EA031495B1 - ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНАЯ ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Ag85B, TB10.4, FliC - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине. Предложена противотуберкулезная вакцина, содержащая рекомбинантные белки Ag85B и TB10.4 M. tuberculosis, а также рекомбинантный адъювант - флагеллин FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, а также фармацевтически приемлемый эксципиент, для решения острой задачи современности, заключающейся в создании безопасной при производстве и применении противотуберкулезной вакцины, имеющей эффективность, как минимум, сравнимую с таковой БЦЖ. Указанные свойства предложенной вакцины подтверждены примерами.

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине. Предложена противотуберкулезная вакцина, содержащая рекомбинантные белки Ag85B и ТВ 10.4 М. tuberculosis, а также рекомбинантный адъювант - флагеллин FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, а также фармацевтически приемлемый эксципиент, для решения острой задачи современности, заключающейся в создании безопасной при производстве и применении противотуберкулезной вакцины, имеющей эффективность, как минимум, сравнимую с таковой БЦЖ. Указанные свойства предложенной вакцины подтверждены примерами.

031495 В1

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для профилактики туберкулеза.

Туберкулез является инфекционным заболеванием, вызывающим наибольшее количество случаев с летальным исходом. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) туберкулезом ежегодно заболевает около 8 млн человек и около 3 млн заболевших погибает. Лечение туберкулеза осложняется тем, что широко распространены высокорезистентные штаммы микобактерий, вызывающие туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). В связи с этим перспективным подходом в борьбе с данным заболеванием является профилактика. По инициативе ВОЗ с 2006 г. объявлена глобальная программа борьбы с туберкулезом The Global Plan to Stop ТВ, согласно которой одно из ведущих мест занимает разработка вакцин нового поколения против туберкулеза. Согласно последнему докладу ВОЗ по туберкулезу 2014 г. новая вакцина, которая поможет предотвратить передачу туберкулеза среди подростков и взрослых в развивающихся странах, будет самым экономически эффективным инструментом в смягчении эпидемии [1].

Таким образом, проблема туберкулеза стоит крайне остро и требует скорейшего решения в виде безопасной при производстве и применении вакцины, которая имела бы эффективность, как минимум, сравнимую с таковой БЦЖ.

Существует несколько направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, в их числе живые вакцины с улучшенными свойствами, инактивированные вакцины, вакцины на основе белков. Авторы настоящего изобретения считают наиболее перспективным использование вакцин на основе белков, причем получаемых с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Достоинства таких вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные молекулы, в том числе нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме-хозяине. Однако их эффективность варьирует и обуславливается массой факторов, одними из самых важных из которых являются подбор компонентов.

Для создания настоящего изобретения были выбраны иммунодоминантные секретируемые антигены M. tuberculosis - белок Ag85B комплекса белков 85 и белок TB10.4 (culture-filtrate protein-7). Данные белки высококонсервативны среди различных штаммов микобактерий, а также способны вызывать иммунный ответ, что позволяет полагать, что возможно получение кросс-реактивного иммунного ответа [2]. Важно, что указанные белки не имеют гомологии с известными белками других организмов, что обеспечивает специфичность их действия. Также показано, что белок TB10.4 обладает адъювантным действием при введении в комплексе с белками микобактерий [3].

Известны следующие немногочисленные решения на основе вышеперечисленных белков М. tuberculosis.

Известна бактерия в одном из вариантов реализации изобретения - микобактерия, содержащая плазмидные ДНК, кодирующие в одном из вариантов изобретения Ag85b и TB10.4 [4]. Однако введение живой бактерии, в особенности микобактерий, пусть и аттенуированной, несет в себе риски. Использование вакцины на основе белка является более безопасной альтернативой.

Известна кандидатная вакцина на основе аденовирусного вектора, который кодирует OPC хотя бы двух белков из Ag85A, Ag85B и TB10.4, дополнительно может использоваться адъювант [5]. Однако использование аденовируса также несет в себе риски. Вирусные векторы имеют ряд недостатков, в их числе то, что они дорогостоящи и могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Использование рекомбинантных высокоочищенных белков позволит индуцировать специфический ответ без побочных эффектов.

