MXPA04010645A

MXPA04010645A - Vacunas en combinacion que incluyen polipeptidos del factor camp y gapc inmunogeno.

Info

Publication number: MXPA04010645A
Application number: MXPA04010645A
Authority: MX
Inventors: J Bolton Alexandra
Original assignee: Univ Saskatchewan
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2003-04-24
Publication date: 2005-02-14
Also published as: AU2003229415B2; CA2483453A1; WO2003091279A3; US7273930B2; US7749516B2; US6833134B2; US20030165524A1; US20050089529A1; US20080213294A1; WO2003091279A2; NZ536233A; AU2003229415A1; BR0309569A; JP2006503803A; EP1499634A2

Abstract

Se describe el uso de proteinas de enlace de la plasmina de GapC desde Streptococcus dysgalactiae (S. dysgalactiae), Streptococcus agalactiae (S: agalactiae), Streptococcus uberis (S. uberis), Streptococcus parauberis (S. parauberis), y Streptococcus iniae (S. iniae) en combinacion con factores CAMPS, para prevenir o tratar infecciones en general, y mastitis en particular.

Description

VACUNAS EN COMBINACION QUE INCLUYEN POLIPEPTIDOS DEL FACTOR CAMP Y GapC I MU OGENO CAMPO TECNICO La presente invención concierne a vacunas en combinación para tratar o prevenir infecciones bacterianas. Más particularmente, la presente invención pertenece al uso de proteínas de enlace de la plasmina de GapC desde Streptococcus dysgalactlae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus parauberis, y Streptococcus iniae en combinación con factores GñMPS, en composiciones para vacunas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mastitis en una infección de la glándula mamaria, usualmente causada por bacterias u hongos. La respuesta inflamatoria después de la infección da como resultado producción de leche decreciente, asi como también de la calidad de la misma, y causa pérdidas económicas anuales importantes a la industria lechera. Entre las especies bacterianas más comúnmente asociadas con la mastitis están varias especies de los géneros Streptococcus, que incluyen Streptococcus aureus, Streptococcus uberis (no tipificable) , Streptococcus agalactiae (del grupo B de Lancefield) , Streptococcus dysgalactiae (del grupo C de Lancefield) , Streptococcus zooepidemicus, y los streptocci de los grupos D, G, L y N de Lancefield. Algunas de estas especies son contagiosas (por ejemplo S. agalactiae) , mientras que otras son consideradas patógenas ambientalmente (por ejemplo S. dysgalactiae y S. uberis) . El patógeno ambiental, S. uberis es responsable de aproximadamente 20 % de todos los casos clínicos de mastitis (Bramley, A. J. y Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. 51: 481-512; Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition 42: 12- 16; Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sci. 71: 1616-1624); es el organismo predominante aislado de las glándulas mamarias durante el período de no lactancia (Bramley, A. J. (1984) Br. Vet. J. 140: 328- 335; Bramley y Dodd (1984) J. Dairy Res. 51: 481-512; Oliver, S. P. (1988) Am. J. Vet. Res. 49: 1789-1793). La mastitis que resulta de la infección con S. uberis es comúnmente subclíníca, caracterizada por leche aparentemente normal con un incremento en el conteo de las células somáticas debido al influjo de leucocitos. La composición química de la leche cambia debido a la supresión de la secreción con la transferencia de cloruro y de bicarbonato de sodio de la sangre a la leche, que ocasiona un desplazamiento del pH a un nivel más alcalino. La mastitis de S. uberis puede también tomar la forma de una condición clínica aguda, con señales obvias de enfermedad, tal como coágulos o decoloración de la leche y espon amiento o dureza de la glándula mamaria. Algunos casos de enfermedad clínica pueden ser severos y puede presentarse la pirexia. Para una revisión de las manifestaciones clínicas de mastitis por S. uberis, ver, Bramley (1991) Mastitis: physiology or pathology, págs . 3-9. En C. Burvenich, G. Vandeputte- van Messom, y A. W. Hill (ed.) New insights into the pathogenesis of mastitis. Rijlsuniversiteit Gent, Belgium; y Schalm y colaboradores (1971) The mastitis complex-A brief summary, páginas 1-3. In Bovine . Mastitis. Lea & Febiger, Philadelphia . Los métodos de control antibacteriano convencionales tales como inmersión de las teta's y terapia antibiótica son efectivos en el control de muchos tipos de mastitis contagiosa, pero los organismos ambientales encontrados típicamente en todos los establos son a menudo resistentes a las medidas. Por consiguiente, la vacunación es una estrategia atractiva para prevenir infecciones de las glándulas mamarias, y se ha mostrado que son benéficas en el caso de algunos patógenos de mastitis contagiosas. La literatura es limitada con respecto a estudios de vacunación con S. dysglactiae y S. uberis, y se han observado resultados variables. En algunos casos, la inmunización ha dado como resultado sensibilidad creciente a los organismos específicos y en otros casos se ha obtenido protección específica de la cepa. Por ejemplo, estudios previos han mostrado que la infección primaria con s. uberis puede reducir considerablemente la velocidad de infección después de una segunda estimulación con la misma cepa (Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 44: 386-387) . La vacunación local con S. uberis muerta protege a las glándulas mamarias bovinas contra la estimulación intramamaria con la cepa homologa (Finch y colaboradores (1994) Infect. Immun. 62: 3599-3603) . De manera similar, la vacunación subcutánea con S. uberis viva ha mostrado causar una modificación dramática de la patogénesis de mastitis con la misma cepa (Hill y colaboradores (1994) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8: 109-118). Los animales vacunados de esta manera arrojaron menos bacterias en su leche y muchas regiones permanecieron libres de infección. Sin embargo, la vacunación con bacterias atenuadas o vivas puede presentar riesgos en el recipiente. Adicionalmente, es claro que las vacunas muertas convencionales son en general, muy inefectivas contra S. uberis y S. agalactiae, ya sea debido a la falta de antígenos protectores o en células desarrolladas in vitro o encubrimientos de estos antígenos por medio de mimetría molecular. La carencia actual de las vacunas existentes para la mastitis contra S. agalactiae o las cepas de streptococos contagiosas es debida al menos en parte a la falta de conocimiento con respecto a los determinantes de virulencia y antigenos protectores producidos por los organismos que están involucrados en la invasión y protección de la glándula mamaria (Collins y colaboradores (1998) . J. Dairy Res. 55: 25-32; Leigh y colaboradores (1990) Res. Vet. Sci. 49: 85-87; Marshall y colaboradores (1986) J. Dairy Res. 53: 507- 514). S. dysgalactiae, es conocida por enlazar a varias proteínas derivadas de plasma y extracelulares tales como fibronectina, fibrinógeno, colágeno, alfa-II-macroglobulina, IgG, albúmina y otros compuestos. El organismo también produce hialuronidasa y fibrinolisina y es capaz de adherirse e invadir células epiteliales mamarias bovinas. No obstante, no se conocen exactamente los papeles de los componentes bacterianos responsables de estos fenotipos en la patogénesis. De manera similar, se ha comprendido pobremente la patogénesis de la infección por S. uberis. Además, la influencia de los factores de virulencia de S. uberis sobre los mecanismos de defensa del huésped y la fisiología de la glándula mamaria no se ha definido bien.

