MXPA02001464A - Materiales y metodos para la produccion eficiente de pasteuria. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos novedosos y ventajosos para crecer bacterias; los metodos de la presente invencion son particularmente ventajosos para crecer bacterias parasitarias in vitro, sin la presencia de tejido hospedero; en una modalidad de la presente invencion, las esporas de Pasteuria, tal como aquellas que infectan al nematodo de los nudos de las raices Meloidoqyne arenaria u otros nematodos hospederos, se crece in vitro; el procedimiento de la presente invencion es altamente ventajoso debido a que Pasteuria puede crecerse en la ausencia de tejido de nematodo.

Description

MATERIALES Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN EFICIENTE DE PASTEURIA REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/148, 154 presentada el 10 de agosto de 1999.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a los métodos para la producción de Pasteuria, o bacteria semejante a Pasteuria. Estas bacterias son capaces de producir endosporas que tienen la propiedad única y útil de ser capaces de unirse a, infectar, crecer en, re-esporular en, y eliminar ciertos tipos de nemátodos fitopatogénicos y otros nemátodos que habitan en el suelo. La pérdida de cosechas debido los nemátodos fitopatogénicos impone una carga muy fuerte para la agricultura de los Estados Unidos. Para 1994, Koenning et al. (Nematology 31 :587-618, 1999) estima pérdidas debido a los nemátodos para que sea superior a un exceso de $1.5 miles de millones para el maíz, soya, trigo, algodón, cacahuate y vegetales combinados. Estos nemátodos fitopatogénicos vienen del phylum Nematoda, dentro de los órdenes Tyienchida y Dorylamida. Los gastos en los Estados Unidos para fumigantes y nematicidas en estas y otras cosechas totalizaron l2A ? **l* **..t?. , .. &£**-,*, n 'íátTlIT . il - i't?"°|-|?i?ii'?l£ aproximadamente $400 miles de millones en 1996 (Chemical Economice Handbook, SRI Internacional, 1997). Los nemátodos fitopatogénicos son particularmente difíciles de controlar debido a que estos están cubiertos con una cutícula gruesa, impermeable, o una cubierta externa, que tiene muy pocas neuronas sensibles. Puesto que muchos compuestos para control de plagas operan como neurotoxinas, el bajo número de neuronas expuestas por lo nemátodos fitopatogénicos disminuye el área blanco efectiva para compuestos nematicidas con propiedades neurotóxicas exquisitamente altas. Además, debido a que los nemátodos fitopatogénicos se encuentren en el suelo o en las raíces de las plantas, exponer los nemátodos fitopatogénicos a los agentes de control también es difícil de lograr y pone en juego un riesgo de contaminación a partir de estos compuestos tóxicos. Se ha demostrado el uso de nematicidas basados en neurotoxinas contaminan tanto el suelo como el agua superficial. Consecuentemente, muchos de estos compuestos han sido removidos del mercado por razones de salud pública. La fumigación del suelo para sembrado es un método popular para control de nemátodos. A uno de los fumigantes más populares, bromuro de metilo, se le destinó a remoción de su uso debido a sus propiedades destructoras de ozono. Sin embargo, esta practica de fumigación de suelo mata organismos en el suelo indiscriminadamente y se corre el riesgo de eliminar microbios benéficos así como organismos productores de enfermedades. El mercado general para un nematicida efectivo con efectos ambientales benignos se estima que se aproxima a un mil millones de dólares en una base a nivel mundial. Pasteuria fue el primer parásito descrito en 1888 por Mechnikoff (Annales de l'lnstitut Pasteur 2:165-170) como un parásito de las pulgas de agua. Subsecuentemente, Cobb describió una infección por Pasteuria del nemátodo. En los años siguientes, las infecciones por Dorylaimus bulfíferous (2nd ed. Hawaiian Sugar Planters Assoc., Expt. Sta. Div. Path. Physiol. Bull. 5:163-195,1906), en los años intercurrentes, se han observado infecciones por Pasteuria de virtualmente cada nemátodo conocido, y su uso potencial para control biológico de nemátodos fitopatogénicos se ha evidenciado (Chen y Dickson