К недостаткам данных аналогов можно отнести то, что вирусные векторы и модифицированные патогены имеют риски наследования, что может препятствовать их использованию у человека [6].

Известна вакцина против хронического заболевания, например бактериальной инфекции, содержащая смесь перекрывающихся пептидов, охватывающих всю последовательность аминокислот белка, в том числе Ag85B или TB10.4, которая также может содержать адъювант - катионные липосомы, также может дополнительно вводиться полноразмерный белок, охватываемый пептидами в первом введении [7]. Указано, что в одном из вариантов изобретения пептиды получают гидролизом белка с использованием более чем двух протеолитических агентов, однако в данном случае осложняется процесс получения для вакцины пептидной смеси без примесей. Более того, условия хранения такой пептидной смеси могут опосредовать проблемы при реализации данного изобретения. Также при использовании химически синтезированных молекул, в том числе пептидов, следует понимать, что их часть может быть представлена энантиомерами, что может приводить к непредсказуемым результатам в организме при применении. Понятие энантиомерии играет важную роль в фармацевтике, поскольку разные энантиомеры лекарственных веществ, как правило, имеют различную биологическую активность. Использование живых систем для получения пептидных молекул позволяет получить молекулы природной структуры, гомогенную смесь. Однако использование вакцины со значительно меньшим количеством компонентов является более оптимальным вариантом как для производства, так и для применения в последнем случае, поскольку вероятность развития осложнений за счет возможных неспецифических реакций меньше.

- 1 031495

Наиболее близким аналогом является вакцина HyVAC IV/Aeras, которая содержит белки Ag85B и TB10.4, а также сложный адъювант IC31, содержащий синтетический антимикробный пептид KLKL5KLK, действие которого направлено на усиление взаимодействия антиген-презентирующих клеток с антигеном, и лиганд TLR9 ODN1a, обладающий иммуностимулирующим действием. Данная вакцина проходит IIa фазу клинических испытаний [1]. Однако производство действующего агента вакцины, представленного несколькими компонентами, получаемыми с использованием совершенно разных механизмов, является технически сложным. Эффективность такой вакцины также может быть снижена, а безопасность не достигнута за счет присутствия в ней энантиомеров.

Авторами настоящего изобретения предложено неожиданное оригинальное решение, которое лишено данных недостатков.

Использование адъюванта позволяет усилить иммуногенность вакцин, однако важно подобрать адъювант, который позволит индуцировать наиболее специфичный по отношению к патогену иммунный ответ, в данном случае способный стимулировать Т-клеточный иммунный ответ, наряду в В-клеточным, а также который будет способствовать формированию местного иммунитета и который будет безопасным.

Авторами настоящего изобретения выявлено, что при совместном применении белков Ag85B и TB10.4 именно с флагеллином FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium (далее - FliC), полученным как и антигены микобактерий с использованием технологии рекомбинантной ДНК, при парентеральной и мукозальной иммунизации происходит формирование как Т-клеточного иммунного ответа, наряду в Вклеточным, так и индукция местного гуморального иммунитета, при этом не происходит формирование антител непосредственно к флагеллину, что также является существенным фактором при использовании адъюванта. Формирование местного иммунитета важно для предотвращения инфицирования микобактериями. Иммунизация поверхности слизистой также значительно облегчает доставку иммуногена.

Флагеллин - белок бактериальных жгутиков, присутствующих у многих бактерий, в том числе патогенных. Флагеллин - лиганд TLR5 (Toll-like receptor 5). Взаимодействие флагеллина с TLR-5 стимулирует созревание макрофагов и дендритных клеток - антиген-презентирующих клеток, что приводит к выработке иммунного ответа [8; 9]. Флагеллины индуцируют формирование сывороточных и секреторных антител, Th1- и Th2- ответ как на сами флагеллины, так и на совместно введенные антигены.

