Choi et al. | Rv2299c, a novel dendritic cell-activating antigen of Mycobacterium tuberculosis, fused-ESAT-6 subunit vaccine confers improved and durable protection against the hypervirulent strain HN878 in mice | |
| Morrison et al. | TLR-mediated loss of CD62L focuses B cell traffic to the spleen during Salmonella typhimurium infection | |
| Choi et al. | Mycobacterium tuberculosis Rv2882c protein induces activation of macrophages through TLR4 and exhibits vaccine potential | |
| Surendran et al. | Role of TLRs in Brucella mediated murine DC activation in vitro and clearance of pulmonary infection in vivo | |
| Carvalho et al. | Immunologic response and memory T cells in subjects cured of tegumentary leishmaniasis | |
| Kim et al. | Mycobacterium tuberculosis PE27 activates dendritic cells and contributes to Th1-polarized memory immune responses during in vivo infection | |
| Byun et al. | Mycobacterium paratuberculosis CobT activates dendritic cells via engagement of Toll-like receptor 4 resulting in Th1 cell expansion | |
| KR101893947B1 (ko) | Rv2882c 단백질을 포함하는 대식세포의 활성화 조성물 | |
| Hasebe et al. | A Potential Pathogenic Factor from Mycoplasma hominis is a TLR 2‐Dependent, Macrophage‐Activating, P50‐Related Adhesin | |
| Del C Sasiain et al. | Interferon-gamma (IFN-γ) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) are necessary in the early stages of induction of CD4 and CD8 cytotoxic T cells by Mycobacterium leprae heat shock protein (hsp) 65 kD | |
| US8105601B2 (en) | Compositions and methods for modulating an immune response | |
| Choi et al. | Mycobacterium tuberculosis protein Rv2220 induces maturation and activation of dendritic cells | |
| Gilles et al. | Pollen‐derived low‐molecular weight factors inhibit 6‐sulfo LacNAc+ dendritic cells' capacity to induce T‐helper type 1 responses | |
| Roberts et al. | Temporal requirement for pulmonary resident and circulating T cells during virulent Francisella tularensis infection | |
| US11414646B2 (en) | Composition for promoting maturation of dendritic cell containing fusion protein of Rv2299c and ESAT-6 | |
| WO2018013971A1 (en) | Methods of reducing chronic graft-versus-host disease | |
| RU2372936C1 (ru) | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |