CN116514993A - 一种肝吸虫口服芽孢疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝吸虫口服芽孢疫苗及其制备方法，涉及生物技术领域。该肝吸虫口服芽孢疫苗，包括一种重组芽孢杆菌，该重组芽孢杆菌包括一种重组表达载体，该重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的编码基因。本发明将具有免疫佐剂效应的霍乱毒素B亚基(CTB)与芽孢表面的抗原分子CsPmy相融合表达。利用CTB与肠粘膜的强烈粘附作用，增强芽孢疫苗在肠道中的定植。但是CTB与CsPmy的直接融合表达在芽孢表面并不能显著增强芽孢的粘附效果，本发明通过增加一段短肽，使CTB分子与CsPmy分子间的空间增加，促进CTB蛋白的正确折叠，从而保持其功能，进而显著提升芽孢在肠道中的定植。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种肝吸虫口服芽孢疫苗及其制备方法。
背景技术
肝吸虫，又称为华支睾吸虫(Clonorchis sinensis，C.sinensis)，是一种常见的人兽共患食源性寄生虫。截至目前，全球预计约有2亿人受肝吸虫的感染威胁，有3,500万人感染，其中150-200万感染者出现明显消化系统和肝胆系统临床症状，每年大约超过5000人因为该病死亡。人或哺乳动物是在食用含有活的华支睾吸虫囊蚴的淡水鱼虾之后而感染。华支睾吸虫在宿主体内长期寄生，虫体的分泌排泄抗原刺激和对肝脏胆管等的机械损伤作用，易引发胆道感染、胆囊炎、胆管阻塞，甚至引发胆管癌、肝纤维化、肝硬化、肝癌等严重疾病。
以往华支睾吸虫的防控主要是依靠建立防治示范区：对流行区人群健康教育、化学药物治疗感染者、管理粪便等综合防治措施。短期内曾取得一定的防治效果，但是耗费大量人力物力，且华支睾吸虫的流行实际上具有反弹趋势。主要有以下几方面原因：首先，主要是流行区的人群很难改变吃生鱼片等不良的饮食习惯，患者即便进行药物驱虫后，很容易因此而再次感染肝吸虫；其次，治疗肝吸虫感染的驱虫药如阿苯达唑、吡喹酮等并非针对华支睾吸虫的特效药物，治疗时的药物用量大，生物利用度低，患者服药依从性较差；此外，肝吸虫除了人是终宿主外，还有多种食鱼动物猫、狗、其他啮齿类食鱼动物等也可以感染肝吸虫。这些动物活动范围广泛，粪便管理极为困难，粪便中的虫卵极易在入水后被第一中间宿主淡水螺摄取，构成完整的肝吸虫生活史。因此，肝吸虫“保虫宿主”为肝吸虫的流行创造了新的条件，增加了人群肝吸虫感染的潜在风险，为其防控带来极大困难。
淡水鱼是肝吸虫感染的第二中间宿主，人或哺乳动物就是食入含有感染性囊蚴的鱼肉而感染的肝吸虫。如果能够阻断淡水鱼体内的囊蚴感染则有望切断肝吸虫的生活史，同时阻断人和动物的肝吸虫感染，从而彻底控制肝吸虫的流行传播。国内外的研究显示，淡水鱼所属的硬骨鱼已具备完善的免疫系统：包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子。鱼类的消化道粘膜上皮，体表皮肤，鱼鳃等处均分布有免疫细胞和组织。病原体抗原分子通过不同的免疫途径刺激鱼体之后，鱼体的免疫系统受到激发后释放针对抗原分子的特异性抗体或者其他免疫活性成分，当鱼体再次受到病原攻击时能够通过特定的方式(如中和抗原)阻碍病原体的入侵。
现有技术已经利用益生菌枯草芽孢杆菌芽孢作为口服疫苗载体，将肝吸虫的抗原分子CsPmy与枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC融合表达在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，构成B.s-CotC-CsPmy芽孢疫苗并且将其作为口服疫苗免疫草鱼。该疫苗能够刺激鱼体免疫系统产生特异性免疫，且疫苗的免疫保护效果在50％左右。此口服疫苗的免疫保护效果仍然有较大的提升空间。影响口服疫苗保护的主要原因之一是枯草芽孢杆菌芽孢在口服免疫后大部分芽孢疫苗随着肠道蠕动和粪便一起排出到体外，只有少部分能够成功刺激鱼体肠道黏膜引发免疫反应。因此，如何增加芽孢疫苗与鱼肠道的粘附和定值，成为了亟待解决的重要技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝吸虫口服芽孢疫苗及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该肝吸虫口服芽孢疫苗可以有效提升芽孢在肠道中的定植，进而可以增强芽孢疫苗的免疫保护效果。
霍乱毒素(CT)是霍乱狐菌致病的毒力因子，是由一个A亚基(CTA)和五个无毒力的B亚基(CTB)构成的六聚体。其中A亚基具有肠道毒性，而B亚基无毒性，但能与有核细胞细胞膜上的神经节苷脂(GM1)结合。由于这一特性，霍乱毒素B亚基能够增强与其一同免疫的抗原分子的免疫刺激作用，因而CTB被认为是极其具有潜力的粘膜免疫佐剂分子。本发明发现将CTB与华支睾吸虫候选抗原分子CsPmy融合表达，能够利用CTB与肠道黏膜细胞膜表面GM1结合的特性，增加抗原分子与肠道粘膜接触的时间，从而增加芽孢疫苗在肠道中定植，进而增加抗原分子的黏膜免疫刺激作用。
但由于蛋白功能受蛋白空间结构的影响，直接将CTB融合表达在CsPmy的N端会影响CTB分子的空间结构，从而减弱CTB作为肠道粘附剂的功能。因此，本发明通过在CTB和CsPmy之间引入一段含有13个氨基酸残基(GGGSSTTTPGGGS)的链接肽链，将CsPmy与CTB融合表达在枯草芽孢杆菌的表面，构建成粘附增强型芽孢(B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB)，可以显著增强疫苗在肠道黏膜上的粘附效率，进而可以增强疫苗的免疫保护效果。
基于此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种肝吸虫抗原融合蛋白，所述肝吸虫抗原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供上述的肝吸虫抗原融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供一种重组表达载体，包括上述的编码基因。
本发明还提供一种重组芽孢杆菌(Bacillus)，包括上述的重组表达载体。
进一步地，所述重组芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
本发明还提供一种肝吸虫口服芽孢疫苗，包括上述的重组芽孢杆菌。
进一步地，所述肝吸虫口服芽孢疫苗还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供上述的肝吸虫抗原融合蛋白、编码基因、重组表达载体或重组芽孢杆菌在制备肝吸虫口服芽孢疫苗中的应用。
本发明还提供一种上述的肝吸虫口服芽孢疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将如SEQ ID NO.5所示的编码基因连接入表达载体，得到重组表达载体；
(2)将所述重组表达载体转化入芽孢杆菌，之后筛选得到重组芽孢杆菌；
(3)以所述重组芽孢杆菌为原料，制备得到所述肝吸虫口服芽孢疫苗。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将具有免疫佐剂效应的CTB与芽孢表面的抗原分子CsPmy相融合表达，利用CTB与肠粘膜的强烈粘附作用，来增强芽孢疫苗在肠道中的定植。但是CTB与CsPmy的直接融合表达在芽孢表面并不能显著增强芽孢的粘附效果，本发明通过增加一段短肽(linker)，使CTB分子与CsPmy分子间的空间增加，促进CTB蛋白的正确折叠，从而保持其功能，进而显著提升了芽孢在肠道中的定植。利用本发明的方法可以显著提高疫苗的免疫保护效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为粘附增强型芽孢B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB的示意图；
图2为PEB03-CotC-CsPmy-linker-CTB质粒的验证结果；其中，M：Marker；CsPmy：2595bp片段；CTB：255bp片段；
图3为SDS-PAGE验证B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB芽孢表面的CsPmy-linker-CTB蛋白分子表达的结果；其中，M：Marker；CsPmy-CTB：B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB芽孢；CTB：B.s-CotC-CTB空载芽孢；CsPmy：B.s-CotC-CsPmy芽孢。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
霍乱毒素(CT)是霍乱狐菌致病的毒力因子，是由一个A亚基(CTA)和五个无毒力的B亚基(CTB)构成的六聚体。其中A亚基具有肠道毒性，而B亚基无毒性，但能与有核细胞细胞膜上的神经节苷脂(GM1)结合。由于这一特性，霍乱毒素B亚基能够增强与其一同免疫的抗原分子的免疫刺激作用，因而CTB被认为是极其具有潜力的粘膜免疫佐剂分子。本发明发现将CTB与华支睾吸虫候选抗原分子CsPmy融合表达，能够利用CTB与肠道黏膜细胞膜表面GM1结合的特性，增加抗原分子与肠道粘膜接触的时间，从而增加芽孢疫苗在肠道中定植，进而增加抗原分子的黏膜免疫刺激作用。
但由于蛋白功能受蛋白空间结构的影响，直接将CTB融合表达在CsPmy的N端会影响CTB分子的空间结构，从而减弱CTB作为肠道粘附剂的功能。因此，本发明通过在CTB和CsPmy之间引入一段含有13个氨基酸残基(GGGSSTTTPGGGS)的链接肽链，将CsPmy与CTB融合表达在枯草芽孢杆菌的表面，构建成粘附增强型芽孢B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB(疫苗示意图见图1)，可以显著增强疫苗在肠道黏膜上的粘附效率，进而可以增强疫苗的免疫保护效果，具体详述如下：