Флагеллин в зависимости от происхождения из того или иного микроорганизма различается и состоит из 259-1250 аминокислотных остатков, что, безусловно, влияет на его свойства.

Различия в структуре флагеллина наблюдаются и среди одного бактериального вида. Так, большая часть сероваров Salmonella enterica двухфазные, т.е. у них чередуется экспрессия разных жгутиковых антигенов (фаз). Это обусловлено возможностью нахождения в активном состоянии только 1 из 2 генов флагеллина (fliC и fljB), локализующихся в разных локусах хромосомы [10], FliC - phase 1 flagellin (STF), fljB - phase 2 flagellin (STF2). Данные флагеллины имеют одинаковый N-конец, гомологичный, различающийся на несколько а.о., С-конец, а также различный домен D3 соответственно имеют различную структуру и могут иметь различные эффекты.

Таким образом, в зависимости от того, флагеллин какого микроорганизма используется, а также типа используемого флагеллина (например, для Salmonella), эффект будет разниться. Также следует учитывать возможное взаимодействие компонентов в смеси, в связи с чем подбор флагеллиновой молекулы в качестве адъюванта, а также его целесообразность в каждом случае является сложным процессом.

Технический результат от использования изобретения выражается в увеличении безопасности при производстве и применении вакцины за счет использования исключительно рекомбинантных белков, в том числе рекомбинантного адъюванта, в качестве компонентов вакцины, что нивелирует негативные эффекты от использования белковых молекул, полученных иным путем.

Технический результат от использования изобретения выражается в увеличении эффективности вакцины за счет использования исключительно рекомбинантных белков, в том числе рекомбинантного адъюванта, в качестве компонентов вакцины, что исключает снижение эффективности каждого компонента вакцины за счет его потерь из-за формирования гетерогенной смеси, также включающей энантиомеры, а также за счет использования адъюванта, позволяющего значительно усилить специфический ответ на антигены микобактерий, в том числе с формированием местного иммунитета, что, как правило, достаточно сложно достичь при вакцинации.

Технический результат от использования изобретения выражается в упрощении производства вакцины за счет использования единой технологии получения компонентов, соответственно отсутствия необходимости создания разных производственных участков.

Наконец, технический результат от использования изобретения выражается в расширении спектра противотуберкулезных вакцин. При противопоказаниях к применению аналогов либо нежелании использовать аналоги ввиду их вышеописанных недостатков данная вакцина позволит осуществить защиту против туберкулеза. В связи с тем что проблема туберкулеза стоит очень остро, а выведение на рынок препарата удается не многим, данное изобретение позволит увеличить шансы в борьбе с данной инфекцией.

- 2 031495

Сущность изобретения

Решение острой задачи современности, заключающейся в создании безопасной при производстве и применении противотуберкулезной вакцины, имеющей эффективность, как минимум, сравнимую с таковой БЦЖ, - в предложенной противотуберкулезной вакцине, содержащей помимо, естественно, фармацевтически приемлемого эксципиента рекомбинантные белки - антигены микобактерий Ag85B и TB10.4, а также рекомбинантный адъювант - флагеллин FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium. Вакцина может вводиться парентерально либо на слизистые. Предложенная вакцина эффективна для профилактики туберкулеза. Указанные свойства предложенной вакцины подтверждены примерами.

Рекомбинантные белки получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Среднему специалисту в данной области техники известно, что на данный момент существует множество систем получения таких белков, и все они, в той или иной мере, позволяют получить компоненты вакцины по настоящему изобретению, в связи с чем для каждого компонента использовано понятие рекомбинантный белок, а не указан конкретный продуцент.

Также были проведены лабораторные исследования, отражающие конкретные примеры реализации указанного изобретения. Полученные результаты лабораторных исследований проиллюстрированы фиг. 1-6 и примером 2.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1-3 проиллюстрированы показатели тяжести течения туберкулезной инфекции у мышей, профилактически иммунизированных БЦЖ и вакцинными кандидатами, через 4,5 недели после заражения M. tuberculosis Erdman, на фиг. 4-6 - высеваемость из легких таких мышей, группы животных обозначены следующим образом: К- - интактные, К+ - контроль заражения, 1 - БЦЖ, 2 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, в/м введение, 3 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, и/н введение.