Los factores de virulencia conocidos asociados con S . uberis incluyen una cápsula de ácido hialurónico (Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 45: 400- 404), hialuronidasa (Schaufuss y colaboradores (1989) Zentralbl. Bacteriol. Ser. A 271: 46-53), proteina similar a R (Groschup, M. H. y Timoney, J. F. (1993) Res. Vet. Sci. 54: 124- 126), y una cohemolisina, el factor CAMP, también conocido como factor UBERIS, (Skalka, B. y Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249: 190-194), proteína similar a R, activador de plasminógeno y factor CAMP. Sin embargo, se conoce muy poco de sus papeles en la patogenicidad. Se ha propuesto el uso de los determinantes de virulencia de Streptococcus como agentes de virulencia. Por ejemplo, el factor CAMP de S. uberis ha mostrado proteger a sujetos vertebrados de la infección por ese organismo (Jiang, Patente ü. S. No. 5,863,543). El antígeno ? de la cepa A909 de Streptococci del grupo B (ATCC No. 27591) es un componente del complejo marcador de la proteína c, el cual comprende adicionalmente una subunidad a y ß (Boyle, Patente U.S. No. 5,721,339). Los subgrupos de células serotipo la, II, y virtualmente todo el serotipo Ib del grupo B de streptococci, se han reportado que expresan a componentes de la proteína C. Se ha propuesto la subunidad ? como un agente inmunógeno contra infecciones por Streptococcus del Grupo B de Lancefield. No obstante, no se ha estudiado su uso para prevenir o tratar infecciones bacterianas en animales, que incluyen mastitis en ganado vacuno. La proteina M estreptocócica del grupo A se considera que es uno de los principales factores de virulencia de este organismo en virtud de su habilidad para impedir el ataque por fagocitos humanos (Lancefield, R. C. (1962) J. Immunol. 89: 307-313) . La bacteria persiste en el tejido infectado hasta que los anticuerpos son producidos contra la molécula M. Los anticuerpos específicos del tipo en la proteína M son capaces de invertir el efecto antifagocítico de la molécula y permitir la eliminación eficiente del organismo invasor. Las proteínas M son uno de los factores de virulencia claves de Streptococcus pyogenesr debido a su involucramiento al mediar la resistencia a la fagocitosis (Kehoe, M. A. (1991) Vaccine 9: 797-806) y su habilidad para inducir respuestas inmunes en el huésped potencialmente perjudiciales vía su superantigenicidad y su capacidad para inducir respuestas de anticuerpo que inter reaccionen en el huésped (Bísno, A. L. (1991) New Engl. J. Med. 325: 783- 793; Froude y colaboradores (1989) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145: 5-26; Stollerman, G. H. (1991) Clin. Immunol. Immunopathol . 61: 131- 142. Sin embargo, existen obstáculos para usar proteínas M intactas como vacunas. Los epítopes opsónicos de la proteína son de tipo extremadamente específico, que da como resultado protección de tipo específico, estrecha. Además, algunas proteína M parecen contener epítopes que inter reaccionan con tejidos del sujeto inmunizado, causando una respuesta autoinmune perjudicial (Ver, por ejemplo, Dale, J. L. y Beached, G. H. (1982) J. Exp. Med. 156: 1165-1176; Dale, J. L. y Beached, G. H. (1985) J. Exp. Med. 161: 113- 122; Baird, R. W., Bronze, M. S., Drabs, W., Hill, H. R. Veasey, L. G. y Dale, J. L. (1991) J. Immunol. 146: 3132-3137; Bronze, M. S. y Dale, J. L. (1993) J. Immunol 151: 2820-2828; Cunningham, M. W. y Russell, S. M. (1983) Infect. Immun. 42: 531-538). Las proteínas quiméricas que contienen tres regiones de enlace de fibronectina diferentes (FNBDs) derivadas de proteínas de enlace de fibronectina de S. dysgalactiae y Staphylococcus a reus han sido expresadas sobre la superficie de células de Staph. Carnosus. En el caso de una de estas proteínas, inmunizaciones internasales con células de Staph. Carnosus recombinantes que expresan a la proteína quimérica sobre su superficie dieron como resultado una repuesta de anticuerpo mejorada en un inmunógeno modelo presente en la proteína de superficie quimérica. Se ha descrito la proteína de enlace de la plasmina de GapC de una cepa de Streptococcus del Grupo A ha sido identificada y caracterizada previamente, y su uso en terapias tromboliticas (Boyle, y colaboradores, patente IT. S. No. 5,237,050; Boyle, y colaboradores, Patente U.S. No. 5, 328, 996) . Sin embargo, no se ha estudiado hasta ahora, la capacidad protectora de GapC en combinación con factores quiméricos CAMP. SUMARIO DE LA INVENCION Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevas composiciones del factor CAMP quimérico y de GapC de Streptococcus y métodos de usarlos . En una modalidad, la invención está dirigida a una composición de vacuna que comprenda (a) un vehículo aceptable farmacéuticamente; (b) un polipéptido de factor CAMP quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos contigua en las posiciones 27-314 de la Figura 29; y (c) una proteina de GapC, en donde la proteina de GapC es seleccionada del grupo que consiste de: (i) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la posición del aminoácido 1 al 336, inclusive, de las Figuras IB-IB (SEC ID NO: 4) ; (ii) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la posición del aminoácido 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) ; (iii) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) ; (iv) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4A~ 4B (SEC ID NO: 10) ; (v) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la posición de los aminoácidos 1 a 336, de las Figuras 5A-5B (SEC ID NO: 12); y (vi) fragmentos inmunogénicos de (i) , (ii) , (iii) , (iv) , (v) y (vi) , los fragmentos que comprendan al menos 5 aminoácidos . En modalidades adicionales, la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus dysgalactiae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 36, inclusive, de las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos. En modalidades adicionales, la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus agalactiae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos. En modalidades adicionales, la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus uberis expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos . En aún modalidades adicionales, la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus parauberis expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4A-4B (SEC ID NO: 10) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos. En modalidades adicionales, la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus iniae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5?-5? (SEC ID NO: 12) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprende al menos 5 aminoácidos. En ciertas modalidades, las composiciones anteriores comprenden adicionalmente un adyuvante . En modalidades adicionales, la invención está dirigida a un método de tratar o de prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición de vacuna como se describió anteriormente. En ciertas modalidades, la infección bacteriana es una infección de estreptococo. En modalidades adicionales, la infección bacteriana causa mastitis . En aún modalidades adicionales, la invención está dirigida al uso de un polipéptido de factor CñMP quimérico y de una proteina de GapC para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado, en donde el polipéptido del factor C¾ P quimérico y la proteina de GapC son como se describieron anteriormente. En ciertas modalidades, la infección bacteriana es una infección de streptococcus . En modalidades adicionales, la infección bacteriana causa mastitis. En modalidades adicionales, la invención está dirigida al uso de un polipéptido del factor C¾MP quimérico y a una proteina de GapC en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado, en donde el factor CA P quimérico y la proteina de GapC son como se describieron anteriormente. En ciertas modalidades, la infección bacteriana es una infección de estreptococo. En modalidades adicionales, la infección bacteriana causa mastitis . En modalidades adicionales, la invención está dirigida a un método de producir una composición de vacuna que comprende combinar un polipéptido del factor C¾MP quimérico como se describió anteriormente, una proteina de GapC como se describió anteriormente y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Estas y otras modalidades de la presente invención serán obvias fácilmente para los expertos en la materia en vista de la presente descripción.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B exponen las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC para S. dysgalactiae (SEC ID NO: 3 y SEC ID O: 4) . Las Figuras 2A-2B, exponen las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC para S. agalactiae (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6) . Las Figuras 3?-3? exponen las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC para S. uberls (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8) . Las Figuras 4A-4B exponen las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC para S. parauberis (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10) . Las Figuras 5A-5B, exponen las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC para S. íníae (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12) . Las Figuras 6A-6E, muestran una alineación de DNA creada por PileUp y expuesta por medio del programa Pretty (un componente del paquete GCG Wisconsin, versión 10, proporcionada por el paquete de análisis de secuencias SeqWeb, versión 1.1, del Canadian Bioinformatics Resource) . La Figura expone las secuencias de nucleótidos aisladas de los genes de gapC de S. dysgalactiae (DysGapC, Ficha No. 9344), S. agalactiae (AgalGapC. Ficha No. 2895), S. uberis (UberGapC, Ficha No. 5966), S. parauberis (ParaübGapC, Ficha No. 9672), y S. iniae (SiniGapC, Ficha No. 990). Las secuencias previamente conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Ficha No. 5841), S. pyogenes (SpyGapC, Ficha No. 4037), y una proteina de GAPDH bovina (BovGapC, Ficha No. 5059), se incluyen también. Los parámetros de extensión y peso fueron iguales para todas las secuencias (1018 y 1.00, respectivamente). Los parámetros usados en la comparación de la secuencia de DNA fueron como sigue: Pluralidad—2.00; Umbral—1; Peso Promedio—1.00; Emparejamiento Promedio—1.00; Disparej amiento Promedio—0.00; tabla de comparación de símbolos—pileupdna.cmp; Verificación Comparativa—6876; Peso de Espacio—5; Peso Extensión de Espacio—1; Apilamiento MSF—1018; Tipo— ; Ficha No.—3804. En la Figura, los trazos representan nucleótidos idénticos; los puntos representan espacios introducidos por el paquete usado para generar la carta de alineación, y los acentos representan regiones no incluidas en la alineación total debido a diferencias en la extensión de las secuencias genéticas . Las Figuras 7A-7B muestran un alineamiento de secuencias de aminoácidos creado por medio de PilUp y expuesta por Pretty {como anteriormente) que expone las secuencias de aminoácidos deducida de las proteínas de GapC de S. dysgalactiae (DysGapC, Ficha No. 6731), S. agalactias (AgalGapC, Ficha No. 1229), S. uberls (UberGapC, Ficha No. 8229), S. parauberis (PuberGapC, Ficha No. 8889) y S. iniae (IniaeGapC, Ficha No. 8785) . Las secuencias de S. equisi ilis conocidas previamente (SeqGapC, Ficha No. 8252), S. pyogenes (SpyGapC, Ficha No. 6626) y una proteína de GAPDH bovina (BovGapC, Ficha No. 8479) se incluyen también. En la Figura, los trazos representan residuos de aminoácidos idénticos; los puntos representan espacios introducidos por medio del programa PileUp, y los acentos representan regiones no incluidas en la alienación total debido a diferencias en la extensión de las secuencias genéticas . La Figura 8, muestra gráficas de hidropatía de Kyte- Doolittle (promediado en una ventana de 7) , gráficas de probabilidad de superficie de Emini, gráficas de flexibilidad de cadena de Karplus-Schulz, gráficas de índice antigénico de Jameson-Wolf, y tanto las gráficas de estructura secundaria de Garnier-Osguthorpe-Robson como de Chou-Fasman para la proteína de GapC aislada de S. dysgalactiae. La Figura 9 gráficas de hidropatía de Kyte-Doolittle (promediado en una ventana de 7) , gráficas de probabilidad de superficie de Emini, gráficas de flexibilidad de cadena de · arplus-Schulz, gráficas de índice antigénico de Jameson-Wolf, y tanto las gráficas de estructura secundaria de Garnier-Osguthorpe-Robson como de Chou-Fasman para la proteína de GapC aislada de S. agalactiae. La Figura 10, muestra gráficas de hidropatía de Kyte- Doolittle (promediado en una ventana de 7), las gráficas de probabilidad de superficie de Emini, gráficas de flexibilidad de cadena de Karplus-Schulz, gráficas de índice antigénico de Jameson-Wolf, y tanto las gráficas de estructura secundaria de Gamier-Osguthorpe-Robson como de Chou- asman para la proteína de GapC aislada de S. uberis. La Figura 11, muestra gráficas de hidropatía de Kyte-Doolittle (promediado en una ventana de 7) , las gráficas de probabilidad de superficie de Emini, gráficas de flexibilidad de cadena de Karplus-Schulz, gráficas de índice antigénico de Jameson-Wolf, y tanto las gráficas de estructura secundaria de Garnier-Osguthorpe-Robson como de Chou-Fasman para la proteína de GapC aislada de S. parauberis. La Figura 12 muestra gráficas de hidropatía de Kyte-Doolittle (promediado en una ventana de 7), las gráficas de probabilidad de superficie de Emini, gráficas de flexibilidad de cadena de Karplus-Schulz, gráficas de índice antigénico de Jameson-Wolf, y tanto las gráficas de estructura secundaria de Garnier-Osguthorpe-Robson como de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. iníae. La Figura 13 es una representación diagramática de las gráficas de estructura secundaria de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. dysgal. La Figura 14 es una representación diagramática de las gráficas de estructura secundaria de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. agalactiae. La Figura 15 es una representación diagramática de las gráficas de estructura secundaria de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. uberis. La Figura 16 es una representación diagramática de las gráficas de estructura secundaria de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. parauberis. La Figura 17 es una representación diagramática de las gráficas de estructura secundaria de Chou-Fasman para la proteina de GapC aislada de S. iniae. La Figura 18 muestra los resultados de electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS de GapC de S. dysgalactiae recombinante, producida en E. coll DE3. La banda 1, marcadores de peso molecular (20.5-103 kDa; BioRad, Emeryville, CA) ; banda 2, GapC de S. dysgalactiae recombinante soluble purificado por cromatografía por afinidad de Ni-NTA. Los números de la izquierda de la figura indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (en kDa) . La Figura 19, es una histografía que compara la actividad enzimática de la plasmina bovina enlazada a células de S. dysgalactiae intactas; plasmina bovina enlazada a la proteína de GapC de S. dysgalactiae recombinante purificada por afinidad; células de S. dysgalactiae intactas solas; proteína de GapC de S. dysgalactiae recombinante purificada por afinidad sola; y plasmina bovina sola. La actividad se determinó por medio de un incremento en la absorbancia a 405 nm después de liberación de paranitroaniluro de la cromozina-PL del substrato sintético del substrato sintético (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canadá) . Los datos representan la media de tres ensayos individuales. La Figura 20 compara el cambio en el porcentaje de regiones de ubre infectadas con S. dysgalactiae durante un período de 7 días entre tres grupos experimentales: (1) animales control sin vacunar; (2) animales vacunados con la proteína de enlace de MigFc; y (3) animales vacunados con GapC. La infección se definió como recuperación de > 500 cfu de la S. dysgalactiae por mi de secreciones de leche. La Figura 21 gráfica el número máximo de S. dysgalactiae en cualquier región de ubre contra el título de anticuerpo anti-GapC en suero (expresado como el recíproco de la dilución que muestra la actividad encima de los niveles de fondo) . Se mostró que los títulos anti-GapC en suero, se correlacionan con el número máximo de cfu/ml recuperados de las glándulas mamarias (R) = 0.74, como se determinó usando el programa GraphPadPrism, v.2.01, de GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . La Figura 22, gráfica el número acumulativo de regiones mamarias infectadas contra el título de anticuerpo en suero (otra vez expresado como el recíproco de la dilución que muestra la actividad encima de los niveles de fondo) . Se observó una fuerte correlación entre el nivel del anticuerpo en suero, anticuerpo anti-GapC y el número total de regiones infectadas . La Figura 23 ilustra la recuperación de las bacterias de animales inmunizados con GapC; los puntos de datos son graficados como recuperación bacteriana media/ml de leche vs . El tiempo (en días post-estimulación) . En la figura, los diamantes (-?-) representan animales no vacunados, los cuadrados (-¦-) representan animales de bajo título (es decir animales que exhibieron la respuesta más pobre contra ¦ GapC en términos de título de anticuerpo) , y los triángulos (-?-) representan animales de título alto (es decir los animales restantes) . La Figura 24 muestra la recuperación de S. dysgalactiae de animales inmunizados con GapC, graficada como el por ciento de regiones mamarias infectadas vs . El tiempo en dias post-inmunización. En la figura, las barras punteadas representan animales no vacunados; las barras sombreadas representan animales de bajo titulo (es decir animales que exhibieron la respuesta más pobre contra GapC en términos del titulo de anticuerpo) y las barras sin sombrear representan animales de alto titulo (es decir, los animales remanentes) . La Figura 25, expone la respuesta inflamatoria a la infección observada con S. dysgalactiae graficada como cuenta media de células somáticas (SCC) para cada grupo experimental versus el tiempo en dias post-estimulación. En la figura, los diamantes (-?-} representan regiones sin vacunar, sin estimular, los cuadrados (-¦-) representan animales sin vacunar, estimulados, los triángulos (-?-) representan animales estimulados, vacunados con Mig, y las x' s (-X-) representan animales vacunados con GapC, estimulados . La Figura 26, ilustra los conteos de células somáticas por región mamaria en el dia 1 postestimulación. En la Figura, la barra representa la media de cada grupo. Los cuadrados (-¦-) representan animales sin vacunar; los triángulos (-A-) representan animales vacunados con GapC, y los triángulos invertidos (-T-) representan animales vacunados con Mig. La Figura 27, expone los conteos de células somáticas de animales de alto título, inmunizados con GapC y sin estimular, no vacunados (es decir, los cuatro animales que exhibieron los títulos de anticuerpo más altos de los ocho animales en el grupo particular) por siete días postestimulación, graficados como el loglO de la cuenta media de células somáticas/mi de leche contra el tiempo en días post- estimulación. Los diamantes {-?-) representan animales sin vacunar, sin estimular, los cuadrados (-¦-) representan animales estimulados, sin vacunar, y los triángulos (-A- ) representan animales vacunados con GapC, estimulados . La Figura 28, muestra la media geométrica de SCC (más 1 desviación estándar) en regiones estimuladas con S . uberis en grupos de vacas como se describe en el ejemplo 6, por 7 días después de estimulación. Los grupos de datos corresponden al día 0 (la barra mas a la izquierda) , día 1 (la segunda barra de la izquierda) , día 2 (la tercera barra de la izquierda) , día 3 (la cuarta barra de la izquierda) , día 4 (la quinta barra de la izquierda) , día 5 (la sexta barra de la izquierda), día 6 (la séptima barra de la izquierda) , y día 7 (la octava barra de la izquierda) . A pesar de la apariencia de la figura, el SCC para animales vacunados con {6xHis)GapC de S. dysgalactiae en los dias 7 y 8, y animales vacunados con CAMP-3 en los días 4 y 5 post-estimulación no fueron diferentes significativamente estadísticamente de los de control. La Figura 29, expone las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la LipoF: CAMP3 quimera (SEC ID NOS: 13 y 14) . Se muestra la secuencia de proteína y de nucleótidos de la CAMP-3 quimera fusionada a la secuencia de señal LipoF. Los nucleótidos están numerados a la izquierda de la figura, mientras que los residuos están numerados a la derecha. La secuencia subrayada representa la secuencia de señal de LipoF. Los aminoácidos espaciadores se encuentran en las posiciones 87, 145 y 146.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIO La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de DNA recombinante, e inmunología, las cuales están en la experiencia en el arte. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II y III, segunda Edición (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); La serie, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. aplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbookk of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente, ya sea supra o infra se incorporan integramente a la presente como referencia. En el transcurso del texto se usan las siguientes abreviaciones de aminoácidos: Alaniña: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Acido aspártico: Asp (D) Cisterna: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Acido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: lie (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys ( ) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: T r (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V) 1.Definiciones Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende definirlos como se indica posteriormente. Debe hacerse notar que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas del singular "un", "uno" y "el, la" incluyen las referentes al plural a menos que el contenido dicte claramente de otra manera. Asi, por ejemplo, la referencia a "una proteina de GapC de Streptococcus" incluye una mezcla de dos o más de dichas proteínas, y los similares.

Los términos "proteína de GapC" y proteína de enlace de plasmina de GapC" (usadas indistintamente en la presente) o una secuencia de nucleótidos que las codifica, quiere decir una proteína o secuencia de nucleótidos, respectivamente, la cual se deriva de un gen de GapC encontrado en una variedad de especies de Streptococcus, incluyendo, sin limitación ciertas cepas de Streptococci del grupo A(Lottcnberry, R., y colaboradores, (1987) Infect. Immun. 55: 1914-1918) . La secuencia de nucleótidos de genes GapC de Streptococcus, y la secuencia de aminoácidos correspondiente de las proteínas GapC codificadas por estos genes, se exponen en las Figuras. En particular, las Figuras 1 hasta la 5 exponen secuencias de nucleótidos aisladas y secuencias de aminoácidos aisladas de S. dysgalactiae (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, respectivamente), S agalactiae (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, respectivamente), S. uberis (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, respectivamente), S. parauheris (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10), respectivamente), y S. iniae (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, respectivamente) . Las secuencias de nucleótidos de los genes de gapC de S. uberis y S. agalactiae se han sometido a la consideración de GenBank bajo los Números de Acceso AF421899 y AF421900, respectivamente. No obstante, una proteína de GapC como se define en la presente no se limita a las secuencias expuestas como subtipos de cada una de estas especies de Streptococcus, son conocidas y pueden tener lugar entre ellas variaciones en las proteínas de GapC. Los genes de gapC representativos, derivados de S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis y S. parauberis, se encontraron en los plásmidos pET15bgapC (ATCC No. PTA-1976), pMF521c (ATCC No. 1975), pMF521a (ATCC No. PTA-1973), pMF521d, y pMF521e (ATCC No. PTA-1972) , respectivamente . Además, la proteína o secuencias de nucleótidos derivadas no necesitan ser físicamente derivadas del gen descrito anteriormente, pero puede ser generado de cualquier manera, incluyendo por ejemplo, síntesis química, aislamiento (por ejemplo, desde S. dysgalactiae) o por producción recombinante con base en la información proporcionada en la presente. Los términos también incluyen proteínas que poseen, así como también que carecen de, una secuencia de señal, si está presente, así como también proteínas en forma neutra o en la forma de sales de adición de ácidos o básicas dependiendo del modo de preparación. Dichas sales de adición de ácido pueden involucrar grupos de aminoácidos libres y sales básicas pueden ser formadas con carboxilos libres. Además, las proteínas pueden ser modificadas por combinación con otros materiales biológicos tales como lípidos (tanto los que se encuentran naturalmente con la molécula como otros lípidos que no destruyan la actividad inmunológica) y sacáridos, o por modificación de la cadena lateral, tales como acetilación de los grupos amino, fosforilación de cadenas laterales idroxilo, oxidación de grupos sulfhidrilo, glicosilación de residuos aminoácido, así como también otras modificaciones de la secuencia primaria codificada. El término "proteína de GapC estreptocócica", quiere decir, una proteína de enlace de la plasmina de GapC, como se definió anteriormente, derivada de especies estreptocócicas que la produzca, incluyendo, pero no limitándose a S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberls, y S. Inlae. Por ejemplo, una "proteína de GapC de S. dysgalactiae" es una proteína de enlace de la plasmina de GapC como se definió anteriormente, derivada de 5. dysgalactiae. De manera similar, un "proteína de GapC de S. agalactiae" quiere decir una proteína de enlace de gapC derivada de S. agalactiae. Los términos "variante" y "muteína" de una proteína de GapC se refiere a derivados activos biológicamente de una proteína de GapC, como se definió anteriormente, o fragmentos de dichos derivados, que retengan la actividad de enlace de plasmina y/o inmunológica. El término "muteina", se refiere a péptidos que tienen uno o más péptidos encubiertos ("peptoides") , tales como los descritos en la Publicación Internacional No. O 91/04282. Preferiblemente, la variante o muteina tiene al menos la misma actividad que la molécula nativa. Los métodos para elaborar variantes de polipéptidos y muteinas son conocidos en el arte y se describen posteriormente de manera adicional. En general, el término "variante", se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura de polipéptido nativa con una o más adiciones, substituciones (generalmente de manera conservadora) , y o eliminaciones de aminoácidos, en relación a la molécula nativa, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad. Asi, una "variante" de una proteina de GapC incluye una proteina con secuencias de aminoácidos substancialmente homologas (como se define posteriormente) a secuencias de aminoácidos contiguas codificadas por los genes de GapC anteriores, los cuales presentan actividad de enlace de plasmina y/o inmunológica. Se prefieren de manera particular substituciones generalmente de naturaleza conservadora, es decir, las substituciones que tienen lugar en una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) cidos — glutamato y aspartato; (2) ásicos histidina, arginina, lisina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina algunas veces son clasificados como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato con un glutamato o viceversa; una treonina con una serina o viceversa; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Proteínas que tienen substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen substituciones menores de aminoácidos que no afectan substancialmente la inmunogenicidad y/o la afinidad de enlace de plasmina de la proteína, están por consiguiente en la definición del polipéptido de referencia. Otras substituciones incluyen substituciones de aminoácidos como se encuentran de manera natural con análogos de aminoácidos. Dichos análogos de aminoácidos son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, ácido 2- aminoadipico, ácido 3- aminoadípico, beta-alaniña, ácido beta-aminopropiónico, ácido 2- aminobutirico, ácido 4- aminobutirico, ácido piperidinico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2- aminohe tañoico, ácido 2-aminoisobutirico, ácido 3- aminoisobutirico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2, 4- diaminobutirico, desmosina, ácido 2, 2'- diaminopimélico, ácido 2, 3-diaminopropiónico, N-etilenglicina, N- etilenasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3- hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N- metilisoleucina, 6-N-metil-lisina, N- metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina.

Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5 - 10 substituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o aún hasta 15 - 25 o 20 - 50 substituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o cualquier entero entre estos valores, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta. ? este respecto, las proteínas de GapC aisladas de streptococci exhiben varias regiones variables en sus secuencias de aminoácidos, localizadas en las posiciones de los aminoácidos 62 a 81; 102 al 12; 165 a 172; 248 a 271; y 286 a 305, numeradas en relación a las secuencias de aminoácidos expuestas en las Figuras 1 a 5. Estas regiones, las cuales en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. vberis, S. parauberis y S. iniae exhiben 1 a 9 substituciones de aminoácidos, se espera que sean conducibles a variación sin afectar substancialmente la función enzimática o inmunológica. De manera similar, la substituciones tienen lugar en la región de enlace transmembrana, si está presente, y la secuencia de señal, si está presente, normalmente no afectará la inmunogenicidad. Un experto en la materia puede determinar otras regiones de la molécula de interés que puede tolerar cambio en referencia a los datos de la estructura proteinica mostrados en las Figuras 8 - 17 de la presente. Por "fragmento" se quiere decir un polipéptido o polinucleótido que consiste de solamente una parte de la secuencia y estructura polipeptidica intacta, o la secuencia y estructura de nucleótidos del gen de referencia. El fragmento de polipéptido puede incluir una eliminación C-terminal y/o eliminación N- terminal del polipéptido nativo, o puede derivarse de una porción interna de la molécula. De manera similar, un fragmento de polinucleótido puede incluir una eliminación 3' y/o 5' del polinucleótido nativo, o puede derivarse de una porción interna de la molécula. Un "fragmento" de polipéptido de una proteina de GapC incluirá generalmente al menos aproximadamente 5 residuos de aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos aproximadamente 10 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de extensión total, preferiblemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de extensión total, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 - 50 o más residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de extensión total, o cualquier entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de extensión total, a condición de que el fragmento en cuestión retenga la actividad de GapC como se describió anteriormente. Un fragmento de nucleótido del gen de interés generalmente incluye al menos aproximadamente 8 pares de bases contiguos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 — 20 pares de bases contiguas, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 - 50, o más, pares de bases contiguos del gen7 o cualquier entero entre estos valores. Dichos fragmentos son útiles como sondas y en métodos de diagnóstico, discutidos posteriormente más de manera completa. Adicionalmente, fragmentos de polipéptidos incluyen formas de las proteínas de GapC que carecen de una región de anclaje de membrana, si está presente en la proteína de referencia, y secuencias de ácido nucleico que codifican a proteínas con dichas eliminaciones. Las eliminaciones pueden ser deseables en sistemas que no se proporcionan por secreción de la proteína. Además, las regiones de enlace de plasmina de las proteínas, pueden estar presentes o no. Así, por ejemplo, si se usará la proteína de enlace de plasmina de GapC para purificar la plasmina, la región de enlace de plasmina generalmente será retenida. Si la proteína es para ser usada en composiciones de vacuna, estarán presentes, epítopes inmunogénicos que pueden incluir o no la región de enlace de plasmina. Una proteína o polipéptido ^aislado" es una molécula de proteína o polipéptido separado y discreto del organismo completo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza; o una proteína o polipéptido desprovistos, total o parcialmente, de secuencias normalmente asociadas con su naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tenga secuencias neterólogas (como se definen posteriormente) en asociación con éstas. El término Mequivalente funcionalmente, quiere decir que la secuencia de aminoácidos de una proteína de enlace de plasmina de GapC o un polipéptido de CAMP-3 es una que provocará una respuesta inmunológica mejorada o substancialmente equivalente, como se define en la presente, si la proteína es para ser usada en una vacuna, o que funcionará de una manera equivalente o mejorada en un inmunoensayo, en comparación con la actividad de una proteina de enlace de plasmina de GapC que tenga identidad con la proteina de enlace de plasmina de GapC de referencia, o una porción inmunogénica de la misma, o el polipéptido de CñMP-3 mostrado en la Figura 29, o una porción inmunogénica de ésta. El término "epitope" se refiere al sitio en un antigeno o hapteno al cual responden células T y/o células B especificas. El término es también usado indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen al mismo epitope pueden ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la habilidad de un anticuerpo para bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antigeno objetivo. Los términos proteina o péptido "inmunogénicos" se refieren a una secuencia de aminoácidos que provocan una respuesta inmunológica cornos e describe en la presente. Una proteina o polipéptido "inmunogénicos", como se usa en la presente, incluyen la secuencia de extensión total de la proteina de enlace de plasmina de GapC en cuestión, o CAMP-3, con o sin la secuencia de señal, región de anclaje de membrana y/o región de enlace de plasmina, análogos o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Por "fragmento inmunogénico" se quiere decir un fragmento de una proteína de enlace de plasmina de GapC que incluye uno o más epitopes y provoca así la respuesta inmunológica descrita en la presente. Dichos fragmentos pueden ser identificados usando numerosas técnicas de mapeo de epitopes, bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopes lineales pueden ser determinados por ejemplo, sintetizando concurrentemente gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula proteínica, y haciendo reaccionar a los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están aún fijados a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en el arte y descritas en, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,708,871; Geysen y colaboradores (1984) Proc. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002;Geysen y colaboradores (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, todas incorporadas íntegramente a la presente como referencia. De manera similar, epitopes conformacionales son identificados fácilmente al determinar la conformación espacial de aminoácidos tal como, por ejemplo, cristalografía por rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional . Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Pueden identificarse también las regiones antigénicas de proteínas usando gráficas de hidropatía y de antigenicidad estándares, tales como las calculadas usando, por ejemplo el programa Omega versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa de cómputo emplea el método de Hop/Woods, Hopp y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci USA (1981) 78: 3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte y colaboradores, J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para gráficas de hidropatía. Las Figuras 8 a 12 de la presente exponen perfiles de Kyte-Doolittle para proteínas representativas abarcadas por la invención. Los fragmentos inmunogénicos, para propósitos de la presente invención, incluirán usualmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, y más preferiblemente 25 o más aminoácidos, de la molécula de la proteína de enlace de la plasmina de GapC. No hay límite superior crítico a la extensión del fragmento, el cual puede comprender casi la extensión total de la secuencia proteínica, o igualmente una proteína d efusión que comprende dos o más epítopes de GapC. Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende una molécula antigénica donde la administración de la composición a un sujeto da como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune celular y/o una humoral a la molécula antigénxca de interés. Por "composición de vacuna subunitaria'' se quiere decir una composición que contenga al menos un polipéptido inmunogénico, pero no todos los antigenos, derivados de o homólogos a un antigeno de un patógeno de interés. "Una composición tal está substancialmente libre de células o partículas del patógeno intacto, o el lisado de dichas células o partículas. Así, una "composición de vacuna subunitaria" se prepara desde al menos polipéptidos inmunogenicos parcialmente purificados (preferiblemente substancialmente purificados) del patógeno, o análogo recombinante del mismo. Una composición de vacuna subunitaria puede comprender la subunidad del antigeno o antigenos de interés substancialmente libre de otros antigenos o polipéptidos del patógeno . Por "aceptable farmacéuticamente" o "aceptable farmacológicamente" se quiere decir, un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede ser administrado a un individuo en una formulación o composición sin causar cualquier efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la cual está contenida. Una "respuesta inmune" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune mediada por anticuerpo y/o celular a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una "respuesta inmune" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares/ células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T ?d, dirigidas específicamente a un antigeno o antigenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped presentará ya sea una respuesta inmunológica protectora o terapéutica tales como la resistencia de la glándula mamaria a nueva infección será mejorada y/o la severidad clínica de la enfermedad será reducida. Dicha protección será demostrada ya sea por una reducción o falta de síntomas normalmente presentados por un huésped infectado y/o un tiempo de recuperación más rápido. Por winmunización de ácido nucleico", se quiere decir, la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica a uno o más antígenos seleccionados en una célula huésped, para la expresión in vivo de un antígeno, antígenos, un epítope o epítopes. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente en un sujeto recipiente, tal como por administración por inyección, inhalación, oral, intranasal, y mucósica, o las similares, o puede ser introducida ex vivo, en células que han sido removidas del huésped. En este caso, las células transformadas son reintroducidas en el sujeto en el que puede montarse una respuesta inmune contra el antigeno codificado por la molécula de ácido nucleico. El término ^tratamiento" como se usa en la presente se refiere ya sea a (1) la prevención de infección o reinfección (profilaxis) , o bien (2) la reducción o eliminación de síntomas de la enfermedad de interés (terapia) . Por ^mastitis", se quiere decir una inflamación de las glándulas mamarias en mamíferos, incluyendo en vacas, ovejas, cabras, puercas, yeguas, y las similares, causada por la presencia de S. uberis. La infección se manifiesta por la infiltración de células fagocíticas en la glándula. De manera general, se reconocen 4 tipos clínicos de mastitis: (1) per aguda, asociada con hinchazón, calor, dolor, y secreción anormal en la glándula y acompañado por fiebre y otros signos de perturbación generalizada, tales como depresión marcada, pulso débil rápido, ojos hundidos, debilidad y anorexía completa; (2) aguda, con cambios en la glándula similar a las anteriores pero donde la fiebre, anorexia y depresión son ligeras a moderadas; (3) sub-aguda, donde ningún cambio generalizada se presentan y los cambios en la glándula y su secreción son menos marcados; y (4) subclínicos, donde la reacción inflamatoria es detectable solamente por medio de pruebas estándares para mastitis . Las pruebas estándares para la detección de mastitis incluyen pero no se limitan a, la Prueba de Mastitis California, la Prueba de Mastitis Wisconsin, la Prueba de Nagasa, el conteo celular electrónico y los conteos de células somáticas usados para detectar un contenido de células sanguíneas blancas alto muy persistente en leche . En general, un conteo celular somático de aproximadamente 300,000 a aproximadamente 500,000 células por mi o más alto, en leche indicará la presencia de infección. Así, una vacuna, se considera efectiva en el tratamiento y/o prevención de mastitis cuando, por ejemplo, el conteo de células somáticas en leche se retiene inferior a aproximadamente 500,000 células por mi. Para una discusión de mastitis y el diagnóstico de la misma, - ver, por ejemplo, The Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian, Merck & Co., Rahway, New Jersey, 1991. Por los términos "vertebrado", "sujeto", y "sujeto vertebrado" se quiere decir cualquier miembro del subphylum Chordata, incluyendo, sin limitación, mamíferos tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras, caballos, y humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo las aves domésticas, de juego y salvajes tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos, y otras aves gallináceas; y peces. El término no denota una edad particular. Asi, tanto animales adultos como neonatos, asi como también se pretende cubrir fetos. Una molécula de "acido nucleico" puede incluir, pero no limitarse a, secuencias procarióticas, secuencias de mRNA eucariótico, de cDNA de mRNA eucariótico, de DNA genómico de DNA eucariótico (por ejemplo, mamíferos) , e igualmente secuencias de DNA sintético. El término también captura secuencias que incluyen cualquiera de las bases análogas de DNA y KNA conocidas . Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico separada y discreta del organismo completo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza; o una molécula de ácido nucleico desprovista total o parcialmente, de secuencias asociadas normalmente con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tenga secuencias heterólogas (como se definen posteriormente) en asociación con ésta. El término "aislado" en el contexto de un polinucleótido quiere decir que el polinucleótidos es aislado del cromosoma con el cual está normalmente asociado, y es aislado de la secuencia genómica completa en la cual se encuentra normalmente. "Polinucleótido purificado", se refiere a un polinucleótido de interés o fragmento de los mismos que sean esencialmente libres, por ejemplo, que contengan menos de aproximadamente 50 %, preferiblemente menos de aproximadamente 70 %, y más preferiblemente menos de aproximadamente 90 %, de la proteína con la cual el polinucleótido está asociado naturalmente. Las técnicas para purificar polinucleótidos de interés son bien conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, disrupción de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y separación de los polinucleótidos y proteínas por cromatografía por intercambio iónico, cromatografía por afinidad y sedimentación conforme a la densidad. Una "secuencia que codifica" o una "secuencia de nucleótidos que codifica" a una proteína particular, es una secuencia de nucleótidos que es transcrita y trasladada en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por medio de un codón de inicio en el terminus 5' (amino) y un codón de detención de transducción en el terminus 3' (carboxi) . Una secuencia codificadora puede incluir, pero no limitarse a, secuencias procarióticas, secuencias de cDNA de mR A eucariótico, de DNA genómico de DNA eucariótico (por ejemplo mamíferos) , e igualmente secuencias de DNA sintético. Una secuencia de terminación de transcripción se localizará usualmente en 3' en la secuencia codificadora. Una secuencia complementaria" es una en la cual la base nitrogenosa en una posición del nucleótido dada es el complemento de la base nitrogenosa que aparece en la misma posición en la secuencia de referencia. Para ilustrar, el complemento de adenosina, es tirosina, y viceversa; de manera similar, la citosina es complementaria a la guanina, y viceversa; puesto que el complemento de la secuencia 5' -ATGCTGA-3' de referencia seria 5' -TACGACT-3' . Una secuencia de "tipo salvaje" o "nativa", como se usa en la presente, se refiere a secuencias que codifican a polipéptido que están esencialmente como se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, secuencias que codifican a la proteina de GapC de S. dysgalactiae, expuestas en las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) . ' Recombinante" se usa en la presente para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucléotido de origen genómico, de cDNA, semisintético, o sintético el cual, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción del polinucléotido con el cual está asociado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteina o polipéptido quiere decir un polipéptido producido por expresión de un polinucléotido recombinante. "Células huéspedes recombinantes", "células", ""líneas celulares", cultivos celulares" y otros términos tales que denotan microorganismos proca ióticos o líneas celulares eucarióticas cultivadas como entidades unicelulares, se usan indistintamente, y se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como recipientes para vectores recombinantes u otro DNA de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se comprende que la progenie de una célula parenteral única puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en el complemento de DNA total o genómico al progenitor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parenteral que sea suficientemente similar al progenitor a ser caracterizado por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido deseado, está incluidos en la progenie de esta definición, y están cubiertos por los términos anteriores. "Homología, se refiere a por ciento de similaridad entre dos polinucleótídos o dos porciones de polipéptidos . Dos DNA, o dos secuencias de polipéptidos son "substancialmente homologas" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos 80 % - 85 %, preferiblemente al menos aproximadamente 90 , y más preferiblemente al menos aproximadamente 95 %- 98 % de similaridad o identidad de secuencias en una extensión definida de las moléculas . Como se usa en la presente, substancialmente homólogos se refiere también a secuencias que muestran identidad completa a la secuencia de polipéptido o de DNA especificadas. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia nucleótido a nucleótido o aminoácido a amanoácido exacta de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos , respectivamente. El por ciento de identidad puede ser determinado por medio de una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas por alineación de secuencias, contando el número exacto de parejas entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la extensión de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Pueden usarse programas de cómputo disponibles fácilmente, para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M. 0. en Atlas of Protein Sequence and Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. el cual adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2: 484-489 por análisis peptídico. Los programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también dependen del algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas son utilizados fácilmente con los parámetros faltantes recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package, mencionado anteriormente. Por ejemplo, por ciento de identidad de una secuencia de nucleótidos particular a una secuencia de referencia puede determinarse usando el algoritmo d ehomologia de Smith y Waterman con una tabla de calificación de faltantes y un espacio de penalización de seis posiciones de nucleótidos.