以下实施例中使用的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自上海英潍捷基贸易有限公司，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600购自北纳生物。
实施例1
1.材料方法
1.1表达载体构建
根据CTB序列(SEQ ID NO.1)人工合成CTB DNA作为PCR模板。设计同源重组引物primer 1-F/primer1-R(序列见表1)，以上述序列为模板经PCR扩增，进行PCR产物回收。PEB03-CotC-CsPmy为前期实验构建(已在文献“Bacillus subtilis spore with surfacedisplay of paramyosin from Clonorchis sinensis potentializes a promising oralvaccine candidate”中公开)，用Sac I酶将PEB03-CotC-CsPmy进行单酶切，使得质粒线性化。用同源重组试剂盒(II One Step Cloning Kit，南京诺唯赞)将PCR产物与线性化的PEB-CotC-CsPmy质粒连接，构建得到PEB03-CotC-CsPmy-CTB重组质粒。根据linker序列以及CTB序列，设计多片段同源重组引物primer2-F/primer2-R以及primer3-F/primer3-R(序列见表1)。扩增出相应片段后，采用同源重组试剂盒分别构建PEB03-CotC-CsPmy-CTB和PEB03-CotC-CsPmy-linker-CTB质粒。重组质粒转化DH5α感受态细胞进一步进行质粒扩增。挑取单克隆菌落进行菌液PCR验证。对阳性菌落进一步送测序验证。
表1引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| primer1-F | ACGAGCATGATGTAAGAGCTCACACCTCAAAATATTACTG | SEQ ID NO.9 |
| primer1-R | TACTCACCGTTTCACGATCTCGAGTAACTTTTCGACTTTAG | SEQ ID NO.10 |
| primer2-F | ACGAGCATGATGTAAGAGCTCGGCGGAGGCTCATCG | SEQ ID NO.11 |
| primer2-R | TAATATTTTGAGGTGTGAGCTCTGAGCCACCTCCCGG | SEQ ID NO.12 |
| primer3-F | CCGGGAGGTGGCTCAACACCTCAAAATATTA | SEQ ID NO.13 |
| primer3-R | TACTCACCGTTTCACGATTAACTTTTCGACTT | SEQ ID NO.14 |
注：下划线表示酶切位点。
1.2载体转化WB600及芽孢表面CTB表达验证
提取DH5α中经验证的PEB03-CotC-CsPmy-CTB和PEB03-CotC-CsPmy-Linker-CTB质粒。采用化学法，将PEB03-CotC-CsPmy、PEB03-CotC-CsPmy-CTB和PEB03-CotC-CsPmy-Linker-CTB质粒转化进入枯草芽孢杆菌WB600菌株感受态中。扩增后进行菌液PCR验证鉴定以及测序验证。之后诱导芽孢形成，获得B.s-CotC-CsPmy芽孢、B.s-CotC-CsPmy-CTB芽孢和B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB芽孢。
1.3肠道定植效果比较
4-6周大小的BalB/C小鼠共30只，随机分为A、B、C三组，每组10只小鼠。三组小鼠分别灌胃方式给予1×105CFU(溶于0.1mL PBS)的B.s-CotC-CsPmy芽孢、B.s-CotC-CsPmy-CTB和B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB芽孢。一周后，小鼠饥饿处理4小时，安乐死处死小鼠，超净工作台上取出小鼠肠道。各加入无菌生理盐水5mL，对肠道组织进行匀浆处理。取匀浆后液体，用无菌PBS进行梯度稀释10倍，取100μL稀释后液体涂壮观霉素抗性的LB平板。待平板干燥后倒扣平板放入37℃温箱，过夜培养后12h之后，观察平板中菌落数量。统计分析各组小鼠肠道中枯草芽孢杆菌的数量，采用t检验进行统计分析。
1.4免疫效果比较
1.4.1免疫
4-6周大小的BalB/C小鼠共80只，随机分为D、E、F和G四组，每组20只小鼠。D-F组小鼠分别在第0、1、2、16、17、18、33、34和35天，灌胃方式分别给予1×105CFU(溶于0.1mLPBS)的B.s-CotC-CsPmy芽孢、B.s-CotC-CsPmy-CTB和B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB芽孢。G组小鼠灌胃方式给予0.1mLPBS，时间同D-F组。
1.4.2抗体检测