Фиг. 1 - коэффициент массы легких в условных единицах;

фиг. 2 - индекс поражения легких в условных единицах;

фиг. 3 - коэффициент массы селезенки в условных единицах;

фиг. 4 - десятичный логарифм числа жизнеспособных бактерий в легких;

фиг. 5 - индекс защиты по сравнению с невакцинированными животными, десятичный логарифм. На оси абсцисс обозначены группы - 1 - БЦЖ, 2 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, в/м введение, 3 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, и/н введение;

фиг. 6 - индекс защиты по сравнению с БЦЖ, десятичный логарифм. На оси абсцисс обозначены группы - 2 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, в/м введение, 3 - белки Ag85B, Tb10.4, FliC, и/н введение.

Пример 1. Получение противотуберкулезной вакцины.

1.1. Получение белков Ag85B, Tb10.4 Mycobacterium tuberculosis и FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium с использованием прокариотической системы.

Аминокислотные последовательности белков Ag85B и Tb10.4 Mycobacterium tuberculosis, взятые из специализированной базы данных Tuberculist [11], а также аминокислотная последовательность белка FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, номер в базе GenBank BAA02846.1, перевели в нуклеотидные последовательности, одновременно проведя кодонную оптимизацию для Escherichia coli (E. coli), а также добавив сайты для клонирования в вектор для экспрессии в данном микроорганизме, рЕТ28а(+). Гены синтезировали химически.

Каждый полученный ген клонировали в плазмиде рЕТ28а для последующей экспрессии. Для этого проводили рестрикцию синтезированного гена, а также плазмиды с последующим лигированием полученных фрагментов ДНК. Реакцию рестрикции проводили в 70 мкл раствора, содержащего 100 мкг ДНК, по 6 ед. ферментов Fast Digest NdeI и Fast Digest XhoI (ThermoScientific, США). Реакцию проводили в соответствующем буфере FastDigest в течение 15 мин при 37°С. Инактивировали прогреванием до 65°С в течение 5 мин. Реакцию лигирования гена и плазмиды рЕТ28а проводили в объеме 70 мкл. Реакционная смесь содержала очищенный рестрицированный ПЦР-продукт - 4,25 мкл (1300 нг), рестрицированный вектор рЕТ28а(+) - 3,5 мкл (425 нг), 10Х ligase buffer (Thermo Fisher Scientific Inc.) - 7 мкл, 50% ПЭГ - 7 мкл, Т4 лигазу (Thermo Fisher Scientific Inc.) - 10 мкл (7 ед. активности), объем смеси доводили до 70 мкл безнуклеазной водой. Реакционную смесь инкубировали при 22°С в течение 4 ч.

Полученной лигазной смесью трансформировали подготовленные клетки Е. coli штамма BL21 Star (DE3) (Invitrogen, USA) с генотипом F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3).

Для подготовки компетентных клеток к последующей трансформации методом электропорации брали отдельную колонию, выращенную на LB-агаре (Gibko BRL, США), и помещали в 5 мл LB-среды (Gibko BRL, США). Клетки растили в течение ночи при 37°С и постоянном перемешивании (250 об/мин). 2 мл полученной ночной культуры помещали в 200 мл LB-среды. Клетки растили при 37°С при постоянном перемешивании (250 об/мин) до ОП₆₀₀0,6, после чего осаждали центрифугированием в течение 10 мин на 4000 g при 4°С. Клетки отмывали в деионизованной воде в исходном объеме с последующим центрифугированием. Процедуру отмывки повторяли трижды. После отмывки осадок клеток ресуспендировали в малом объеме деионизованной воды и центрифугировали 30 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге. К осадку клеток добавляли 3 об. (от объема клеточного осадка) 15% раствора глицерина, осадок ресуспендировали. Готовые к трансформации клетки хранили при -70°С.