[1998] J. Nematology 30:313-340. Aunque las bacterias del grupo Pasteuria se han reconocido como potenciales para uso como agentes de control bioracionales en contra de nemátodos fitopatogénicos, su amplitud de uso en la agricultura comercial dependerá de la capacidad de los métodos confiables para la producción a gran escala de bacterias que tengan especificidad en contra de nemátodos fitopatogénicos de interés para los agricultores. Se han realizado intentos previos de un cultivo in vitro de Pasteuria utilizando tejido de fase vegetativa recuperado a partir de hembras infectadas a las cuales se les desinfectó la superficie con materiales tales como "Clorox" y se cultivaron con antibióticos para evitar la contaminación. El medio rico tal como medio para insecto de Grace, medio para insecto de Schneider, medio para insecto de Leibovitz se utilizaron y suplementaron con numerosos materiales, véase (Bishop y Ellar). La mayoría del trabajo experimental con el grupo Pasteuria ha utilizado esporas producidas en nemátodos vivos, cultivadas en plantas completas en invernaderos en donde las condiciones asépticas prevalecen. En dos excepciones, Verdeho eí al. (Verdeho, S. y R. Mankau

[1986] Journal of Nematology 18:635) se ha reportado el cultivo oligoxénico de Pasteuria penetrans en Meloidogyne incógnita viva sobre cultivo de raíz de tomate cortada; y Reise et al. (Reise, R.W., K.J. Hackert, R.M. Sayre, y R.N. Huette] han estudiado factores en varios medios de cultivo de tejidos que afectan aislados de Pasteuria a partir de Heterodera glicinas. Meloidogyne incógnita, y brachyurus. Sus intentos se dirigen a un cultivo in vitro genuino de Pasturia, cuyos intentos han fallado con base en los criterios fundamentales de que un cultivo in vitro genuino de cualquier organismo procarionte debe marcarse mediante una supervivencia y proliferación continua de los organismos, después de la transferencia o un medio fresco, a velocidad de crecimiento definida que es característica del genotipo del organismo y las condiciones ambientales. La patente de E.U.A. No. 5,094,954 describe un método alternativo para la producción de endosporas a partir de Pasteuria mediante el crecimiento de la bacteria en tejido de nemátodo explantado. En el método de la patente de E.U.A. No. 5,094,954, el tejido de nemátodo puede prepararse, por ejemplo, al decapitar y decaudar nemátodos, o mediante rompimiento osmótico y/o enzimático de la cutícula del nemátodo. El tejido del nemátodo 'Ú*A?AdJt¡*4iáAi**Mt ¿¡irf i fr>- « <i*i*--'?Í *^JS£, se explanta sobre medio el cual se diseña para alimentar el tejido y lo ». mantiene en estado metabólicamente activo. Entonces el tejido se induce hacia crecimiento y proliferación celular. Por lo tanto este método no se atiene al cultivo de Pasteuria in vitro sino que se dirige hacia la producción de 5 esporas de Pasteuria sobre tejido de nemátodo cultivado o explantado. Por lo tanto, aunque Pasteuria se reportó inicialmente tan lejanamente como en 1888, todos los intentos para cultivar el microbio in vitro han fallado para producir un medio viable de producir endosporas. Por lo tanto, permanece en esta técnica una gran necesidad para un método de 10 producción de Pasteuria mediante la formación de esporas seguido por verdadero crecimiento in vitro de la fase vegetativa de Pasteuria sobre un medio de cultivo artificial que consiste de materiales no costoso, fácilmente disponibles. Dicho sistemas no se conocen hasta la fecha. 15 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos novedosos y ventajosos para crecer bacterias. Los métodos de la presente invención son particularmente ventajosos para crecer la bacteria parasitaria, in vitro, sin la 20 presencia del tejido hospedero. En una modalidad de la presente invención, las esporas de Pasteuria, tales como aquellas que afectan el nemátodo de los nudos de la raíz Meloidogyne arenaria u otros nemátodos hospederos, se crece in vitro. El procedimiento de la presente invención es altamente *?** A ? ¡a.*á>igfca ventajoso debido que Pasteuria puede crecerse en la ausencia de tejido de nemátodo. Las esporas de la bacteria obtenidas utilizando los métodos de la presente invención pueden entonces utilizarse en cualquier composición o procedimiento apropiado. Esto simplifica grandemente el procedimiento y reduce el material y los costos de trabajo. Específicamente ejemplificado en la presente está la producción de endosporas de Pasteuria y el uso de estas esporas en programas de control del nemátodo. En una modalidad específica para la presente invención, el crecimiento de Pasteuria se lleva a cabo sobre cajas de agar o en líquido. También, preferiblemente, no se añaden antibióticos o blanqueadores al medio de cultivo. Ventajosamente, el método de la presente invención resulta en crecimiento de masas bacterianas y un incremento en el número de unidades celulares del estado vegetativo de la bacteria. Subsecuentemente, ocurre la esporulación a partir de la fase vegetativa tardía de la bacteria con producción de esporas maduras, en estado latente. En el caso de Pasteuria, las esporas son infecciosas para nemátodos, incluyendo Meloidogyne arenaria y otras especies de nemátodo. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a la identificación de factor(es) auxiliar el cual, cuando está presente en el medio de crecimiento de Pasteuria, facilita el crecimiento in vitro de Pasteuria. En una modalidad, el factor auxiliar es un microorganismo. Un aislado específico de este factor auxiliar se ha depositado con American Type Culture Collection y se ha asignado el número de depósito ATCC . En una modalidad adicional, el factor auxiliar es un compuesto químico el cual, cuando está presente en el medio de crecimiento de Pasteuria, facilita el crecimiento in vitro de Pasteuria. Específicamente ejemplificado en la presente está el factor auxiliar designado HF-1 el cual puede obtenerse a partir del cultivo designado ATCC . Los aspectos adicionales de la presente invención incluyen composiciones que comprenden endosporas de Pasteuria y el uso de estas composiciones para controlar nemátodos fitopatogénicos. Otro aspecto de la presente invención concierne al uso de factores auxiliares descritos en la presente para promover el crecimiento de Pasteuria en o alrededor de plantas por lo tanto controlando a los nemátodos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA La SEQ ID NO. 1 muestra una secuencia de polinucleótido de un factor auxiliar de bacteria de conformidad con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para ia producción eficiente de esporas de bacteria. Específicamente ejemplificado en la presente t¿^¡?^gt^a^ ^.<Jiii^.»^.M«afc^..j. r está la producción in vitro de endosporas de Pasteuria. De conformidad con la presente invención, Pasteuria se crece y produce endosporas que tienen la propiedad única y útil de ser capaces de unirse a, infectar, crecer en, re- esporular en, reducir la fecundidad de, y/o eliminar ciertos tipos de nemátodos fitopatogénicos y otros nemátodos que habitan en el suelo. Además, Pasteuria puede reducir la capacidad de los nemátodos para infectar plantas. En un aspecto, la presente invención provee un método para producir endosporas de especies de bacterias parasitarias in vitro sin la presencia de tejido hospedero viviente. Esta bacteria parasitaria incluye, por ejemplo, varias especies de bacillus. En una modalidad particular, un procedimiento de producción de Pasteuria de la presente invención implica el uso de un factor auxiliar tal como, por ejemplo, una segunda bacteria o un factor químico producido por una segunda bacteria. Este método es altamente ventajoso debido a que requiere solamente medio de crecimiento simple el cual, preferiblemente, no se agita o mezcla y el cual no tiene antibióticos añadidos. No se necesita ningún tejido de nemátodo. En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para proteger plantas a partir de nemátodos patogénicos de plantas. Este método puede comprender modificar una planta de manera que ésta produzca un factor auxiliar. En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para prevenir o controlar nemátodos patogénicos de plantas mediante la aplicación a la planta, o a los alrededores de la planta, de un factor auxiliar el cual facilita el crecimiento y/o colonización de Pasteuria. En una modalidad preferida, la presente invención provee un método novedoso para crecer bacterias Pasteuria para la producción de esporas las cuales pueden entonces utilizarse como un agente de biocontrol para nemátodos. En particular, el procedimiento novedoso implica el crecimiento in vitro de Pasteuria. En una modalidad específica, el método de la presente invención implica crecer Pasteuria en un caldo nutriente (NB). En una modalidad preferida, la Pasteuria se crece en la ausencia de antibióticos y sin agitación. Opcionalmente, el NB puede suplementarse con suero de ternera bovina (BCS) y/o una preparación de yema de huevo. En una modalidad específica del procedimiento de la presente invención, los nemátodos hembra infectados se lavan con agua para remover desechos unidos, suelo, microorganismos, etc. Preferiblemente, el lavado toma lugar sin desinfectantes o antibióticos. Los nemátodos entonces se trituran con, por ejemplo, porta objetos