分别在首次免疫后第二周(2w)、第4周(4w)和第6周(6w)，麻醉处死每组中5只小鼠，收集并保存肠粘液，之后酶联免疫吸附实验检测其中的CsPmy特异性sIgA抗体，检测方法同文献“Bacillus subtilis spore with surface display of paramyosin fromClonorchis sinensis potentializes a promising oral vaccine candidate”。
2.结果
2.1 PEB03-CotC-CsPmy-linker-CTB质粒构建的验证
将PEB03-CotC-CsPmy-linker-CTB转化DH5α感受态细胞的转化产物放置于摇床经37℃，150rpm，90分钟后，在超净台中将转化产物均匀涂布在壮观霉素抗性的LB平板上。待平板干燥后，倒扣平板置于3℃温箱中孵育过夜。第二挑取平板上的单克隆菌落。分别用CsPmy和CTB分子的特异性引物做菌液PCR。验证载体构建是否成功。结果如图2。转化后的菌落成功扩增出CsPmy(2595bp)和CTB(255bp)片段。CsPmy-linker-CTB的核酸序列和氨基酸序列见文末。
2.2芽孢表面CTB蛋白表达验证
从DH5α菌中提取出PEB03-CotC-CsPmy-linker-CTB质粒后转化枯草芽孢杆菌WB600菌株，用DSM培养基诱导芽孢形成。芽孢纯化后取10μL芽孢液体进行SDS-PAGE分析。同时取B.s-CotC-CsPmy芽孢和B.s-CotC-CTB芽孢作为对照。其中B.s-CotC-CTB芽孢的构建过程参见文献“Bacillus subtilis spore with surface display of paramyosin fromClonorchis sinensis potentializes a promising oral vaccine candidate”
结果在相应的位置出现CsPmy-linker-CTB条带(图3中箭头所示)。结果提示CSPmy-linker-CTB成功表达于芽孢表面。
2.3芽孢在小鼠体内粘附增强效果的评估
将三组不同的芽孢分别灌胃小鼠一周后，检测小鼠肠道中枯草芽孢杆菌芽孢的定植数量。结果如表2所示。结果显示，投喂芽孢1周后，B.s-CotC-CsPmy-CTB组小鼠肠道中的芽孢数量略多于B.s-CotC-CsPmy芽孢组；而B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB组小鼠肠道中定值的芽孢数量显著多于其他两组(P<0.001)。提示在CTB前增加一段短肽linker(SEQ IDNO.4)能够显著促进芽孢在小鼠肠道中的粘附，增强其在肠道的定植。
表2三种芽孢灌胃小鼠1周后肠道中定值的芽孢数量对比
注：a：P<0.05，b：P<0.01。
2.4免疫效果评估结果
对免疫小鼠的肠粘液进行CsPmy特异性IgA抗体检测的结果见表3。根据表3可以看出，B.s-CotC-CsPmy、B.s-CotC-CsPmy-CTB和B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB都可以有效提升抗体水平，其中B.s-CotC-CsPmy-linker-CTB的特异性IgA抗体水平最高，这说明，将CTB与CsPmy融合表达，确实可以提高芽孢在小鼠肠道中的粘附效果，并且本发明在CTB前增加一段短肽linker，使得芽孢在小鼠肠道中的粘附更强，进一步增强其在肠道的定植，进而提高了疫苗的肠道免疫刺激效果。本发明的疫苗构建策略是成功的，疫苗的免疫刺激效果显著。
表3芽孢疫苗免疫小鼠后肠道粘液中的sIgA抗体水平测定结果
注：**：p<0.05(E组VS F组)；***p<0.01(E组VS F组)
综上所述，本发明将具有免疫佐剂效应的CTB与芽孢表面的抗原分子CsPmy相融合表达。利用CTB与肠粘膜的强烈粘附作用，来增强芽孢疫苗分子在肠道中的定植。但是CTB与CsPmy直接融合表达在芽孢表面并不能显著增强芽孢的粘附效果，而增加一段短肽(linker)则能够显著提升芽孢在小鼠肠道中的定植。本发明分析认为，这可能是由于增加一段linker后CTB分子与CsPmy分子间的空间增加，有利于CTB蛋白的正确折叠，从而保持其功能。利用本发明的方法可以显著提高疫苗的免疫保护效果。
本发明的序列说明：
CTB的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
ACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTA。
CTB的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
TPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKL。
linker核酸序列(SEQ ID NO.3)：
GGCGGAGGCTCATCGACTACGACACCGGGAGGTGGCTCA。
linker氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：GGGSSTTTPGGGS。