- 3 031495

Трансформацию компетентных клеток осуществляли методом электропорации. 1 мкл десятикратно разведенной лигазной смеси добавляли к 100 мкл компетентных клеток, перемешивали и проводили порацию на электропораторе Eporator (Eppendorf, Германия). Трансформацию проводили в стерильных кюветах для электропорации (Eppendorf, Германия) объемом 100 мкл, щель 1 мм, при электрическом импульсе напряженностью 1,7 кВ длительностью 5 мс.

После трансформации клетки помещали в 1 мл SOC-среды (2% бактотриптон; 0,5% дрожжевой экстракт; 10мМ NaCl; 2,5мМ KCl; 10мМ MgCl₂, 10мМ MgSO₄; 20мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при 37°С.

Проводили скрининг выросших клонов на наличие вставки таргетного гена. Для каждого гена был выбран один клон клеток E. coli.

Индукцию экспрессии гена в каждом из полученных штаммов осуществляли с использованием ИПТГ, предварительно определив, что оптимальный протокол индукции совпадает для всех используемых генов. Для этого единичную колонию штамма-продуцента инокулировали в стандартную жидкую среду LB (1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый), содержащую канамицин в концентрации 25 мкг/мл, и инкубировали при 37°С в термостатированном шейкере роторного типа в течение ночи при 250 об/мин. Разводили культуру свежей LB средой до ОП₆₀₀ 0,1 ОЕ и инкубировали в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин 37°С до достижения культурой клеток ОП₆₀₀ 0,6-0,8 ОЕ. После этого осуществляли индукцию экспрессии целевого гена: добавляли ИПТГ (Invitrogen, США) к культуре до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали при 16°С в термостатированном шейкере роторного типа при 200 об/мин в течение ночи, после чего клетки концентрировали с помощью центрифугирования.

Осуществляли очистку полученных белков с использованием метода иммобилизованной металлоаффинной хроматографии с использованием сорбента Ni-НТУ сефарозы.

Осажденные клетки продуцентов лизировали с помощью 3 циклов соникации по 30 с с перерывом в 2 мин на льду. Затем проводили разрушение телец включения путем инкубации с лизирующим буфером, содержащим 500 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 6 М гуанидин гидрохлорид, 500 мМ хлористый натрий, в течение 1 ч. К клеткам, собранным центрифугированием из 50 мл культуры, добавляли по 8 мл лизирующего буфера.

Колонку, содержащую Ni-НТУ сефарозу, предварительно уравновешивали буфером для нанесения (500 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 8 М мочевина, 500 мМ хлористый натрий, 10 мМ имидазол). Разрушенные тельца включения наносили на колонку. Далее промывали колонку двумя объемами буфера для нанесения (500 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 8 М мочевина, 500 мМ хлористый натрий, 10 мМ имидазол). После этого промывали колонку тремя объемами буфера для промывки (500 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 8 М мочевина, 500 мМ хлористый натрий, 30 мМ имидазол). Элюировали белок с помощью 5 мл буфера для элюции (500 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 8 М мочевина, 500 мМ хлористый натрий, 200 мМ имидазол). Собирали фракции по 1 мл, анализировали электрофоретически в 10, 12% ПААГ-ДДс-Na, фракции с целевым белком объединяли, концентрацию белка в них определяли по методу Бредфорд.

1.2. Получение белков Ag85B, Tb10.4 Mycobacterium tuberculosis и FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium с использованием эукариотической системы.

Аминокислотные последовательности белков Ag85B и Tb10.4 Mycobacterium tuberculosis, взятые из специализированной базы данных Tuberculist [11], а также аминокислотная последовательность белка FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, номер в базе GenBank BAA02846.1, перевели в нуклеотидные последовательности, одновременно проведя кодонную оптимизацию для Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), а также добавив сайты для клонирования в вектор для экспрессии в данном микроорганизме, pYES2/NT (Invitrogen, USA). Гены синтезировали химически.