Otro método de establecer el por ciento de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH de programas con derechos de propiedad por la University of Edimburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain Vie , CA) . De esta adaptación de paquetes puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman donde se usan los parámetros faltantes para la tabla de calificaciones (por ejemplo, espacio de penalización abierto de 12, espacio de penalización de extensión de uno, y un espacio de 6) . De los datos generados el valor de "parejas" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o de similaridad entre secuencias son generalmente conocidos en el arte, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros faltantes. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden ser usados, usando los parámetros faltantes siguientes : código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; Bases de datos= no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de GenBank CDS + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de internet: http:// www. ncbi. nlm. gov/ cgi- bin/ BLAST. Alternativamente, la homología puede ser determinada por hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman duplejos estables entre regiones homologas, seguido por la digestión con nucleasas específicas de una sola hebra, y la determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA que son substancialmente homologas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones de severidad, como se define para ese sistema particular. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está en la experiencia en el arte. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra; DNñ. Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Por el término "variante degenerada" se quiere decir un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácidos nucleicos del mismo, que codifica a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del cual se deriva la variante degenerada. Las técnicas para determinar la "similaridad" de secuencia de aminoácidos son bien conocidas en el arte. En general, "similaridad" significa la comparación exacta de aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, donde los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades físicas y/o químicas similares tales como carga o hidrofobicidad. Un término como "por ciento de similaridad" puede entonces ser determinado entre las secuencias de polipéptidos comparadas. Las técnicas para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos u de ácidos nucleicos también con conocidas en el arte e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos de mRNA para ese gen (usualmente vía el cDNA intermediario) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada asi, y comparar ésta a una segunda secuencia de aminoácidos. En general, "identidad", se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente.

Una región "heteróloga" de una construcción de DNA es un segmento identificable de DNA en o fijada a otra molécula de DNA que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Asi, cuando la región heteróloga codifica a un gen bacteriano, el gen estará usualmente flanqueado por DNA que no esta flanqueado por el gen bacteriano en el genoma de la bacteria fuente . Otro ejemplo de la secuencia codificadora heteróloga es una construcción donde la secuencia codificadora misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . Variaciones alélicas o eventos mutacionales que ocurren de manera natural no dan origen a una región heteróloga de DNA, como se usa en la presente. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al cual otro segmento de DNA puede ser fijado para llevar aproximadamente la replicación del segmento fijado. Un vector es capaz de transferir secuencias genéticas a células objetivo (por ejemplo, vectores plásmidos bacterianos, vectores virales, vectores no virales, portadores en forma de partículas, y liposornas) . Típicamente los términos "construcción de vector", "vector de expresión", "vector de expresión genética", "vector de liberación genética", y "cassette" de expresión, se refieren todos a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. Así, el término incluye clonación y vehículos - de expresión, así como también vectores virales. Estos conjuntos incluyen un promotor, el cual está operablemente unido a las secuencias o genes de interés . Otros elementos de control pueden estar presentes también. L expresión "cassettes" descrita en la presente puede estar contenida en una construcción de plásmido. Además de los componentes del "cassette" de expresión, la construcción de plásmido puede también incluir un origen de replicación bacteriano, uno o más marcadores seleccionables , una señal que permita a la construcción de plásmido existir como un DNA de una sola hebra (por ejemplo un origen de replicación M13)., un sitio de clonación múltiple, y un origen de replicación de "mamífero" (por ejemplo un origen de replicación de SV40 o de adenovirus) . "Elementos de control" de DNA se refieren colectivamente a promotores de transcripción, elementos mej oradores de transcripción, secuencias de terminación de transcripción, secuencias de poliadenilación (localizadas en 3' en el codón de detención de traslación) , secuencias para optimización de la iniciación de traslación (localizadas en 5' en la secuencia codificadora) , secuencias de terminación de traslación, regiones reguladoras desde el extremo 5F al 3', sitios de enlace de ribosoma, y los similares, que se proporcionan colectivamente para la transcripción y traslación de una secuencia codificadora en una célula huésped. Ver por ejemplo, McCaughan y colaboradores (1995) PNAS USA 92: 5431-5435; Kochetov y colaboradores (1998) FEBS Letts . 440: 351-355. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes en un vector recombinante siempre que el gen deseado sea capaz de ser transcrito y trasladado . "Operablemente unido", se refiere a una distribución de elementos en donde los componentes asi descritos están configurados de modo de efectuar su función usual. Asi, los elementos de control operablemente unidos a una secuencia codificadora son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificadora. Los elementos de control no necesitan ser contiguos con la secuencia codificadora, con tal de que funcionen para dirigir la expresión de ésta. Asi, por ejemplo, las secuencias transcritas aún sin trasladar que intervienen pueden estar presentes entre un promotor y la secuencia codificadora y el promotor puede aún ser considerado "operablemente unido" a la secuencia codificadora. De manera similar, "elementos de control compatibles con la expresión en un sujeto" son aquellos que son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificadora en ese sujeto. Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia codificadora en una célula cuando el DNA polimerasa enlazará al promotor y transcribirá a la secuencia codificadora en mRNA, la cual es trasladada en el polipéptido codificado por la secuencia codificadora. Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de transformación, por medio de una molécula de ácido nucleico exógena. Una célula has sido ??transformada" por DNA exógeno cuando el DNA exógeno ha sido introducido en el interior de la membrana celular. El DNA exógeno puede ser o no integrado (unido covalentemente) al DNA cromosómico formando el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el DNA exógeno puede ser mantenido sobre un elemento episómico, tal como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula transformada establemente es una en la cual el DNA exógeno se ha integrado al cromosoma de modo que sea heredado por la célula hija por medio de la replicación cromosómica. Esta estabilidad es demostrada por la habilidad de la célula eucariótica para establecer lineas celulares o los clones comprendidos de una población de células hijas que contienen el DISTA exógeno .