CsPmy-linker-CTB的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：
ATGAGTCACGAGTCGGAATCACACGTCAAAATTTCTCGTACAATCTACCGCGGTGTGTCACCCAGTACTTCACGTTTGGAAAGTCGTGTACGTGAACTTGAAGACATGCTTGATCTGGAACGCGATGCACGAGTCCGGGCTGAACGACATGCCGCTGACATGAGCTTCCAAGTAGACGCACTCAGTGAACGACTTGACGAAGCTGGAGGAAATTCAAGTCAGACGCATGAGCTTCTTAAGCGTCGTGAGATGGAAATTGCGAAGCTACGAAAAGATTTGGAGAACGCAAATGCCTCATTGGAAATGGCTGAGACTTCAATGCGCCGCAGACATCAGACCGCACTGAACGAACTTTCCGCTGAAGTGGAAAATTTGCAAAAGCAAAAGGGAAAGGCCGAAAAAGACAAGAACAGCCTCATTATGGAAGTGGACAACGTTCTTGGGCAACTGGATGGGGCACTGAAAGCAAAGCAATCGGCAGAATCCAAGCTGGAGGGTTTGGATGCACAACTTAACCGATTGAAAGGCTTAACAGATGACTTGCAGCGGCAACTGAATGACTTGAATGCAGCGAAAGCCCGCCTCACATCCGAAAACTTTGAACTCCTGCATGCAAATCAAGAATACGAAGCACAAGTCCTCAATCTCTCAAAGGCAAGGTCTTCACCTGAGAGCGCCGTTGATGACCTAAAGAGGTCACTTGATGATGAAGCAAAGAGCCGATTCAACCTTCAAGCTCAACTGACCTCGTTGCAAATGGACTACGACAACCTGCAAGCGAAGTATGAGGAAGAGAGTGAGGAAGCTAGTAACTTGAGGATCCAAGTTTCTAAATTCAATGCTGATTTGGCTGCGATGAAATCGAAATTCGAACGAGAGCTCATGTCAAAAACTGAGGAATACGAAGAACTCAAGCGGAAGTTAACGCTCCGAATCACGGAGTTGGAAGATACCGCAGGACGTGAACGTGCCAGAGCATCAAACCTGGAAAAGATCAAGGCCAAGCTGACCATCGAAATTAAGGATCTCCAAAATGAAGTTGACAGCTTATCTGCTGAGAATGCTGAGCTGGCACGTCGGGCTAAAGCCGCCGAAAGCCCTGCCAATG
ACTTACAACGCCGTCTAGATGAGATGACCATTGAAATCAACAATCTCCACTCGCAAAAC
AGCCAATTGGAGGCAGAGAATATGCGACTCAAGAGTCAGGTAAATGACCTGGTGGACA
AAAACGCTGCTCTTGACCGTGAAAACCGCCAACTCTCTGATCAAGTTAAGGAGCTCAA
GTCCACTCTACGGGATGCAAACAGGCGACTCACAGATTTAGAAGCCCTACGGTCTCAAC
TTGAGGCGGAACGGGATAATTTGGCATCCGCTTTGCATGATGCAGAAGAAGCCCTGCGG
GAAGTAGATCAGAAATATCAAAACGCTCAGGCTGCTTTGAACCATCTAAAATCAGAAAT
GGAACAGAGACTTCGGGAGAAGGACGAGGAGCTAGAAACCCTTCGAAAAACTACCAC
CCGCACTATTGAGGAGTTAACGGTTACAATCACGGAGATGGAGGTGAAATACAAGTCAG
AGCTTTCCCGATTAAAGAAGCGATACGAATCCAACATTGCTGAGTTGGAGCTTCAACTT
GACACTGCGAATAAGGCAAATGCAAACCTAATGAAGGAAAATAAAACTCTTGCACAGC
GCGTCAAAGACCTCGAGGCATTCTTGGAAGAAGAACGTCGCCTGCGTGAGGCTGCAGA
ATCGAACTTGCAGGCTAGCGAACGCAAGCGAATTCAGCTATCGAGCGAGGTTGAAGAG
TTACGTGGTGCCTTAGAAGCCGCCGATCGGGCACGCAAGCATGCTGAAAATGAGATGAA
CGAAGCACAGACTCGTGTTAGCGAGCTCACCATGCAAGTCTACACTCTGACCAATGATA
AACGCCGTCTGGAAGGAGACATCAGCGTGATGCAAGCAGACATGGACGAAGCAATCAA
CGCAAAAGCGGGTGCCGAAGACAGAGCGACGCGCCTCAACTCTGAAGTGCTTCGATTG
GCCGACGAGCTTCGACAGGAGCAAGAGAATTACAAACATGCTGAGGCTTTGAGAAAAC