y cubre objetos los cuales han sido esterilizados, una pequeña cantidad de agua destilada puede utilizarse para utilizar el procedimiento de trituramiento. Una vez que los nemátodos triturados se han preparado éstos se introducen dentro de un medio nutriente y se crecen. Este crecimiento puede llevarse a cabo a temperatura ambiente. Un caldo nutriente estándar, opcionalmente suplementado con suero de ternera bovina, puede utilizarse. El caldo nutriente también puede stiplementarse con una preparación de yema de huevo, aceite de cacahuate, u otra fuente de lípidos. La preparación se permite para crecimiento, preferiblemente sin agitación, a temperatura ambiente. Dentro de un período de varias horas hasta varios días, los organismos nadadores con forma de varilla aparecerán. La producción de esporas entonces puede inducirse como se describe en la presente. En una modalidad del procedimiento de la presente invención, después de la aparición de los organismos móviles en forma de varilla, la preparación puede transferirse a un medio de crecimiento sólido en, por ejemplo una caja de petri. Típicamente, dentro de aproximadamente 24 horas de crecimiento en el medio nutriente, las colonias aparecerán en los platos (cajas de petri). Las colonias que aparecen en las cajas de petri comprenden los organismos móviles en forma de varillas primeramente observados en el crecimiento inicial en el medio nutriente. Después de la aparición de las colonias en el medio nutriente, la inducción de formación de esporas puede hacerse mediante, por ejemplo, añadir sulfato de manganeso y/o lípidos. En una modalidad preferida de la presente invención, el procedimiento de crecimiento se lleva a cabo hasta la completación de la misma en el medio de crecimiento líquido. Este procedimiento es simple y altamente eficiente. Si se desea, los microorganismos auxiliares de la presente invención pueden separarse a partir del crecimiento de Pasteuria mediante una membrana la cual permite el paso del factor químico auxiliar pero la cual bloquea el paso de los microbios completos. En una modalidad específica, las membranas tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 µm que pueden utilizarse para separar las Pasteuria a partir de los microbios auxiliares aunque permite el paso del factor químico auxiliar. En una modalidad más específica el tamaño de poro es de 0.45 µm. Las esporas típicamente se formarán dentro de aproximadamente 24 horas de inducción de espora. Estas esporas se han determinado que son capaces de unirse a nemátodos juveniles J2. Aunque no se desea unirse a la teoría, parece que el sistema de crecimiento de la presente invención implica a múltiples organismos. Por lo tanto, por ejemplo, los organismos móviles en forma de varilla observados en el medio nutriente de crecimiento facilitan el crecimiento óptimo de Pasteuria. Por conveniencia, la referencia en la presente a "factor auxiliar" se refiere a los organismos móviles en forma de varilla, otros microbios o factores producidos por los microbios móviles en forma de varilla u otros microbios, los cuales facilitan o mejoran el crecimiento de Pasteuria. El factor(es) auxiliar se cree que existe internamente en los nemátodos, o su planta hospedera, y está disponibles para llevar a cabo sus funciones en el sistema de la presente invención cuando los nemátodos están, por ejemplo, triturados. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un sistema eficiente para la producción in vitro de Pasteuria. En una modalidad preferida, este sistema utiliza factor(es) auxiliar para lograr una producción óptima de Pasteuria.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a la manipulación del factor(es) auxiliar de la presente invención para afectar el control de los nemátodos parasitarios de plantas. Esté aspecto de la presente invención se refiere al involucramiento de los factores auxiliares en la infección de plantas por nemátodos. Al interferir con la capacidad del factor auxiliar para modular y/o facilitar la infección de plantas mediante nemátodos es posible prevenir o inhibir las infecciones de plantas por nemátodos. Esta interferencia con esta función del factor(es) auxiliar puede lograrse por, por ejemplo, al exponer los factores auxiliares a antibióticos u otros agentes (tales como ADN antisentido o ARNi) los cuales inhiben la capacidad del factor(es) auxiliar para promover la infección de nemátodo (Fire, A., S. Xu, M. K. Montgomery, S.A. Kostas, S. E. Drive, y C.C. Mello.