MODALIDADES PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Antes de describir la invención en detalle, se comprende que esta invención no se limita a formulaciones o parámetros de proceso particulares que pueden por supuesto variar. Se comprende también que la terminología usada en la presente es con el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se pretende que sea limitante. Aunque pueden usarse en la práctica de la presente invención numerosos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, se describen en la presnente los materiales y métodos preferidos. Lo más importante de la presente invención es el descubrimiento de que la proteina de GapC, en combinación con una proteína quimérica de CAMP, es capaz de provocar una respuesta inmune en un sujeto vertebrado. En particular, los genes para la proteína de GapC en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis, y S. iniae han sido aislados, secuenciados y caracterizados, y las secuencias proteínicas para los genes han sido deducidas de los mismos. Las secuencias de DNA completas para los genes y las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran en las Figuras 1 a 5. como se describe en los ejemplos, el gen gapC de S. dysgalactiae de extensión total, presentado en las posiciones de los nucleótidos 1-1011, inclusive, de las Figuras 1A-1B codifican a la proteina de GapC de S. dysgalactiae de extensión total de 336 aminoácidos, mostrada como los aminoácidos 1 - 336 inclusive, de la misma figura. GapC de S. dysgalactiae tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 36 kDa (calculado usando el programa Peptide Sort de la GCG Wisconsin Package, versión 10, proporcionado por el paquete para análisis de secuencias SeqWeb, versión 1.1 de la Canadian Bioinformatic Resource) . De manera similar, los genes gapC aislados de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se exponen en las Figuras 2 hasta 5; cada uno codifica a una proteina de GapC .de extensión total también de 336 aminoácidos, cada una que tiene también un peso molecular predicho de aproximadamente 36 kDa. Ninguna de las secuencias de extensión total parece incluir un péptido de señal o una región de anclaje de membrana. Las Figuras 6 y 7 muestran una alineación de secuencias de aminoácidos y de DNA, respectivamente, que muestra regiones d ehomología y variabilidad que existen entre las proteínas de GapC de varias cepas de streptococci . En particular, varias regiones variables se localizan en las posiciones de los aminoácidos 62 a 81; 102 a 112; 165 a 172; 248 a 271; y 286 a 305. Dichas regiones variables son típicamente más conducibles a cambio. Por consiguiente, son igualmente tolerados los cambios de aminoácidos en estas regiones, tales como substituciones, adiciones y eliminaciones. Las Figuras 8 hasta la 12 muestran gráficas de lo siguiente, para cada una de las proteínas de GapC de la presente invención: hidropatía de Kyte-Doolittle (promediado en una ventana de 7) , probabilidad de superficie de Emini, flexibilidad de cadena de Karplus-Schulz, índice antigénico de Jameson-Wolf; estructura secundaria de conformidad con Garnier-Osguthorpe-Robson estructura secundaria de de Chou-Fasman; y sitios de glicosilación predichos. Las Figuras 13 hasta la 17 muestran gráficas de estructura secundaria de conformidad con Chou-Fasman para cada una de las proteínas de GapC de la presente invención. Un experto en la materia puede fácilmente usar la información presentada en las Figuras 8 a 17 para determinar regiones inmunogénicas en la proteína para uso en composiciones de vacunas. Una proteína de CAMP quimérica, denominada "CAMP-3" en la presente, se muestra en las posiciones 27-314 de la Figura 29. Los aminoácidos 1-26 de la Figura 29 representan la secuencia de señal LipoF de E. coli. Los aminoácidos 27-86 en la Figura 29 corresponden a los aminoácidos 1- 60 de CAMP maduro de S. uberis nativo, maduro. El aminoácido 87 es un aminoácido enlazador. Los aminoácidos 88-144 de la Figura 29, corresponden a los aminoácidos 2-58 de la secuencia del factor CAMP de S. agalactiae nativo, maduro. Los aminoácidos 145 y 146 de la Figura 29 son aminoácidos espaciadores. Los aminoácidos 147-314 mostrados en la Figura 29, corresponden a los aminoácidos 63-230 de la secuencia del factor CAMP de S. uberis nativo, maduro. Así, la quimera mostrada en la Figura 29 incluye una estructura principal de S. uberis nativo, maduro con un epítope de la secuencia N- terminal del factor CAMP de S. agalactiae insertada en ella. Las proteínas varias de enlace de plasmina de GapC, variantes o muteínas de éstas, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o proteínas quiméricas que la incluyan, pueden ser proporcionadas en combinación con CAMP-3, o un polipéptido inmunogénico substancialmente homólogo y equivalente funcionalmente (como se define anteriormente) a CAMP-3, en composiciones subunitarias de vacunas. Además, las proteínas o anticuerpos de éstos pueden ser usados como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia de infección en un sujeto vertebrado. De manera similar, los genes que codifican a las proteínas pueden ser clonados y usados para diseñar sondas para detectar y aislar genes homólogos en otras cepas bacterianas. Por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos aproximadamente 8 nucleótidos, preferiblemente 15-20 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 nucleótidos, y más preferiblemente aproximadamente 60-100 nucleótidos, o cualquier entero entre estos valores, encontraran uso en estas modalidades. Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden ser usadas para tratar o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas en sujetos vertebrados. Por ejemplo, composiciones de vacunas que incluyen polipéptidos de C¾MP-3 y proteínas de enlace de plasmina de GapC de S. áysgalactiae, S. uberis, S. paxauberis, S. iniae, y/o streptococcí del grupo B (GBS) tales como S. agalactiae, pueden ser usados para tratar infecciones estreptocócicas en sujetos vertebrados, las cuales son causadas por éstas u otras especies . En particular, S. uberis y S. agalactiae son patógenos bacterianos comunes asociados con mastitis en especies bovina, equina, ovina y caprinas. Adicionalmente, estreptococci del grupo B, tales como S. agalactiae, son conocidos por causar otras numerosas infecciones en vertebrados, incluyendo septicemia, meningitis, bacteremia, impétigo, artritis, infecciones del tracto urinario, abcesos, aborto espontáneo, etc. Por consiguiente, composiciones de vacuna que contienen proteínas de enlace de plasmina de GapC encontrarán uso en tratar y/o prevenir una amplia variedad de infecciones estreptocócicas . De manera similar, proteínas de enlace de plasmina de GapC derivadas de otro género bacteriano tal como Staphylococcus, Mycobacteiríum, Bscherichiar Pseudomonas, Nocardia, Pasterurella, Clostridíum y Mycoplasma encontraran uso con polipéptidos de CI¾MP-3 para tratar infecciones bacterianas causadas por especies que pertenezcan a estos géneros. Por consiguiente, es fácilmente obvio que proteínas de enlace de plasmina de GapC en combinación con CAMP-3 pueden ser usadas para tratar y/o prevenir una amplia variedad de infecicones bacterianas en numerosas especies. Las proteínas de enlace de plasmina de GapC estreptocócica y los polipéptidos de CÜMP-3 pueden ser usados en composiciones de vacuna ya sea solos o en combinación con otros antígenos bacterianos, fúngicos, virales o de protozoarios . Estos antígenos pueden ser proporcionados separadamente o igualmente como proteínas de fusión que comprenden uno o más epítopes de una proteína de enlace de plasmina de GapC fusionada a uno o más de estos antígenos. Por ejemplo, otras proteínas inmunogénicas de S. uberis, tales como el factor CfiMP, cápsula de ácido hialurónico, híaluronidasa, proteína similar a R y activador de plasminógeno, pueden ser administrados junto con la proteína de GapC y el polipéptido de CAMP-3. Adicionalmente, proteínas inmunogénicas de otros organismos involucrados en mastitis, tales como del género Staphylococcusr Corynebacterium, Pseudomonasf Nocardia, Clostridium, Mycobacterium, Mycoplasma Pasteurella, Prototheca, otros streptococci, bacterias coliformes, así como también levaduras, pueden ser administradas junto con el polipéptido de CAMP-3 y las proteínas de enlace de plasmina de GapC descritos en la presente para proporcionar un amplio espectro de protección. Así, por ejemplo, proteínas inmunogénicas de Staphylococcus aureus, Str. Agalactiae Str. Dysgalactiae, Str. Zooepidemicus, Corynej acterium pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridium perfríngensr Escherichla col!, enterobacter aerogenes y Klebsíella spp. Pueden ser proporcionadas junto con las proteínas de enlace de plasmina de GapC y CAMP-3 de la presente invención. Adicionalmente, proteínas de GapC de diferentes especies estreptocócicas pueden ser usadas juntas en las composiciones de vacuna de la presente invención. En esta modalidad, las proteínas de GapC múltiples pueden ser proporcionadas como proteínas de fusión o como antígenos discretos en composiciones de vacunas iguales o diferentes . Producción de Proteínas de Enlace de Flasmina de GapC Las proteínas de enlace de plasmina anteriormente descritas y los fragmentos activos, análogos y proteínas quiméricas derivadas de las mismas, pueden ser producidas por medio de una variedad de métodos . Específicamente las proteínas de enlace de plasmina de GapC pueden ser aisladas directamente de bacterias que las expresen. Esto se logra generalmente preparando primero un extracto crudo que carezca de componentes celulares y varias proteínas extrañas. Las proteínas deseadas pueden entonces ser purificadas adicionalmente desde la fracción del lisado celular por, por ejemplo, cromatografía de columna, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes u otros métodos convencionales bien conocidos en el arte. Más particularmente, se han descrito técnicas para aislar proteínas de enlace de plasmina de GapC. Por e emplo, la proteína de GapC de S. pyogenes fue purificada desde un extracto celular crudo por precipitación con sulfato de amonio, seguido por dos ciclos de cromatografía hasta una columna Mono FPLC, y ciclos únicos hasta columnas de Superóse 12 FPLC, y TSK-fenol de HPLC (Pancholi, V. y Fischetti, VA (1992] J. Exptl. Med. 76: 415-426) . Otra técnica involucra el uso. de una columna de afinidad de NAD+ agarosa para purificar GapC desde protoplastos Usados de S. Pyogenes cepa 64/14 (Winram, SB y Lottenberg, R. (19969 Microbiol. 142: 2311-2320) . Alternativamente, las proteínas pueden ser producidas recombinantemente como se describe en la presente. Como se explicó anteriormente, estos productos recombinantes pueden tomar la forma de secuencias de proteína parciales, secuencias de extensión total, formas precursoras que incluyen secuencias de señal, formas maduras sin señal, o igualmente proteínas d efusión (por ejemplo, con un líder apropiado para el huésped recombinante, o con otra secuencia antigénica subunitaria para Streptococcus u otro patógeno) . En una modalidad de la presente invención, las proteínas de GapC son fusionadas a una histidina marcada, producida por medios recombinantes, y luego son purificadas desde una fracción de lisado celular usando cromatografía por afinidad. Ver los ejemplos. Las proteínas de enlace de plasmina de GapC de la presente invención pueden ser aisladas con base en la habilidad de los productos proteínicos para enlazar plasmina, usando ensayos de enlace de plasmina como se describen posteriormente. Ver, por ejemplo, el método descrito en los ejemplos. Así, bibliotecas genéticas pueden ser construidas y los clones resultantes pueden usarse para transformar una célula huésped apropiada. Las colonias pueden ser conjuntadas y cribadas por clones que tengan actividad de enlace de plasmina. Las colonias pueden también ser cribadas usando suero policlonal o anticuerpos monoclonales para la proteina de enlace de plasmina. Alternativamente, una vez que se determinaron las secuencias de aminoácidos, las sondas de oligonucleotidos que contienen los codones para una porción de las secuencias de aminoácidos determinadas pueden ser preparadas y usadas para cribar bibliotecas de cDNA o genómico para genes que codifican a las proteínas sujeto. Las estrategias básicas para preparar sondas de oligonucleotidos y bibliotecas de DNA, así como también sus cribados por hibridación de ácido nucleico, son bien conocidos por los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, DNA: Cloning: Vbl. II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook y colaboradores, supra. Una vez que un clon de la biblioteca cribada ha sido identificado por hibridación positiva, puede ser confirmado por análisis enzimático de restricción y secuenciación del DNA que el inserto d ela biblioteca particular que contiene el gen de la proteína de enlace de plasmina de GapC o un homólogo del mismo. Los genes pueden entonces ser aislados adicionalmente usando técnicas estándares y, si se desea, procedimientos d ePCR o de enzimas de restricción empleadas para eliminar porciones de la secuencia de extensión total. De manera similar, los genes pueden ser aislados directamente de la bacteria usando técnicas conocidas, tales como extracción en fenol, y la secuencia puede ser adicionalmente manipulada para producir cualquier alteración deseada. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar el DNA. Alternativamente, secuencias de DNA que codifican a las proteínas de interés pueden ser preparadas sintéticamente en vez de clonadas. Las secuencias de DNA pueden ser diseñadas con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular. En general, uno seleccionará codones preferidos para el huésped pretendido si la secuencia será usada para expresión. La secuencia completa es conjuntada de oligonucleótidos sobrepuestos preparados por métodos estándares y conjuntados en una secuencia codificadora completa. Ver, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair y colaboradores (1984) Science 223:: 1299; Jay y colaboradores (1984) J. Biol. Chem., 259: 6311. Una vez que las secuencias codificadoras para las proteínas deseadas han sido preparadas o aisladas, pueden ser clonadas en un vector o replicón cualquiera. Se conocen en el arte numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es un tema de selección. Ejemplos de vectores de DNA recombinantes para clonar y células huéspedes que los puedan transformar incluyen el bacteriófago X[E. coli) , pBR322 [E. col!) , pACYClW (E. coli), pKT230 (bacteria gram-negativa) , pGV1106 (bacteria gram-negativa), pLAFRl (bacteria gram-negativa) , pME290 (bacteria gram-negativa no de E. coli) , pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis) , pBD {Bacillus) , pIJ61 (Streptomyces) , pUC6 (Streptomyces) , Yip5 [Saccharo yces) , YCpl9 [Saccharomyces) y virus de papiloma bovino (células de mamifero) . Ver, Sambrook y colaboradores, supra; DNA Cloning, supra; B. Perbal, supra. El gen puede ser puesto bajo el control de un promotor, sitio de enlace de ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (mencionados colectivamente en la presente como elementos "control") , de modo que la secuencia de DNA que codifica a la proteina deseada sea transcrita en REA en la célula huésped transformada por un vector que contenga esta construcción de expresión. La secuencia codificadora puede contener o no un péptido de señal o secuencia líder. Si se incluye una secuencia de señal, puede ser ya sea nativa o bien secuencia homologa, o secuencia heteróloga. Las secuencias líderes pueden ser removidas por el huésped en procesamiento post-traslacional . Ver por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Pueden también ser deseables otras secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de proteina en relación al crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la materia, y los ejemplos incluyen aquellas que causan la expresión de un gen a ser activado o desactivado en respuesta a un estimulo quimico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Pueden estar presentes en el vector otros tipos de elementos reguladores, por ejemplo, secuencias mej oradoras. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden estar ligadas a la secuencia codificadora antes de la inserción en un vector, tales como los vectores de clonación descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificadora puede ser clonada directamente en un vector de expresión, el cual ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado. En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia codificadora de modo que pueda ser fijada a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, mantener el marco de lectura apropiado. Puede también ser deseable producir imitantes o análogos de la proteina de enlace de plasmina de GapC. Los imitantes o análogos pueden ser preparados por la eliminación de una porción de la secuencia codificadora de la proteina, por inserción de una secuencia, y/o por substitución de uno o más nucleótidos en la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio, se describen en, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. El vector de expresión es entonces usado para transformar una célula huésped apropiada. Numerosas lineas celulares de mamíferos son conocidas en el arte e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles de American Type Culture Collection (ATCC) , tales como, pero no limitándose a, células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, -Hep G2) , células de riñon de bovino de Madin-Darby ("MDBK") , así como también otros. De manera similar, huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp. , encontrarán uso con la construcción de expresión de la presente. Levaduras huéspedes útiles en la presente invención incluyen ínter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida alhicans, Hansenula polymorpha, Kluyvero yces fragilisr Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii , Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia liplytica. Células de insectos para uso con vectores de expresión baculovirus incluyen nter alia, Redes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogasterr Spodopera frugiperda, y Txichoplusia ni. Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención son producidas al cultivar células huéspedes transformadas por medio de un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones con las cuales la proteína de interés es expresada. La proteína es entonces aislada de las células huéspedes y purificada. Si el sistema de expresión secreta la proteína en el medio de desarrollo, la proteína puede ser purificada directamente desde el medio. Si la proteína es aislada desde lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y de los métodos de recuperación está en la experiencia en el arte. Las proteínas de la presente invención pueden también ser producidas por medio dé síntesis química como una síntesis peptídica en fase sólida, usando secuencias d e aminoácidos o derivados de secuencias de aminoácidos desde la secuencia de DNA de los genes de interés. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), página 3-254, para técnicas de síntesis peptídica en fase sólida; y M. Mondansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntesis en solución clásica. La síntesis química de péptidos puede ser preferible si un fragmento pequeño del antxgeno en cuestión es capaz de aumentar una respuesta inmunológica en el sujeto de interés. Las proteínas de enlace de plasmina de GapC de la presente invención, o sus variantes o fragmentos, pueden usarse para producir anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales . Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) es inmunizado con un antígeno de la presente invención, o sus fragmentos, o un antígeno mutado. El suero del animal inmunizado es coleccionado y es tratado de conformidad con los procedimientos conocidos. Ver, por ejemplo, Jurgens y colaboradores (1985) J. Chrom. 348: 363-370. Si se usa el suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden ser purificados por cromatografía por inmunoactividad, usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales a las proteínas de enlace de plasmina de GapC y a los fragmentos de las mismas, pueden ser producidas fácilmente por un experto en el arte. La metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales por medio del uso de la tecnología del hibridoma, es bien conocida. Pueden crearse líneas celulares que producen anticuerpos inmortales por medio de fusión celular, y también por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Ver, por ejemplo, M. Schreirer y colaboradores, Hybridoma Techniques (1980) ; Hammerling y colaboradores, Monoclonal Antibodies ' and T-cell Hybridomas (1981); Kennett y colaboradores, Monoclonal antibodies (1980) ; ver también las Patentes U.S. Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,782;4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491, 632; y 4, 493, 890.Los grupos de anticuerpos monoclonales producidos contra las proteínas de enlace de plasmina de GapC, o fragmentos de los mismos, pueden ser cribados por varias propiedades; es decir, por isotipo, epítope, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles en purificación, usando técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales contra los cuales están dirigidos. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales pueden usarse para inmunización pasiva o pueden combinarse con preparaciones subunitarias de vacunas para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos monoclonales y policlonales son también útiles para propósitos de diagnóstico. Producción de Quimeras del Factor CAMP Los polipéptidos de CAMP-3 son producidos convenientemente usando técnicas recombinantes estándares, como se describe anteriormente y en los ejemplos. Las quimeras del factor CAMP pueden ser probados por actividad de CAMP usando cualquiera de varias pruebas estándares. Por ejemplo, son conocidos los factores CAMP por presentar ácción litica sobre una variedad de células objetivo incluyendo eritrocitos ovinos y bovinos. Asi, un método conveniente para probar por actividad de factor CAMP utiliza reacciones hemolíticas estándares usando eritrocitos bovino u ovino. Ver, por ejemplo, Christie y colaboradores (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sci. 22: 197-200; brown y colaboradores (1974} Infect. Immun. 9: 377-383; Darling C. L. (1975) J. Clin. Microbiol. 1: 171; Wilkinsin, H. W. (1977) J. Clin. Microbiol. 6: 42; Bernheimer y colaboradores (1979) Infect. Immun. 23: 838-844; Skalka, B. y Smola, J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., 1. abt. Orig. A24 : 190-194; Huser y colaboradores (1983) J.

Gen. Microbiol. 129: 1295. La actividad puede también ser probada monitoreando la liberación de moléculas marcadoras atrapadas desde liposomas elaborados de materiales susceptibles a disrupcion por factores de CAMP. Por ejemplo, la actividad de CAMP puede ser monitoreado usando liposomas que contengan [14C] glucosa preparados desde, por ejemplo, esfingomielina, colesterol y fosfato de dicetilo, y midiendo la liberación de [1C] glucosa atrapada debido a disrupcion de los liposomas por el factor CAMP. Ver, por ejemplo, Bernheimer y colaboradores (1979) Infect. Immun. 23: 838-844. de manera similar, la liberación de ATP desde los liposomas en la presencia del factor CAMP puede ser monitoreada como se describe en Sterzik y colaboradores (1984) wInteraction of the CAMP factor from S. agalactiae with artificial membranes" en: alou y colaboradores, eds . Bacterial protein toxins, London: Academic Press Inc., 1984: 195- 196; y Sterzik y colaboradores (1985) Zentralhl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. 1 Suppl . 15: 101-108. Ver también Fehrenbach y colaboradores (1984) "Intexaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificial membranes". En: Alouf y colaboradores, eds. Bacterial proteins toxins, London: Academic Pres Inc., 1984: 317-324. Formulaciones y Administración de Vacunas Los polipéptidos de CAMP-3 y las proteínas de enlace de plasmina de GapC, variantes y fragmentos de los mismos pueden ser formulados en composiciones inmunogénicas, tales como composiciones de vacuna, ya sea solos o en combinación con otros antígenos, para uso en la inmunización de sujetos como se describe posteriormente. Los métodos de preparar dichas formulaciones se describen en, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 18ava. edición, 1990) . Típicamente, las vacunas de la presente invención se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas . Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de inyección. La preparación puede también se emulsionada o el ingrediente activo puede ser encapsulado en vehículos de liposoma. El ingrediente inmunogénico activo es mezclado generalmente con un vehículo farmacéutico compatible, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o los similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes y agentes reguladores de pH. Adyuvantes que mejoran la efectividad de la vacuna, pueden también añadirse a la formulación. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos de muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA) , aceites, emulsiones de aceite en agua, saponinas, citoquinas, y otras substancias conocidas en el arte. Las proteínas pueden ser enlazadas a portadores a fin de incrementar la inmogenicidad de las mismas. Los portadores adecuados incluyen macromoléculas metabolizadas lentamente, grandes tales como proteínas, que incluyen albúminas de suero,' hemocianina de molusco barrenados, moléculas de inmunoglobuilina, tiroglobulina, ovalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la materia; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y los similares; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y los similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas virales inactivas. Las proteínas pueden ser usadas en su forma nativa o su contenido de grupos funcionales puede ser modificado por, por ejemplo, succinilación de residuos lisina o reacción con cis-tiolactona . Un grupo sulfhidrilo puede también ser incorporado en el portador (o antígeno) por, por ejemplo, reacción de las funciones aminoácido con 2-iminotiolano o el éster de 3- (4- ditiopiridil) propinonato de N- hidroxisuccinimida . Los portadores adecuados pueden ser modificados para incorporar ramales espaciadores (tales como exametilen diamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) por fijación de péptidos . otros portadores adecuados para las proteínas de la presente invención incluyen polipéptidos de rotavirus VP6, o fragmentos funcionales de los mismos, como se describe en la Patente U.S. No. 5,071,651, que se incorpora ala presente como referencia. También útil en un producto de fusión de una proteína viral y los inmunogenos del sujeto hecha por medio de métodos descritos en la Patente U.S. No. 4,722,840. Aún otros portadores adecuados incluyen células, tales como linfocitos, ya que la presentación en esta forma encubre el modo natural de presentación en el sujeto, lo cual da origen al estado inmunizado. De manera alternativa, las proteínas de la presente invención pueden ser acopladas a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos propios del sujeto. Los métodos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células son conocidos para los expertos en la materia. Además, las proteínas (o complejos de las mismas) pueden ser formuladas en composiciones inmunogénicas, tales como composiciones para vacunas o para diagnósticos, ya sea en forma neutra o de sales o ambas. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen sales de adición de ácido (formadas con grupos de aminoácidos libres de los polipéptidos activos) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y los similares. Las sales formadas de grupos carboxilicos libres pueden también derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino, etanol, istidina, procaina, y los similares. Las formulaciones para vacunas contendrán una '"cantidad efectiva terapéuticamente" del ingrediente activo, esto es, una cantidad capaz de provocar una respuesta inmune en un sujeto al cual se administró la composición. En el tratamiento y la prevención de mastitis, por ejemplo, ""una cantidad efectiva terapéuticamente" es preferiblemente una cantidad que mejora la resistencia de la glándula mamaria a nuevas infecciones y/o reduce la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demuestra ya sea por una reducción o falta de síntomas normalmente presentados por un huésped infectado, o bien por un tiempo de recuperación más rápido y/o conteo de células somáticas decreciente en leche de la región infectada. Por ejemplo, la habilidad de la composición para retener o llevar el conteo de células somáticas (SCC) en leche inferior a aproximadamente 500,000 células por mi, el ajuste a valor umbral por la "International Dairy Federation", sobre el cual se considera que los animales tienen mastitis clínica, será indicador de un efecto terapéutico. La cantidad exacta es fácilmente determinada por un experto en la materia usando las pruebas estándares. La concentración de la proteína de enlace de plasmina de GapC estará típicamente en el intervalo desde aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 % (en peso) de la composición. O aún superior o inferior si es apropiado. Con las formulaciones de vacuna de la presente, 5 a 500 ]ig de ingrediente activo por mi de solución inyectada sería adecuado para aumentar una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de 1 a 3 mi por animal. Para inmunizar a un sujeto, generalmente la vacuna es administrada parenteralmente, usualmente por inyección intramuscular. Sin embargo, otros modos de administración, tales como inyección subcutánea, intraperitoneal e intravenosa, son también aceptables. La cantidad a ser administrada depende del animal a ser tratado, de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección deseada. Dosificaciones efectivas pueden ser establecidas fácilmente por un experto en la materia por medio de ensayos de rutina estableciendo curvas de respuesta a las dosis. El sujeto es inmunizado por administración de la vacuna en al menos una dosis, y preferiblemente dos dosis. Además, puede administrarse al animal muchas dosis cuando se requiera mantener un estado de inmunidad a la infección. Formulaciones de vacuna adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones para aerosol, intranasales, orales, y formulaciones de liberación sostenida. Para supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes y portadores tradicionales, tales como, polialquilen glicoles, o triglicéridos . Dichos supositorios pueden ser formados desde mezclas que contengan el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 10 % (en peso) , preferiblemente aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 %. Los vehículos orales incluyen los excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y los similares. Estas composiciones de vacuna oral pueden ser tomadas en la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen desde aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 % del ingrediente activo, preferiblemente aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %.Las formulaciones intranasales incluirán usualmente vehículos que no causen irritación a la mucosa nasal ni perturben significativamente la función ciliar. Pueden emplearse diluyentes tales como agua, solución acuosa salina u otras substancias conocidas con la presente invención. Las formulaciones nasales pueden también contener conservadores tales como, pero no limitándose a clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un surfactante para mejorar la absorción de las proteínas del sujeto por la mucosa nasal. Formulaciones de liberación sostenida o controlada se elaboran incorporando la proteína en portadores o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbible tales como copolímeros de acetato de etilenvinilo y copolímeros de Hytrel®, polímeros esponjables tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tales como colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres tales como los usados para hacer suturas reabsorbibles . Las proteínas de enlace de plasmina de GapC pueden también ser liberadas usando minibombas implantadas, bien conocidas en el arte. Las proteínas de la presente invención pueden también ser administradas vía un virus portador que las exprese.