Каждый полученный ген клонировали в векторе pYES2/NT по методике, аналогичной таковой при использовании прокариотической системы. Далее проводили трансформацию клеток S. cerevisiae. Дрожжи культивировали в среде YPD до достижения середины логарифмической фазы роста, промывали 10 мМ буфером ТЕ. Клетки, содержащиеся в 100 мл среды, ресуспендировали в 5 мл 10 мМ Трис HCl буфера (рН 7,5), содержащего 40,5% ПЭГ-4000, 0,1 М ацетата лития. К 0,5 мл суспензии клеток добавляли 1 мкг плазмидной ДНК, перемешивали и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, Далее 50 мкл суспензии клеток высевали на селективную среду для отбора трансформантов. Осуществляли скрининг клонов.

Полученные штаммы-продуценты выращивали в среде YPD на ротационной качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 28°С в течение 21-24 ч. В 5-литровый ферментер Biostat, содержащий 2000 мл среды YPD, вводили 80 мл посевного материала. Ферментацию проводили при температуре 28°С, аэрации 1 л/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин. Через 24 ч после засева ферментера подпитывали среду культивирования 50%-ным раствором глюкозы со скоростью 2 мл/ч и устанавливали рНстатирование культуры на уровне рН 6.8±0.1, используя для регулировки растворы 10% серной кислоты и 10% NaOH. Среднее общее время ферментирования составило 70 ч.

Проводили выделение и очистку каждого белка из водонерастворимой фракции клеток штамма

- 4 031495 продуцента. При наращивании биомассы дрожжей S. cerevisiae в 5-литровом ферментере на среде YPD без подпитки в присутствии 2% глюкозы в стартовой среде с одной ферментации получали, в среднем, 800-900 г влажной клеточной биомассы. 1,5 кг промытой влажной биомассы ресуспендировали в буфере для разрушения, клетки разрушали с помощью стеклянных шариков в проточной мельнице в течение 1,5 ч, центрифугировали полученную суспензию и собирали осадок. Экстракцию целевого белка из осадка осуществляли с помощью раствора 10% лития хлористого в 90%-ной муравьиной кислоты в течение 1518 ч с последующим центрифугированием. Осадок отбрасывали, а супернатант подвергали ультрафильтрации с последующей диафильтрацией через мембрану M15 для перевода в 10 мМ ацетат натрия, рН 4,0 и удаления белков клеток штамма-продуцента.

Проводили дегликозилирование белков с помощью эндо-З-Ы-ацетилглюкозаминидазы Н в 50 мМ натрий-цитратном буфере (рН 5,5) при 37° в течение 13 ч в присутствии 0,01% ДСН.

Окончательную очистку белков проводили с помощью ионнообменной хроматографии на катионообменной колонке HiPrep 16/10 SP FF (GE Healthcare) в системе ФПЛС. После прохождения фильтрата через колонку и последующей промывки колонки 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,0 и затем 10 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 4,0, белок элюировали с колонки 10%-ным раствором NaCl в том же буфере и идентифицировали электрофоретически в 10, 12% ПААГ-ДДс-Na, фракции с целевым белком объединяли, концентрацию белка в них определяли по методу Бредфорд.

Для получения иммуногенных белков - агентов вакцины по настоящему изобретению могут быть использованы и иные прокариотические и эукариотические системы с дальнейшей специфичной очисткой и обработкой.

Использование живых систем для получения белков - компонентов вакцины позволяет получить белки природной структуры, гомогенную смесь в больших количествах в краткие сроки, при этом ни их производство, ни использование не несет рисков, связанных с безопасностью. Производство является не сложным и экономически выгодным, что положительно отражается на стоимости вакцины.

Полученные высокоочищенные белки смешивали в равном соотношении и использовали для иммунизации лабораторных животных.

Пример 2. Демонстрация профилактического эффекта вакцины.

Эксперимент выполнен на белых мышах неинбредных линий (питомник лабораторных животных Рапполово). Животные весом 19-22 г содержались в стандартных условиях при температуре окружающей среды 27±2°С с постоянной влажностью воздуха 55%, при 12-часовом световом дне, получали сухой стандартизованный корм и воду без ограничения.