AACTTGAGGTGGAGATTCGGGAAATCACTGTCAAGCTGGAGGAAGCCGAAGCATTTTC
GGCTCGTGAAGGACGTAGAATGGTTCAAAAGTTGCAGACTCGTGTTCGCGAGCTCGAA
GCCGAATTTGATGCAGAATCTCGGAGATGCAAGGAAGCTCTGGCCGCAGCCCGCAAGTT
CGAGCGTCAGTACCGAGAGCTTCAGACACAAGCCGAAGATGACCGACGAATGGTGCTT
GAGCTTCAGGACTTGCTGGACAAGACTCAAATGAAGATGAAGGCCTACAAGCGCCAAT
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ACAGATCGAGGAAGCTGAGCATCGTGCAGATATGGCTGAGAGAACTGTGACAATTAAAC
GCATAGGACCAGGGCGTGCTGGATCCGTAGTTCGTGAATTATCCGTAACCACCAACAGG
GGAACGCGCGCGACGAGCATGATGTAAGAGCTCGGCGGAGGCTCATCGACTACGACAC
CGGGAGGTGGCTCAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACA
CAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGA
GAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGT
CAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGC
ATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTA。
CsPmy-linker-CTB的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：
MSHESESHVKISRTIYRGVSPSTSRLESRVRELEDMLDLERDARVRAERHAADMSFQVDALSERLDEAGGNSSQTHELLKRREMEIAKLRKDLENANASLEMAETSMRRRHQTALNELSAEVENLQKQKGKAEKDKNSLIMEVDNVLGQLDGALKAKQSAESKLEGLDAQLNRLKGLTDDLQRQLNDLNAAKARLTSENFELLHANQEYEAQVLNLSKARSSPESAVDDLKRSLDDEAKSRFNLQAQLTSLQMDYDNLQAKYEEESEEASNLRNQVSKFNADLAAMKSKFERELMSKTEEYEELKRKLTLRITELEDTAGRERARASNLEKIKAKLTIEIKDLQNEVDSLSAENAELARRAKAAESLANDLQRRLDEMTIEINNLHSQNSQLEAENMRLKSQVNDLVDKNAALDRENRQLSDQVKELKSTLRDANRRLTDLEALRSQLEAERDNLASALHDAEEALREVDQKYQNAQAALNHLKSEMEQRLREKDEELETLRKTTTRTIEELTVTITEMEVKYKSELSRLKKRYESNIAELELQLDTANKANANLMKENKTLAQRVKDLEAFLEEERRLREAAESNLQASERKRIQLSSEVEELRGALEAADRARKHAENEMNEAQTRVSELTMQVYTLTNDKRRLEGDISVMQADMDEAINAKAGAEDRATRLNSEVLRLADELRQEQENYKHAEALRKQLEVEIREITVKLEEAEAFSAREGRRMVQKLQTRVRELEAEFDAESRRCKEALAAARKFERQYRELQTQAEDDRRMVLELQDLLDKTQMKMKAYKRQLEEAEEVSQITMNKYRKAQQQIEEAEHRADMAERTVTIKRIGPGRAGSVVRELSVTTNRGTRATSMMELGGGSSTTTPGGGSTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKL。
CsPmy的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：