Los virus portadores que encontrarán uso con la presente invención incluyen pero no se limitan a la vaccinia y otros pox virus, adenovirus, y virus de herpes. A manera de ejemplo, virus recombinantes de vaccinía que expresan a las nuevas proteínas pueden ser construidos como sigue. El DNA que codifica a la proteína particular es primero insertado en un vector apropiado de modo que sea adyacente a un promotor de vaccinia y que flanquee a secuencias de DNA de vaccinia, tales como la secuencia codificadora de timidina quinasa (TK) . Este vector es entonces usado para transfectar células que son infectadas simultáneamente con vaccinia. La recombinación homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica a la proteína de la presente en el genoma viral. La TK recombinante resultante puede ser seleccionada al cultivar las células en la presencia de 5-bromodesoxiuridina y picar las placas virales resistentes a la misma. Una ruta alternativa de administración involucra terapia genética o inmunización del ácido nucleico. Así, secuencias de nucleótidos (y elementos reguladores que las acompañan) que codifican a las proteínas del sujeto pueden ser administradas directamente a un sujeto para traslación in vivo de las mismas. Alternativamente, la transferencia genética puede lograrse al transfectar las células o tejidos del sujeto ex vivo y al reintroducir el material transformado en la célula huésped. El DNA puede ser introducido directamente en el organismo huésped, es decir, por inyección (ver Publicación Internacional No. WO/90/11092; y Wolff y colaboradores (1990) Science 247: 1465-1468) . La transferencia genética mediada por liposoma puede lograrse también usando métodos conocidos. Ver, por ejemplo, Hazinski y colaboradores (1991) . J. Respir. Cell Mol. Biol. 4: 206- 209; Brigham y colaboradores (1989) Am. J. Med. Sci. 298: 278- 281; Canónico y colaboradores (1991) Clin. Res. 39: 219a; y Nabel y colaboradores (1990) Science 249: 1285- 1288. Agentes de terminación, tales como anticuerpos dirigidos contra antigenos de superficie expresados sobre tipos celulares específicos, pueden ser conjugados covalentemente a la superficie liposómica de modo que el ácido nucleico pueda ser liberado a tejidos y células específicas susceptibles a la infección. Depósitos de Cepas Útiles en la Práctica de la Invención Se hizo un depósito de cultivos puros biológicamente de las siguientes cepas, en la American Type Culture Collection, 10801 üniversity Boulevard, Manassas, Virginia, bajo las condiciones del Tratado de Budapest. El número de acceso indicado se signó después de probar la viabilidad exitosa, y gue fueron pagadas las cuotas requeridas . Los depósitos designados se mantendrán por un periodo de treinta (30) años desde la fecha del depósito, o por cinco (5) años después del último requerimiento por el depósito, cualquiera que sea más prolongado. Si un cultivo se volviera no viable o sea destruido inadvertidamente, o, en el caso de cepas que contengan plásmidos, perdieran su plásmido, será reemplazado con un cultivo viable de la misma descripción taxonómica. Deberá haber una discrepancia entre la secuencia presentada en la presente solicitud y la secuencia del gen de interés en el plásmido depositado debido a errores en la secuenciación rutinaria, la secuencia en los controles del plásmido depositado.

EXPERIMENTALES A continuación están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente como ilustrativos, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención de manera alguna. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero podrían, considerarse por supuesto, algún error y desviación experimental. Materiales y Métodos Las enzimas pueden adquirirse de fuentes comerciales, y se usaron de conformidad con las indicaciones del fabricante. En el aislamiento de fragmentos de DNA, excepto cuando se hace notar, todas las manipulaciones de DNA se hicieron de conformidad con los procedimientos estándares . Ver, Sambrook y colaboradores, supra. Las enzimas de restricción, T4 DNA ligasa, E. coli, DNA polimerasa II, fragmento de Klenow, y otros reactivos biológicos pueden adquirirse de proveedores comerciales y usados de conformidad con las indicaciones del fabricante.

Fragmentos de DNA de doble hebra se separaron sobre geles de agarosa. Las fuentes para los reactivos químicos generalmente incluyen Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; Alrich, Mil aukee, WI; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN. EJEMPLO 1 Preparación, Amplificación, Formación de Secuencias, Expresión, Purificación y Caracterización de la Proteina de Enlace de Plasmina de GapC de S. dysgalactiae A. Preparación de DNA Cromosómico de S. dysgalactiae Se obtuvo un aislado clínico de S. dysgalactiae de un caso de mastitis bovina (No. de Acceso ATCC: ATCC43078) de la American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) , y se usó como una fuente de DNA. El organismo se desarrolló rutinariamente sobre placas de agar sangre de oveja TSA ( PML Microbiologicals, Mississauga, Ontario) a 37 °C por 18 horas, o en caldo de Todd-He itt (Oxoid Ltd., Hamps ire, England ) suplementado con extracto de levadura al 0.3 % (THB-YE) a 37 °C, C02 al 5 %. Se preparó DNA cromosómico desde S. dysgalactiae en 100 mi de THB-YE suplementado con 20 mM de glicina por aproximadamente 6 horas, hasta que se alcanzó una A6oo de 0.8 a 1.0. Se cosecharon las células y se re-suspendieron en 50 mM de EDTA, 50 roM de Tris-HCl. 0.5 % de Tween-20® (Sigma, St. Louis, MO) y suplementado con RNasa A (200 mg/ml) , proteinasa K (20 mg/ml) , lisozima (100 mg/ml) y mutanolisina (100 mg/ml), (SIGMA, St. Louis, MO) . Después de lisis bacteriana por 30 minutos a 37 °C con agitación vigorosa, se mezclaron clorhidrato de guanidina y Tween-20®, pH de 5.5, con el lisado para dar una concentración final de 0.8 M y 5 %, respectivamente. Esta mezcla se incubó a 50 °C por 30 minutos. El DBA cromosómico, se purificó entonces usando 100 g de una punta genómica de Qiagen (Qiagen, Santa Clarita, CA) y se precipitó usando 0.7 volúmenes de isopropanol. El compactado resultante se lavó en etanol al 70 % y se re-suspendió en 0.5 mi de Tris-HCl de 10 mM, pH = 8. B. Amplificación y Clonación del gen gapC de S. dysgalactiae El gen gapC fue amplificado por PCR (Ver Mullis y colaboradores, Patente U.S. No. 4,683,195; Mullis, Patente U.S. No. 4,683,202;). El cebador en sentido directo, gapCl, contuvo un sitio de restricción Ndel (SEC ID NO: 1, mostrado en la tabla 1) y el cebador en sentido contrario, gapClr, contuvo un sitio BamHI (SEC ID N: 2, mostrado en la Tabla 1) . En las secuencias de cebadores precedentes, expuestas en la Tabla 1, el subrayado indica los nucleótidos añadidos a la secuencia original, y la negrilla indica la localización de los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. Se llevó a cabo la PCR usando la DNA polimerasa Vent (New England Biolabs, ississauga, ON, Canadá) . Se incubaron 0.7 ig de DNA cromosómico de S. dysgalactiae en una mezcla de reacción que contiene 1 uM de cada uno de los cebadores precedentes, 200 uM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 3 mM de MgS04, 1 x concentración de regulador Thermopol (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canadá) y 2 unidades de DHñ. polxmerasa Vent. Esta mezcla se incubó por 3 ciclos de amplificacxón de 1 minuto a 94 °C, 3 minutos a 50 °C y 1 minuto, 10 segundos a 72 °Cr luego por 27 ciclos de amplificación de 15 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °Cr y 1 minuto a 72 °C, y finalmente por 1 ciclo de 5 minutos a 72 °C.

Tabla 1 Números de Identificación de Secuencias y Secuencias de Aminoácidos y de Nucleotidos Correspondientes SEC ID NO. Nombre Secuencia 1 Cebador grapCl 5' —GG CGG CGG CAT ATG GTA GTT AAA GTT GGT ATT AAC GG-3' 2 Cebador gapClr 5'-GC GGA TCC TTA TTT AGC GAT TTT TGC AAA GTA CTC-3' 3 gen gapC de (ver la Figura 1) Streptococcus dygalactíae 4 proteina de GapC de Streptococcus dysgalactiae 5 gen gapC de (Ver la Figura 2) Streptococcus agalac ias 6 proteina de GapC de Streptococcus agalactias 7 gen gapC de (ver la Figura 3) Streptococcus uberís 8 proteina de GapC de Streptococcus uberis 9 gen gapC de (ver la Figura 4) Streptococcus parauberis 10 proteina de GapC de Streptococcus paranberis 11 gen gapC de {ver la Figura 5) Streptococcus iníae 12 proteina de GapC de Streptococcus inae Se clonó el producto de PCR de gapC en el vector de expresión pET15B (Novagen, madison, WI) el cual había sido digerido con BamHI y Ndel . La clonación del producto de PCR en este sitio dio como resultado la adición de una secuencia codificadora en-marco para una marca de hexahistidil (6xHis) en la secuencia codificadora de gapC. La expresión subsecuente produjo una proteína de extensión total con una marca de histidina fijada, la cual permite la purificación de la proteína bajo condiciones no-desnaturalizadoras usando cromatografía de metal quelato.

Se usó esta construcción para transformar E. coli BL21 DE3 (Life Technologies, Gaitherburg, MD) . Esta cepa transformada fue designada BL21 DE3 (pET15bgapC) (ATCC No. PTA-1976) . C. Aislamiento del DNA Cromosómico y Amplificación y Clonación del Gen gapC de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae Se preparó el gen gapC desde otros aislados, esencialmente como se describió anteriormente. Se aislaron los DNA cromosómicos de S. agalactiae,. S. uberis, y 5. parauberis desde cepas obtenidas de la American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209; cepas designadas ATCC-27541, 9927, y 13386, respectivamente) . Se aisló el DNA cromosómico de S. iniae desde una cepa designada 9117 obtenida de Mount Hospital, University of Toronto. El cebador usado para amplificar los genes gapC de las cepas de Streptococcus enlistadas anteriormente fue el mismo que el usado en el caso de S. dysgalactiae, es decir, gen gapCl (SEC ID NO: 1) y el cebador gapClr (SEC ID NO: 2) . Después de amplificación, el producto de PCR en cada caso fue clonado en pPCR-Script, usando el protocolo de clonación descrito en el Equipo de clonación PCR-Script Amp (Stratagene, La Jolla, CA) y se usó para transformar E. coli XLIO-Gold (Stratagene, La Jolla, CA) . El producto de PCR inserto fue entonces extirpado usando Ndel y BamHI y se re-clonó en esos sitios en pE15b usando los protocolos de clonación convencionales (Ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra) y se usó para transformar E. coli DH5o¿F' laclq. Los ápihidos resultantes que contienen S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se designaron pMF521c (ATCC No. PTA-1975) , pMF521a (ATCC No. PTA-1973), pMF521d, pMF521e (ATCC No. PTA-1972) , respectivamente. Por expresión de proteínas de (6xHis)GapC, se usaron las construcciones para transformar E. coli BL21 DE3, como se describió anteriormente. D. Secuencia de Nucleotidos del gen gapC y Secuencias de aminoácidos Deducidas Las secuencias homologas a gapC de homólogos de S. equisimilis (Gase, y colaboradores (1996) European J. of Biochem. 239: 42-51) fueron identificadas originalmente mientras se secuecia en un gen unido pero no relacionado de S. dysgalactiae. Para obtener la secuencia completa del gen gapC de S. dysgalactiae, se empleó PCR usando los cebadores descritos anteriormente, es decir, . cebador gapCl y cebador gapClr . Se determinó la secuencia usando terminadores marcados con fluorescencia sobre un secuenciador automático ABI 373 DNA (Applied Biosystems, Emeryville, CA) en el Plant Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Canadá) . Las Figuras 1A-1B, presentan la secuencia codificadora del gen gapC de S. dysgalactiae (DysGapC) (SEC ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 4) . Las secuencias de las proteínas de GapC aisladas de S. agalactiaer S. uberisr S. parauberis, y S. iniae se determinaron por el mismo método. Las Figuras 2 hasta 5, presentan tanto las secuencias de nucleótidos como las secuencias de aminoácidos predicha para la proteína GapC de S. dysgalactiae (DysgalGapC) (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4), así como también para las proteínas de GapC de.5. agalactiae (AgalGapC) (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6), S. uberis (UberGapC) (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8), 5. parauberis (PuberGapC) (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10), y S. iniae (IniaeGapC) (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12), respectivamente. El gen de la proteína de GapC de S. dysgalactiae presentado en las Figuras 1A-1B codifica a la proteína de 335 aminoácidos que no parece contener ya sea una secuencia de señal o una región de anclaje de membrana. Una búsqueda de la base de datos de GenBank usando el programa BLASTX reveló que el marco de lectura abierto fue 95.5 % homólogo a GapC de S. equísimilis (No. de Acceso de GenBank: X97788) y 99.4 % homólogo a gapS de S. pyogenes (No. de Acceso de GenBank: M95569) . La secuencia de aminoácidos predicha de la proteína de GapC también exhibió identidad de 43 % de los aminoácidos a gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa bovina (No. de Acceso de GenBank: U85042) . De manera similar, para las secuencias de la proteína GapC de S. agalactias, S. uberis, S. parauberis y S. iniae, no parecieron estar presentes secuencias de señal ni regiones de anclaje de membrana. Las secuencias homologas están tabuladas en la Tabla 2.