Группы животных (число мышей в группе): интактные (5) - К-, контроль заражения (15) - К+, вакцинация БЦЖ (25) - 1, вакцинация Ag85B+Tb10.4+FliC в/м (20) - 2, вакцинация Ag85B+Tb10.4+FliC и/н (15) - 3.

Осуществляли однократную иммунизацию БЦЖ и двукратную иммунизацию вакциной на основе рекомбинантных белков Ag85B, Tb10.4, FliC, с интервалом в 2 недели. Использовали дозу 50 мкг белка на мышь (в равных долях Ag85B, Tb10.4 и FliC), вводили в объеме 100 мкл внутримышечно или 10 мкл интраназально, по 5 мкл в каждую ноздрю. Для доведения требуемого объема использовали физиологический раствор.

Заражение осуществляли через 10 дней после последней вакцинации. Для моделирования туберкулеза использован стандартный тест-штамм М. tuberculosis Erdman. Микобактериальная суспензия для заражения мышей приготовлена ex tempore из трехнедельного штамма, культивируемого на среде Левенштейна-Йенсена. Заражающая доза - 10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мышь в 0,2 мл физраствора, путь введения в латеральную хвостовую вену.

Мыши выведены из опыта через шесть недель после заражения путем декапитации в соответствии с методическими рекомендациями МЗ СССР (1985).

Определяли показатели тяжести течения туберкулезной инфекции.

1. Коэффициенты массы легких (КМЛ) и селезенки (КМС) рассчитывали по формуле в условных единицах: масса органа (г) х 100 масса тела (г).

2. Индекс поражения легких (ИПЛ) устанавливали по совокупности экссудативных и продуктивных изменений в условных единицах - баллах [12].

Экссудативные изменения:

легкие воздушны - 0, единичные безвоздушные очаги - 0,25, легкие безвоздушны на 1/2 - 0,5, легкие безвоздушны на 2/3 - 0,75, легкие безвоздушны на всем протяжении - 1,0.

- 5 031495

Продуктивные очаги:

единичные субмилиарные очаги - 0,5, многочисленные (не более 20) - 1,0, многочисленные субмилиарные (более 20) - 1,5, единичные милиарные - 1,75, многочисленные сливающиеся субмилиарные и единичные милиарные - 2,0, многочисленные милиарные (не более 10) - 2,25, многочисленные милиарные, сливающиеся - 2,75, появление мелких казеозных некротических фокусов - 3,0, обширный казеоз - 4,0, сплошное поражение легких - 5,0.

3. Бактериологические показатели.

Проводили дозированный посев гомогената ткани легких на плотную яичную среду ЛевенштейнаИенсена методом серийных разведений (3 и 4 разведение). Определяли массивность роста микобактерий и рассчитывали индекс защиты органа. Массивность роста микобактерий выражали в десятичном log (lg) от числа КОЕ на массу легких. Расчет индекса защиты органа осуществляли по разнице между lg КОЕ иммунизированных мышей и lg КОЕ мышей группы контроля заражения. При оценке результатов положительным эффектом по задержке роста микобактерий считается индекс защиты >0,5 lg.

Результаты приведены на фиг. 1-6. Проведенные исследования продемонстрировали эффективность вакцинации белками Ag85B, Tb10.4, FliC большую, чем БЦЖ, причем как при внутримышечном введении, так и при интраназальном введении. Также выявлено, что различия между группами достоверные.