ATGAGTCACGAGTCGGAATCACACGTCAAAATTTCTCGTACAATCTACCGCGGTGTGTCACCCAGTACTTCACGTTTGGAAAGTCGTGTACGTGAACTTGAAGACATGCTTGATCTGGAACGCGATGCACGAGTCCGGGCTGAACGACATGCCGCTGACATGAGCTTCCAAGTAGACGCACTCAGTGAACGACTTGACGAAGCTGGAGGAAATTCAAGTCAGACGCATGAGCTTCTTAAGCGTCGTGAGATGGAAATTGCGAAGCTACGAAAAGATTTGGAGAACGCAAATGCCTCATTGGAAATGGCTGAGACTTCAATGCGCCGCAGACATCAGACCGCACTGAACGAACTTTCCGCTGAAGTGGAAAATTTGCAAAAGCAAAAGGGAAAGGCCGAAAAAGACAAGAACAGCCTCATTATGGAAGTGGACAACGTTCTTGGGCAACTGGATGGGGCACTGAAAGCAAAGCAATCGGCAGAATCCAAGCTGGAGGGTTTGGATGCACAACTTAACCGATTGAAAGGCTTAACAGATGACTTGCAGCGGCAACTGAATGACTTGAATGCAGCGAAAGCCCGCCTCACATCCGAAAACTTTGAACTCCTGCATGCAAATCAAGAATACGAAGCACAAGTCCTCAATCTCTCAAAGGCAAGGTCTTCACCTGAGAGCGCCGTTGATGACCTAAA
GAGGTCACTTGATGATGAAGCAAAGAGCCGATTCAACCTTCAAGCTCAACTGACCTCG
TTGCAAATGGACTACGACAACCTGCAAGCGAAGTATGAGGAAGAGAGTGAGGAAGCT
AGTAACTTGAGGATCCAAGTTTCTAAATTCAATGCTGATTTGGCTGCGATGAAATCGAA
ATTCGAACGAGAGCTCATGTCAAAAACTGAGGAATACGAAGAACTCAAGCGGAAGTT
AACGCTCCGAATCACGGAGTTGGAAGATACCGCAGGACGTGAACGTGCCAGAGCATC
AAACCTGGAAAAGATCAAGGCCAAGCTGACCATCGAAATTAAGGATCTCCAAAATGA
AGTTGACAGCTTATCTGCTGAGAATGCTGAGCTGGCACGTCGGGCTAAAGCCGCCGAA
AGCCCTGCCAATGACTTACAACGCCGTCTAGATGAGATGACCATTGAAATCAACAATC
TCCACTCGCAAAACAGCCAATTGGAGGCAGAGAATATGCGACTCAAGAGTCAGGTAA
ATGACCTGGTGGACAAAAACGCTGCTCTTGACCGTGAAAACCGCCAACTCTCTGATCA
AGTTAAGGAGCTCAAGTCCACTCTACGGGATGCAAACAGGCGACTCACAGATTTAGAA
GCCCTACGGTCTCAACTTGAGGCGGAACGGGATAATTTGGCATCCGCTTTGCATGATGC
AGAAGAAGCCCTGCGGGAAGTAGATCAGAAATATCAAAACGCTCAGGCTGCTTTGAAC
CATCTAAAATCAGAAATGGAACAGAGACTTCGGGAGAAGGACGAGGAGCTAGAAACC
CTTCGAAAAACTACCACCCGCACTATTGAGGAGTTAACGGTTACAATCACGGAGATGG
AGGTGAAATACAAGTCAGAGCTTTCCCGATTAAAGAAGCGATACGAATCCAACATTGC
TGAGTTGGAGCTTCAACTTGACACTGCGAATAAGGCAAATGCAAACCTAATGAAGGAA
AATAAAACTCTTGCACAGCGCGTCAAAGACCTCGAGGCATTCTTGGAAGAAGAACGTC
GCCTGCGTGAGGCTGCAGAATCGAACTTGCAGGCTAGCGAACGCAAGCGAATTCAGCT
ATCGAGCGAGGTTGAAGAGTTACGTGGTGCCTTAGAAGCCGCCGATCGGGCACGCAAG
CATGCTGAAAATGAGATGAACGAAGCACAGACTCGTGTTAGCGAGCTCACCATGCAAG
TCTACACTCTGACCAATGATAAACGCCGTCTGGAAGGAGACATCAGCGTGATGCAAGC
AGACATGGACGAAGCAATCAACGCAAAAGCGGGTGCCGAAGACAGAGCGACGCGCCT
CAACTCTGAAGTGCTTCGATTGGCCGACGAGCTTCGACAGGAGCAAGAGAATTACAAA
CATGCTGAGGCTTTGAGAAAACAACTTGAGGTGGAGATTCGGGAAATCACTGTCAAGC
TGGAGGAAGCCGAAGCATTTTCGGCTCGTGAAGGACGTAGAATGGTTCAAAAGTTGCA
GACTCGTGTTCGCGAGCTCGAAGCCGAATTTGATGCAGAATCTCGGAGATGCAAGGAA
GCTCTGGCCGCAGCCCGCAAGTTCGAGCGTCAGTACCGAGAGCTTCAGACACAAGCCG
AAGATGACCGACGAATGGTGCTTGAGCTTCAGGACTTGCTGGACAAGACTCAAATGAA
GATGAAGGCCTACAAGCGCCAATTGGAAGAAGCGGAGGAAGTATCGCAGATCACAAT
GAACAAATACCGCAAAGCACAGCAACAGATCGAGGAAGCTGAGCATCGTGCAGATAT