TABLA 2 Homologías de Secuencia Entre Varias Secuencias de la Proteína GapC E. Expresión y Purificación de la Proteína de Enlace de Plasmina de GapC de S. dysgalactíae Recombinante La proteína de GapC marcada con Hexahistidil SE se expresó y purificó bajo condiciones no desnaturalizantes usando cromatografía por afinidad cobre agarosa metal quelato (Ni-NTA) (Qiagen, Santa Clarita, CA) de conformidad con las indicaciones del fabricante. E. coli BL21 DE3 que contenía el plásmido recombinante fue desarrollado en caldo de Luria, que contenía 100 pg/ml de ampicilina a una Agoo ¿Le aproximadamente 0.5. La expresión de la proteína de GapC, se indujo entonces por la adición de 1 mM de isopropíl-ß, D-tiogalactosida (IPTG) (Sigma, St. Louís, MO) . Después de tres horas de incubación a 37 °C, se cosecharon las células, se lavaron en regulador de columna (50 mM de regulador de fosfato de sodio, pH = 8.0, NaCl 0.3 M, 10 mM de imidazol) y se Usaron por sonicación. Aproximadamente 40 % de la protelna recom inante estuvo en la fracción soluble del sonicado celular con un producto de aproximadamente 50 mg de la proteina recombinante por litro de volumen de cultivo, determinado con un Equipo DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá) usando albúmina de suero bovino (pierce, Rockford, IL) como un estándar. El lisado se clarificó por centrifugación y la fracción soluble se aplicó a una columna de Ni-NTA (Qiagen) , la cual fue subsecuentemente lavada con 10 volúmenes de columna de regulador de columna (como anteriormente, excepto que contenia 20 mM de imidazol) . La GapC marcada con Hexahistidil fué eluida usando regulador de columna (como anteriormente, excepto que contenia 250 mM de imidazol) , produciendo una fracción proteinica homogénea que tuvo una concentración de GapC de 10-15 mg/ml. La fracción fue dializada contra 2000 volúmenes de PBSA (136 mM de cloruro de sodio, 2.6 mM de cloruro de potasio, 8.1 mM de fosfato de sodio dibásico, 1.46 mM de fosfato de potasio monobásico) . F. Expresión y Purificación de la Proteína de GapC de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis, y S. iniae Recombinante. La expresión y purificación de las proteínas recombinantes de estas especies de Streptococcus se logró por los mismos métodos descritos en el Ejemplo 1E, anterior. Las cepas bacterianas transformadas usadas para expresar a las proteínas de GapC recombinantes de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae fueron designadas BL21 DE3 (pMF521c) (ATCC No. PTA-1975) , BL21 DE3 (pMF521a) (ATCC No . PTA-1973) , BL21 DE3 (mMF521d) , y BL21 DE3 (pMF521e) {ATCC No. PTA-1972) , respectivamente. G. Caracterización de la Proteína Recombinante de GapC de S. dysgalactiae 1. Análisis por SDS-PAGE Se efectuó la electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS sobre una muestra de la proteína eluída, usando el método descrito por Laemli (Laemli, U.K. (1970) Nature 227: 680-685). Los resultados se presentan en la Figura 18. En la Figura: la banda 1, marcadores de peso molecular (intervalo de 20.5 a 103 kDa; BioRad Laboratories, Emeryville, CA) ; banda 2, proteína de GapC de S. dysgalactiae purificada por cromatografía por afinidad sobre Ni-NTA.. Estos resultados demuestran que la purificación por cromatografía por afinidad sobre una columna de Ni-NTA produjo una fracción homogénea de proteina. 2. Actividad de Gliceraldehido- 3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de GapC recombinante y células enteras de S. dysgalactiae GAPDH cataliza la fosforilación oxidante de D-gliceraldehido-3-fosfato a 1, 3-difosfoglicerato en la presencia de NAD+ y fosfato inorgánico. El alto grado de homología de GapC al gliceraldehido—3-fosfato deshidrogenasa estreptocócica sugiere que GapC puede exhibir esta actividad enzimática. La actividad de GAPDH de células enteras de S. dysgalactiae (1010 CFÜ) y la proteína de GapC recombinante se determinó al medir la reducción de NAD+ a NADH. El regulador de ensayo estuvo compuesto de 40 mM de trietanolamina, 50 mM de Na2HP04 y 5 mM de EDTA, pH de 6.8. Células de S. dysgalactiae o 5 mg de proteína recombinante purificada fueron incubadas en regulador de ensayo que contenía 7 mi de gliceraldehido-3-fosfato (49 mg/ml; Sigma Chemical Company) , en un volumen final de 1 mi. Los controles negativos consistieron de muestras que no contuvieron gliceraldehido-3-fosfato o la molécula de GapC recombinante/células de S. dysgalactiae. La reducción de BAD+ a NADH fue monitoreada espectrofotométricamente a una absorbancia de 340 nanómetros. Los resultados indicaron que tanto la proteína recombinante como las células de S. dysgalactiae de tipo salvaje intactas tuvieron actividad enzimática (no se muestra) . Además, cuando células de S. dysgalactiae fueron tratadas con Tripsina para digerir proteínas de superficie, la actividad de DAPDH desapareció. 3. Actividad de enlace de Plasmina de la Proteína de enlace de Plasmina de GapC de S. dysgalactiae Recombinante y de Células enteras de S. dysgalactiae. Se usó una microplaca de ensayo para determinar si la proteína de GapC recombinante fue capaz de enlazar plasmina bovina, y si la plasmina enlazada estuvo en una forma activa enzimáticamente. Placas de microtítulo de 96 pocilios fueron recubiertas con 5 mg de proteína de GapC recombinante purificada, se lavaron 3 veces con PBSA al 0.1 % en gelatina con TWEEN-20® al 0.05 % (PBSGT) . Los pocilios fueron bloqueados por una hora a 37 °C en el mismo regulador, se lavaron, e incubaron con 200 mi de plasmina bovina (0.25 mg/ml; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) por 1 hora a 37 °C. Los pocilio fueron entonces lavados 8 veces con PBSGT. Se añadieron a los pocilios 200 mi del substrato sintético cromazina-PL (Tos-Gly-Pro-Lys-4-??, 0.3 mg/ml) y se incubaron a 37 °C por 1 hora. La presencia de la actividad de plasmina asociada se determinó - midiendo el nivel de paranitroanilida (4-nitranilina) liberada en el sobrenadante y se detectó con base en una absorbancia de 405 nanómetros. Un procedimiento similar se usó para medir la actividad de enlace de plasmina de células enteras de S. dysgalactiae, con la excepción de que se lavaron 1010 células con PBSGT y se resuspendieron en 400 ul de cromazina-PL (0.3 mg/ml) y se incubaron por 1 hora a 37 °C. Los resultados, mostrados en la Figura 19, demuestran que la proteína recombinante purificada fue capaz de enlazar enzimáticamente a la plasmina bovina activa. De manera similar, cuando se utilizaron células enteras de S. dysgalactiae, se obtuvieron resultados similares . En la figura, los datos representan las medias de tres ensayos individuales . Por consiguiente, el receptor de plasmina está localizado sobre la superficie de S. dysgalactiae y la proteína purificada retiene la actividad biológica. EJEMPLO 2 Inmunización con GapG de S. dysgalactiae e infección experimental de ganado Se formularon las vacunas de una manera tal que contuvieron 50 mg/ml de GapC recombinante purificado por afinidad en el adyuvante de base oleosa VSA3 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá; van Drunen Littel- van den Hurk y colaboradores (1993) Vaccine 11: 26-35). VSA3 es una combinación de Emulsigen Plus (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) y bromuro de dimetildioctadecil amonio (Kodak, Rochester, New York) . La proteina de GapC recombinante purificada por afinidad usada para la preparación de vacuna se muestra en la Figura 18. Se obtuvieron 24 Holstein no lactantes sin historia de infección por S. dysgalactiae de varias granjas en Saskatche an, Canadá. Una semana antes a la vacunación, todos los animales fueron tratados con Cepha-dry™ (Ayerst Laboratories, Montreal, Canadá) (300 mg por región) , a fin de depurar cualquier infección de las ubres antes de la etapa de vacunación. Se inmunizaron subcutáneamente grupos de 8 animales con dos dosis de vacunas que contenían GapC de S . dysgalactiae, Mig (una proteina receptora de Fe aislada de S. dysgalactiae que fue evaluada simultáneamente), o un placebo con un intervalo de tres semanas entre inmunizaciones. Dos semanas después de la segunda inmunización, los animales fueron expuestos a 650 unidades formadoras de colonias de S. dysgalactiae liberadas en tres regiones con una cánula de infusión a la ubre. La cuarta región en cada animal sirvió como un control no efectivo . Todos los animales fueron examinados diariamente para señales clínicas de enfermedad y se colectaron muestras de todas las regiones en cada dia. Se observaron las muestras para consistencia y conteo de células somáticas asi como también se determinó el número bacteriano. EJEMPLO 3 Determinación de anticuerpos específicos de GapC Se midieron los anticuerpos específicos de GapC en suero bovino usando un ensayo inmunoabsor ente unido a enzima (ELISA) . Abreviando, se recubrieron placas de microtítulo (NUNC, Naperville, Illinois) , por adición de 1 microgramo por pocilio de antígeno recombinante purificado en 50 mM de regulador de carbonato de sodio, pH de 9.6, y se incubaron toda la noche a 4 QC. Se removió el líquido y se bloquearon los pocilios con albúmina de suero bovino al 3 % por 1 hora a 37 °C. Se añadieron a los pocilios diluciones seriadas de suero bovino (desde 1 en 4 al en 6,400) y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Se aspiraron los pocilios, se lavaron e incubaron con 100 mi de IgG anti-bovino de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Kirkgaard i Perry Laboratories Inc., Gaitherburg, MD) por 1 hora a temperatura ambiente. Los pocilios fueron lavados de nuevo, y se añadieron 100 µ? de fosfato de p-nitrofenol (SIGMA, St. Louis, MO) como un substrato para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina. Se registró la absorbancia a 405 nanómetros después de 1 hora de incubación con el substrato a temperatura ambiente. Donde se menciona en las figuras, el titulo de anticuerpo especifico es expresado como el reciproco de la dilución que muestra actividad superior a los niveles de fondo . EJEMPLO 4 Colonización Bacteriana Las bacterias fueron enumeradas por diluciones seriadas extendidas (10° a 10~3} directamente sobre placas de agar sangre de oveja TSA seguido por incubación toda la noche a 37 °C, C02 al 5 %. La colonización se definió como > 500 cfu/ml de los organismos estimulados recuperados. Para confirmar que las bacterias recuperadas de las secreciones lácteas fueron S. dysgalactiae, las colonias seleccionadas recuperadas de cada animal fueron probadas usando una prueba API strep-20 (bioMerieux, SA, Hazelwood, Missouri) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Esta prueba es un método estandarizado que combina 20 pruebas bioquímicas para la determinación de la actividad enzimática y la fermentación de azúcares. Las reacciones se leyeron de conformidad' con una tabla de lectura y se obtuvo la identificación ya sea mencionando el índice de perfil analítico o usando programas de ,identificación. Después de la estimulación, los animales de todos los grupos mostraron colonización por S. dysgalactiae (Figura 20) . Solamente las vacas inmunizadas con GapC tuvieron una reducción significativa estadísticamente en el número de regiones infectadas y los números totales de bacterias aisladas por región. Por consiguiente, la inmunización con GapC redujo la colonización bacteriana después d estimulación con S. dysgalactiae. La relación entre el titulo de anti-GapC y la colonización bacteriana se muestra en las Figuras 21 y 22. Hubo una fuerte correlación entre el nivel de anticuerpo en suero anti-GapC y el número máximo de bacterias (expresadas en CFÜ (logl0)/ml de leche) encontrado en cualquier región r= 0.74) (Figura 21) asi como también el número total de regiones infectadas (r2 = 0.74) (Figura 22) . Se calculó la correlación usando el programa GraphPad Prism, versión 2.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, California) . Esta correlación se ilustra también en la Figura 23 y 24 donde el grupo GapC inmunizado está subdividido en respondedores de alto título y d e bajo título. En estas figuras, "respondedores de bajo título", se refiere a los cuatro animales con la respuesta más pobre contra GapC mientras que "respondedores de alto título" se refiere a los restantes del grupo. No tuvo lugar ninguna colonización en el grupo de alto título, mientras que igualmente el grupo de bajo titulo mostró número de bacterias recuperadas reducido después del dia 3. EJEMPLO 5 Determinación de la respuesta inflamatoria Se midió la respuesta inflamatoria como una función del conteo de células somáticas (es decir, linfocitos, neutrófilos, y monocitos} . Los conteos de células somáticas se midieron en un contador Coulter usando técnicas estándares, como recomienda el Agriculture and Agri-Food Canadá Panphet IDF50B (1985) Milk and Milk products-Methods of Sampling. Las muestras estuvieron siempre listas en 48 horas de colección y fijación, en los dias 1 hasta 7 post-estimulación. Se determinó el número de células somáticas presentes en la glándula, en cada dia post-estimulación. El número de las regiones sin estimular permaneció constante en el transcurso del ensayo mientras que en el dia 1, el grupo de GapC fue más bajo que el grupo inmunizado con placebo (Figura 25) . La diferencia entre los grupos GapC y el placebo fueron significativos estadísticamente. Los datos individuales del dia 1, se muestran en la Figura 26; los datos para los animales tratados con GapC durante un periodo de 7 dias post-estimulación se muestra en la Figura 27. Las muestras de las regiones de animales inmunizados con GapC no fueron distinguibles de las regiones sin estimular. Por consiguiente, la inmunización con GapC redujo la respuesta inflamatoria después de la estimulación con S . dysgalactiae . EJEMPLO 6 Inmunización y estimulación de vacas lactantes Se condujeron experimentos similares para probar la efectividad de vacunas que comprenden S . uberis y S . dysgalactiae en vacas lactantes, como sigue. Un total de 99 vacas Holstein fueron seleccionadas por la presencia de IgG en suero contra células completas de S. uberis, GapC y C¾MP, otro antigeno estreptocócico . Se seleccionaron cuatro grupos de 9 animales para vacunación con placebo, ((6xHis)GapC de S. uberis, (6xHis)GapC de S. dysgalactiae y CñMP-3. cada dosis de vacuna (2 mi) incluyó 100 pg/ml de (6xHis)GapC, C¾MP-3, o placebo [0.85 % (en peso/volumen de solución salina) libre de antigeno purificados, y VSA3 al 30 % (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá; van Drunen Littel-van der Hurk y colaboradores (1993) Vaccine 11: 25-35) . Las vacas recibieron 2 inyecciones subcutáneas en el cuello a 36 (dia 0) y 15 días antes de la estimulación. Ocho dias antes de la estimulación, se analizaron muestras de leche de cada región por la presencia de bacterias, y se excluyeron del ensayo los animales infectados .