Так, по коэффициенту массы легких (КМЛ) (фиг. 1) лидирующую позицию заняла вакцина на основе белков Ag85B, Tb10.4, FliC, введенная внутримышечно, группа 2, данный показатель оказался минимальным среди сравниваемых групп, на втором месте оказалась БЦЖ, группа 1, на третьем - вакцина на основе белков Ag85B, Tb10.4, FliC, введенная интраназально, группа 3. Однако именно вакцина на основе белков Ag85B, Tb10.4, FliC, введенная интраназально, группа 3, показала наилучший результат при измерении индекса поражения легких (ИПЛ) (фиг. 2) и коэффициента массы селезенки (КМС) (фиг. 3). В случае показателя ИПЛ второй по эффективности оказалась группа 2, представленная также смесью белков Ag85B, Tb10.4, FliC, но введенной внутримышечно, последнее место заняла БЦЖ. В случае показателя КМС второй по эффективности оказалась группа 1, БЦЖ, далее - смесь белков Ag85B, Tb10.4, FliC, введенная внутримышечно. По показателю десятичного логарифма числа жизнеспособных бактерий в легких смесь белков Ag85B, Tb10.4, FliC при обоих способах введения оказалась эффективнее БЦЖ (фиг. 4), наилучший показатель достигнут при интраназальном введении. Показано, что положительным эффектом по задержке роста микобактерий, показатель индекс защиты по сравнению с невакцинированными животными, фиг. 5, обладает лишь смесь белков Ag85B, Tb10.4, FliC, причем при интраназальном введении (1,08) группа 3, - практически в два раза большим, по сравнению с таковым при внутримышечном введении (0,58) группа 2, и практически в три раза большим, чем БЦЖ, группа 1. Данный индекс защиты БЦЖ оказался значительно ниже >0,5 lg, - 0,37 lg, - что говорит об отсутствии положительного эффекта по задержке роста микобактерий данной вакциной. Индекс защиты по сравнению с БЦЖ (фиг. 6) смеси белков Ag85B, Tb10.4, FliC, введенной внутримышечно, группа 2, составил 0,21, а таковой при интраназальном введении, группа 3, -0,71.

Таким образом, продемонстрирована высокая эффективность противотуберкулезной вакцины на основе рекомбинантных белков - антигенов Ag85B и ТВ10.4 M. tuberculosis, а также рекомбинантного адъюванта - флагеллина FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, которая оказалась больше, чем таковая БЦЖ, в профилактической модели, на лабораторных животных, и при внутримышечном, и при интраназальном введении, причем наиболее высокие показатели наблюдали в последнем случае. Возможны и иные парентеральные либо иные мукозальные способы введения данной вакцины. Различия между группами животных достоверны.

Также продемонстрирована безопасность предлагаемой вакцины: животные соответствующих групп (групп 2 и 3) выжили и были выведены из эксперимента принудительно, в процессе испытаний побочные эффекты не наблюдали.

Список использованной литературы.

1. http://www.who.int/immunization/research/forums_and_initiatives/07_Evans_GVIRF_TB_Vacc ine_Progress.pdf.

2. WO 96/15241, дата приоритета 14.11.94 US.

3. ЕА 012037 В1, дата приоритета 16.11.2004.

4. WO 2008150969 A9, дата приоритета 31.05.2007.

5. WO 2006053871 A2, дата приоритета 16.11.2004.

6. R.R. Redfield et al., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola et al., Arch. Intern. Med. 149, 1569 (1989).

7. WO 2008/000261 A2, дата приоритета 28.06.2006.

- 6 031495

8. Mc Dermott P.F. High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. - 2000. - V. 68. - p. 5525-5529.

9. Means ТХ et al. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J. Immunol. - 2003. - V. 170. - p. 5165-5175.

10. Baker S., Hardy J., Sanderson K.E. et al. A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog, 2007, 3(5): e59. doi:10.1371/journal.ppat.0030059.

11. Lew J.M., Kapopoulou A., Jones L.M., Cole S.T. TubercuList - 10 years after. Tuberculosis (Edinb). Jan 91(1):1-7 (2011).

12. Александрова А.Е., Ариэль Б.М. Оценка тяжести туберкулезного процесса в легких мышей// Пробл. туб., 1993. - № 3. - с. 52-53.

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Противотуберкулезная вакцина, содержащая рекомбинантные белки Ag85B и TB10.4 M. tuberculosis, рекомбинантный адъювант флагеллин FliC Salmonella enterica serovar Typhimurium, а также фармацевтически приемлемый эксципиент.
2. 2. Вакцина по п.1, характеризующаяся тем, что является мукозальной либо парентеральной.

   ИПЛ, у.е.

   к- о