GGCTGAGAGAACTGTGACAATTAAACGCATAGGACCAGGGCGTGCTGGATCCGTAGTT
CGTGAATTATCCGTAACCACCAACAGGGGAACGCGCGCGACGAGCATGATGTAAGAGCTC。
CsPmy的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：
MSHESESHVKISRTIYRGVSPSTSRLESRVRELEDMLDLERDARVRAERHAADMSFQVDALSERLDEAGGNSSQTHELLKRREMEIAKLRKDLENANASLEMAETSMRRRHQTALNELSAEVENLQKQKGKAEKDKNSLIMEVDNVLGQLDGALKAKQSAESKLEGLDAQLNRLKGLTDDLQRQLNDLNAAKARLTSENFELLHANQEYEAQVLNLSKARSSPESAVDDLKRSLDDEAKSRFNLQAQLTSLQMDYDNLQAKYEEESEEASNLRNQVSKFNADLAAMKSKFERELMSKTEEYEELKRKLTLRITELEDTAGRERARASNLEKIKAKLTIEIKDLQNEVDSLSAENAELARRAKAAESLANDLQRRLDEMTIEINNLHSQNSQLEAENMRLKSQVNDLVDKNAALDRENRQLSDQVKELKSTLRDANRRLTDLEALRSQLEAERDNLASALHDAEEALREVDQKYQNAQAALNHLKSEMEQRLREKDEELETLRKTTTRTIEELTVTITEMEVKYKSELSRLKKRYESNIAELELQLDTANKANANLMKENKTLAQRVKDLEAFLEEERRLREAAESNLQASERKRIQLSSEVEELRGALEAADRARKHAENEMNEAQTRVSELTMQVYTLTNDKRRLEGDISVMQADMDEAINAKAGAEDRATRLNSEVLRLADELRQEQENYKHAEALRKQLEVEIREITVKLEEAEAFSAREGRRMVQKLQTRVRELEAEFDAESRRCKEALAAARKFERQYRELQTQAEDDRRMVLELQDLLDKTQMKMKAYKRQLEEAEEVSQITMNKYRKAQQQIEEAEHRADMAERTVTIKRIGPGRAGSVVRELSVTTNRGTRATSMMEL。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种肝吸虫抗原融合蛋白，其特征在于，所述肝吸虫抗原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述的肝吸虫抗原融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组芽孢杆菌(Bacillus)，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
6.一种肝吸虫口服芽孢疫苗，其特征在于，包括权利要求4或5所述的重组芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的肝吸虫口服芽孢疫苗，其特征在于，所述肝吸虫口服芽孢疫苗还包括药学上可接受的辅料。
8.一种如权利要求1所述的肝吸虫抗原融合蛋白、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4或5所述的重组芽孢杆菌在制备肝吸虫口服芽孢疫苗中的应用。
9.一种如权利要求6所述的肝吸虫口服芽孢疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将如SEQ ID NO.5所示的编码基因连接入表达载体，得到重组表达载体；
(2)将所述重组表达载体转化入芽孢杆菌，之后筛选得到重组芽孢杆菌；
(3)以所述重组芽孢杆菌为原料，制备得到所述肝吸虫口服芽孢疫苗。
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-
2023
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HENGCHANG SUN ET AL: "Bacillus subtilis spore with surface display of paramyosin from Clonorchis sinensis potentializes a promising oral vaccine candidate", PARASIT VECTORS, vol. 11, no. 1, pages 1 - 15 * |
| 边青等: "重组GCRV-VP6枯草杆菌芽孢口服免疫对草鱼肝肠功能影响", 热带医学杂志, vol. 20, no. 03, pages 323 - 327 * |
Also Published As
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