Subsecuentemente, 6 vacas de cada grupo fueron estimuladas . Tres horas antes de la estimulación, las tetas fueron lavadas con agua caliente, limpia, se secaron, y se. limpiaron con algodón con alcohol. Se colectaron muestras de leche para conteo de células somáticas (SCC) y bacteriología. Las regiones izquierdas de las ubres permanecieron sin estimular como controles . Se administraron 3 mi de inoculo por infusión intramamaria en las regiones derechas de cada animal, que contenia 3.0 x 107 cfu/ml de un cultivo en fase exponencial de S.uberis SU21 (aislado clínico obtenido de animal Health Laboratory, Alberta, Canadá) se suspendieron en solución salina al 0.85 % en eso/ olumen) . Se colectaron muestras de leche de todas las regiones, diariamente por 7 días post-estimulación, para la determinación de SSC y bacteriología. Todas las muestras fueron almacenadas sobre hielo y analizadas en 48 horas de la colección. La evaluación clínica de los animales incluyó mediciones de temperaturas rectales, e hinchazón de las ubres (visual y palpable) . Una calificación numérica de 1 (normal) a 3.5 (mastitis severa) se asignó a cada animal y se usó como un medio de comparar la severidad de la mastitis entre los grupos de vacuna. Se evaluó la calidad de la leche por la presencia de coágulos. Se determinaron los títulos de IgG en suero en el momento de la primera y la segunda vacunación, a 8 días antes de la estimulación (día 28) y a 11 días postestimulación (día 47) . De manera similar, los títulos de IgG en leche se determinaron en los días 21 y 43. Los títulos de IgA en suero se determinaron en los días 21 y 47, y los títulos de IgA en leche se determinaron en los días 1 y 43. Se recubrieron pacas de microtítulo de 96 pocilios de fondo redondo (Nunc) toda la noche a 4 °C con CAMP-3 y (6xHis)GapC de S. uberis y S. dysgalactiae (100 ng/pocillo en 100 µ? de regulador de carbonato, pH = 9) , yse bloquearon por 1 hora a 37 °C con 200 µ? de PBSTg. Se añadieron 100 µ? de muestra de prueba por pocilio, y las placas se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar, se añadió IgG anti-bovino de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (H & L; Kirkegaard y Perry Labs. Inc., Gaithersburg, MD) (100 µ?/pocillo) , y las placas se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se detectó la actividad de fosfatasa alcalina a 405 nm después de incubación con fosfato de p-nitrofenilo en dietanolamina 1M (pH= 9.8) y 0.5 mM de MgCl2 por 1.5 horas a temperatura ambiente . Se llevó a cabo la determinación de IgG e IgA en leche después de tratar la leche con una solución de reni a disponible comercialmente, como sigue: Una tableta de Rennet (CHR HANSEW) se disolvió en 40 mi de H20, y 0.1 mi de esta solución se añadieron a 2 mi de leche y se incubaron a temperatura ambiente por 4 horas. La caseína coagulada fue compactada por centrifugación a 3,000 x g por 20 minutos, y la capa media fue removida (la capa superior comprendió grasa) y se analizó como para las muestras de suero. Se determinaron tanto los títulos en leche como en suero por medio de la intersección de la regresión de mínimos cuadrados de la OD40s versus logaritmo de la dilución con el ??405 obtenido de los pocilios que no contenían suero. La determinación de SCC de muestras de leche se llevó a cabo en el Pacific Milk Arialysis Laboratory (Chilliwak, British Columbia) . Se colectaron muestras en tubos de fondo redondo, de de poliestireno de 14 mi (Falcon) que contenían un conservador. Se fijó el SCC por mezclado de 0.5 mi de muestras de leche con 10 µ? de líquido fijador (0.2 mg/ml de eosina, solución de formaldehído al 3.3 ¾) por 18 horas a 30 °C. Se diluyeron las muestras 1/100 en solución electrolítica emulsificante (etanol al 12 %, Tritón X-100 al 0.02 %, KaCl 0.1 M) , y se incubaron a 80 °C por 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se determinó el SCC con un contador Coulter. Se efectuó el análisis de varianza de las medidas repetidas de SCC entre tratamientos, y con el tiempo, usando el paquete del programa SYSTAT 10 (APSS Science, Chicago, USA) . La Tabla 3, muestra los títulos pre- y pot-estimulación, presentados como la media aritmética de los valores transformados del logaritmo natural de títulos en suero de todos los animales en cada grupo de tratamiento (desviación estándar entre paréntesis) . Antes de vacunación, solamente 4 animales mostraron algún título de IgG en suero detectable contra (6xHis)GapC. Después de vacunación, todos los animales vacunados con (6xHis)GapC mostraron un incremento significativo en los títulos de IgG anti- ( 6xHis) apC tanto en suero como en leche, los cuales permanecieron consistentemente al menos 10 veces más altos que los animales control, mientras que los títulos de IgG anti- (6xHis) GapC en animales vacunados con CAMP-3 fueron similares a los del grupo control, los títulos de IgG anti- (6xHis) GapC en leche fueron consistentemente inferiores que los valores correspondientes en suero. Sin embargo, inmediatamente antes de la estimulación fue obvio que los títulos de IgG en leche y suero aumentaron en animales vacunados con (6xHis)GapC, en comparación con los animales vacunados con CAMP-3 y control. Los niveles de IgA anti- ( 6xHis) GapC en suero fueron detectables en todos los grupos antes de la estimulación, pero aumentaron significativamente después d ela estimulación. Igualmente el grupo vacunado con CAMP-3 mostró un incremento en los títulos de IgG anti- (6xHis)GapC, muy probablemente . resultado de la exposición a GapC asociada a la superficie celular de la bacteria de estimulación S. uberis. En animales vacunados con CAMP-3, se observó un incremento post-estimulación en los títulos de IgG anti- (6xHis) GapC en leche, aunque no se observó un incremento correspondiente en los títulos de IgG en suero . En contraste al suero la IgA anti- (6xHis) GpaC en leche fue virtualmente indetectable en todos los grupos, tanto pre-como post-estimulación. Después de la vacunación de las vacas con CAMP-3, hubo un marcado incremento en los títulos de IgG anti-CAMP en leche y suero, en comparación con los de los animales vacunados con (6xHis)GapC y control. Además, en contraste con los títulos de IgG anti- (6xHis) GapC, los títulos de anti-CAMP-3 aumentaron post-estimulación, mientras que aquellos para (6xHis) GapC disminuyeron ligeramente. Aunque se desconoce la causa, esta observación fue consistente a través de todos los grupos vacunados; se encontró que los títulos de IgG anti-6xHis) GapC disminuyeron en suero post-estimulación, mientras qe los títulos correspondientes en leche disminuyeron (con excepción del grupo vacunado con (6xHis)GapC de S. dysgalactiae) .Los títulos de IgA anti-CAMP-3 en suero, pre-estimulación fueron tan superiores que los títulos de anti- ( 6xHis) GapC en suero equivalentes determinados en el mismo punto de tiempo (dia 21) , y en el momento que las muestras de suero post-estimulación fueron tomadas, los niveles de IgA anti-CAMP-3 aumentaron en todos los grupos, más significativamente en aquellos vacunados con CAMP-3. en contraste, los títulos de IgA anti-CAMP-3 en leche tanto pre- como post-estimulación fueron virtualmente indetectables . Después de la estimulación con SU21 de S. uberds, en ningún punto se recuperaron bacterias de cualquier animal, vacunados o de otra manera. Esto es consistente con los resultados de un estudio previo (Finch y colaboradores (1994) Infect. Immun. 62: 3599-3603), donde no se aisló ninguna bacteria después de estimulación de vacas lecheras vacunadas con 5. ubexis muertas térmicamente, aunque las bacterias fueron aisladas de anímales control sin vacunar. Es posible que en el estudio actual, el inoculo administrado fué suficientemente bajo para inducir mastitis sin causar infección persistente, aún en animales sin vacunar. No obstante, a pesar de la ausencia de bacterias recuperables, los animales no presentaron señales clínicas de enfermedad, y el SCC indicó que tuvo lugar la inflamación. Por consiguiente, la estimulación se realizó exitosamente. Entre los grupos vacunados, no se observaron diferencias significativas en la severidad de la infección. Aunque no se observaron diferencias en el la leche producida en cualquiera de los animales, la calidad de la leche fue ligeramente afectada en todos los grupos, como se discutió anteriormente. La ubre bovina está comprendida de regiones sin conectar, y por estimulación solamente se proporcionaron por cada animal 2 regiones con un control de S. uberis. La Figura 28 muestra la SCC en el transcurso del ensayo, para cada grupo de vacuna particular. En el análisis inicial, la SCC reportada del grupo control pareció algo variable; sin embargo, la relación total fue un incremento de SCC con el tiempo, explicado por una relación cuadrática (p=0.02) . Después del dia 2, la SCC del grupo control disminuyó marcadamente, alcanzando su nivel más alto en el dia 4 post-estimulación. La SCC disminuyó entonces ligeramente, antes de aumentar marcadamente otra vez en el dia 7 post-estimulación. Esta tendencia algo errática es consistente con los valores de SCC reportados en otra parte, después de la estimulación de vacas lactantes con S. uberis (Finch y colaboradores (1997) Vaccine 15: 1138-1143; Finch y colaboradores (1994) Infect. Immun. 62: 3599-3603). El SCC de animales vacunados con (6xHis)GapC de S. dysgalactiae aumentó agudamente inmediatamente postestimulación, alcanzando un máximo en el dia 3, antes de disminuir erráticamente durante el resto del ensayo. No obstante, en ningún punto la disminución de SCC fue diferente de manera significativa estadísticamente de la del grupo control, a pesar de una diferencia aparente desde el dia 4 post-estimulación hacia delante. Este resultado puede ser a causa de que (6xHis)GapC de 5. dysgalactia no es tan protectora como la de S. uberis. La vacunación con S. uberis (6xHis)GapC dio como resultado una disminución significativa de SCC en comparación con el grupo control. Desde el día 3 hacia delante, la SCC en este grupo fue de manera significativa estadísticamente inferior que las del grupo control (valores de p de 0.023 en el día 3, 0.001 en el día 4,0.011 en el día 5, 0.006 en el día 6, y 0.000 en el día 7 post- estimulación) . La SCC de las vacas vacunadas con el antígeno de C¾MP-3 fue ligeramente superior que la de los animales vacunados con (6xHis) GapC de S. uberis, aunque fueron aún claramente inferiores a los del grupo control. La comparación del SCC de los grupos vacunados con CAMP-3 y control reveló diferencias significativas estadísticamente en los días 3 (valor de p de 0.033), 6 y 7 post-estimulación valores de p de 0.32 y 0.046 respectivamente) pero no en los días 4 y 5, aunque el SCC fue obviamente inferior en los grupos vacunados con CAMP-3 en esos días. Después de la estimulación con SU21, el tiempo que la calidad de la leche permaneció afectada varió entre los grupos vacunados. Post- estimulación, la calidad de la leche en el grupo control, vacunados con (6xHis)GapC de S. dysgalactiae, C¾MP-3, y (6xHis)GapC de S. uberis se redujo en un total de 21, 24, 11 y 9 respectivamente. De conformidad con estos datos, la mastitis en el grupo vacunado con (6His)GapC de S. dysgalactiae no fue menos severa, si no peor, que la del grupo control. Contrariamente, aunque la vacunación con (6xHis) GapC de S. uberis no evitó completamente la reducción en la calidad de la leche, redujo significativamente la extensión del tiempo que la calidad de la leche fue afectada. La vacunación con CñMP-3 también pareció reducir la extensión del tiempo en que se redujo la calidad de la leche, aunque no tanto como en el grupo de (6xHis)GapC de S. uberis, que se conservó con los resultados de SCC. La vacunación con {6xHis)GapC de S. uberis dio como resultado una protección significativa contra la estimulación heteróloga y GapC de S. uberis es por consiguiente adecuada para uso como antigeno de vacuna contra mastitis por S. uberis, asi como también contra mastitis causada por cepas heterologas.

Tabla 3 Títulos3 de IgA e IgG Anti-GapC y anti-CAMP aLos grupos mostrados son vacunados con 1. Control, 2. (6xHis)GapC de S. dysgalactlae, 3. (6xHis)GapC de S. uberis, y 4.CAMP-3. Los datos pre-estimulación corresponden a los títulos de IgG en suero en el dia 28, y los títulos de IgA en suero, IgG e IgA en leche en el día 21. Los datos post-estimulación corresponden a los títulos de igG en suero en el día 47, y a los títulos de IgA en suero, IgA e IgG en leche en el día 43. Por consiguiente, se describieron la clonación, expresión y caracterización de varias proteínas de enlace de plasmina de GapC, así como los métodos de usarlas . Aunque se han descrito con algún detalle las modalidades preferidas de la invención, se comprenderá que pueden hacerse variaciones obvias sin alejarse del espíritu y el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas .

Claims

114 NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una composición de vacuna caracterizada porque comprende (a) un vehículo aceptable farmacéuticamente; (b) un polipéptido del factor CAMP quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos contigua expuesta en las posiciones 27-314 de la Figura 29/ y (c) una p oteína de GapC, en donde la proteína de GapC es seleccionada del grupo que consiste de: (i) una proteína de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) ; (ii) una proteína de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) ; (iii) una proteína de GapC que comprende una secuencia de aminoácido con al menos 80 % de identidad de 115 secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) ; (iv) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4A-4B (SEC ID NO: 10) ; (v) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5A-5B (SEC ID NO: 12) y (vi) fragmentos inmunogénicos de (i) , (ii) , (iii) , (iv) , (v) y (vi) , los fragmentos comprenden al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 2. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue el polipéptido del factor CAMP quimérico comprende la secuencia de aminoácidos contigua expuesta en las posiciones 27-314 de la Figura 29. 3. La composición de vacuna ya sea de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina GapC de Streptococcus 116 dysgalactlae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprenda al menos aproximadamente 5 aminoácidos . . La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteina GapC comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la posición de los aminoácidos 1 a 336, de las Figuras 1?-1? (SEC ID NO: 4) . 5. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteina de GapC de Streptococcus agalactiae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprenda al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 6. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteina de GapC comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) . 7. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la proteina de GapC comprende la secuencia de 117 aminoácidos de la proteína de GapC de Streptococcus uberis expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprenda al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 8. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la proteína de GapC comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) . 9. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la proteína de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de GapC de Streptococcus parauberis expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4?-4? (SEC ID NO: 10) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprenda al menos aproximadamente 5 aminoácidos . 10. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína de GapC comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4?-4? (SEC ID NO: 10) . 11. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada 118 porque la proteína de GapC comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de GapC de Streptococcus iniae expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5-5B (SEC ID NO: 12) o un fragmento inmunogénico de la misma, el fragmento que comprenda al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 12. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína de GapC comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5A-5B (SEC ID NO: 12) . 13. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada adicionalmente porque comprende un adyuvante. 14. Un método de producir una composición de vacuna caracterizado porque comprende combinar: (a) un polipéptido del factor CAMP quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos contigua expuesta en las posiciones de los aminoácidos 27-314 de la Figura 29; (b) una proteína de GapC, en donde la proteína de GapC es seleccionada del grupo que consiste de: (i) una proteína de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia 119 con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) ; (ii) una protexna de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) ; (iii) una protexna de GapC que comprende una secuencia de aminoácido con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) ; (iv) una protexna de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4A-4B (SEC ID NO: 10) ; (v) una protexna de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5A-5B (SEC ID NO: 12) ; y (vi) fragmentos inmunogénicos de (i), (ii) , (iii), (iv) , (v) y (vi) , los fragmentos que comprendan al menos 120 aproximadamente 5 aminoácidos; y (c) un vehículo aceptable farmacéuticamente. 15. Un método de tratar o de prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la infección bacteriana es una infección por estreptoco. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la infección bacteriana causa mastitis . 18. Uso de un polipéptido del factor C¾MP quimérico y de una proteína de GapC para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado, caracterizado porque el polipéptido del factor C¾MP quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos contigua expuesta en las posiciones 27-314 de la Figura 29, y la proteína de GapC es seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteína de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia- de aminoácidos mostrada en las posiciones 121 de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 1A-1B (SEC ID NO: 4) ; (b) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A-2B (SEC ID NO: 6) ; (c) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336 inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) (d) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 4A-4B (SEC ID NO: 10) ; (e) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5?-5B (SEC ID NO: 12) y (f) fragmentos inmunogénicos de (i) , (ii) , (iii) , (iv), (v) y (vi), los fragmentos que comprendan al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 122 19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la infección bacteriana es una infección por estreptococo. 20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la infección bacteriana causa mastitis . 21. Uso de un polipéptido del factor CAMP quimérico y de una proteina de GapC en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto- vertebrado, caracterizado porque el polipéptido del factor C¾MP quimérico comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos contigua expuesta en las posiciones 27-314 de la Figura 29, y la proteina de GapC es seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 1?-1B (SEC ID NO: 4) ; (b) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 2A- 123 2B (SEC ID NO: 6) ; (c) una proteina de GapC que comprende una secuencia de . aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 3A-3B (SEC ID NO: 8) ; (d) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336 inclusive, de las Figuras 4?-4? (SEC ID NO: 10) ; (e) una proteina de GapC que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, inclusive, de las Figuras 5A-5B (SEC ID NO: 12) ; (f) fragmentos inmunogénicos de (i), (ii) , (iii) , (iv) , (v) y (vi) , los fragmentos que comprendan al menos aproximadamente 5 aminoácidos. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porgue la infección bacteriana es una infección por estreptococo. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la infección bacteriana causa mastitis.