[1998] "Potente y specific genética interferencia by double-stranded ARN en Caenorhabditis elegans" Nature 391 :806-811). Preferiblemente, la sustancia inhibidora puede estar presente en las raíces de la planta. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso del factor(es) auxiliar para proveer la colonización eficiente y/o no efectividad por Pasteuria. Por lo tanto, los factores auxiliares de microbios vivos tales como los organismos móviles en forma de varilla ejemplificados en la presente pueden aplicarse en la ubicación de plantas para promover la colonización por Pasteuria nativa. Alternativamente, los factores auxiliares microbianos pueden mezclarse con Pasteuria y aplicarse en la ubicación de las plantas. En una modalidad adicional, un factor químico auxiliar, tal como HF-1 puede aplicarse con o sin aplicación contemporánea de Pasteuria. Los factores auxiliares pueden aplicarse al tiempo de la plantación, ya sea como un revestimiento en la semilla o como una composición separada. Las plantas también pueden transformarse para expresar un factor auxiliar químico. En una modalidad preferida el factor auxiliar puede expresarse en raíces de plantas. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a los organismos móviles en forma de varilla los cuales se asocian con la capacidad de Pasteuria para crecer in vitro. Un cultivo de los microbios se ha depositado con American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 E.U.A. El deposito tiene el número de acceso asignado ATCC No. para el depósito. El presente depósito se depositó bajo condiciones que aseguran el acceso al depósito con la disponibilidad durante la calidad de pendiente de esta solicitud de patente a una determinada por el comisionado de patente y marcas registradas a ser titulada a continuación bajo 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. El depósito estará disponible como se requiere por las leyes de Patentes Externas en los países en donde las contrapartes de la presente aplicación, o su progenie, se presenten. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad del depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. Además, el presente depósito se almacenará y estará disponible para el publico de conformidad con las condiciones del tratado de Budapest ítMtáSk- para el depósito de Microorganismos es decir, se almacenará con todos los cuidados necesarios para mantenerlos viables y no contaminados por un período de al menos cinco años después del pedido más reciente del almacenamiento de una muestra del depósito, y en cualquier caso, durante un período de al menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o de la vida útil de cualquier patente la cual puede expedirse a partir del cultivo. El depositante conoce las obligaciones de reemplazar el depósito y el depositante debe ser incapaz de suministrar una muestra cuando se le pida, debido a las condiciones del depósito. Todas las restricciones de la disponibilidad del presente depósito de cultivo al público serán irrevocablemente removidas después de la concesión de los derechos de la patente descrita en la presente. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al factor auxiliar de la presente invención designado HF-1, HF-1 se produce mediante un organismo móvil en forma de varilla aislado descrito en la presente y que tiene un tamaño menor de aproximadamente 0.50 µm. Este factor es particularmente ventajoso debido a que está asociado con la capacidad de Pasteuria para crecer in vitro. A continuación se dan los ejemplos que ilustran los procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes. Todos los porcentajes se dan en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son por volumen a menos que se mencione de otra manera.

EJEMPLO 1 Preparación de nemátodos v crecimiento de Pasteuria Las hembras (Meliodogvne arenaria) de los nudos en las raíces infectadas se lavaron en la superficie con agua estéril. Aproximadamente 100 ml de agua se pasó sobre los nemátodos en un tamiz de malla fina. Estos nemátodos entonces se trituraron entre cubreobjetos estériles con una gota de agua. La suspención de material se inoculó dentro de 24 pozos, en cajas estériles que contenían medio de cultivo estéril para célula de insecto (glucosa al 0.5% y Leibovitz) con suero de ternera bovina al 5% (BSC) añadido. El crecimiento se observó dentro de 24 horas a temperatura ambiente. El crecimiento consistió de organismos móviles en forma de varilla, los cuales no se esperaban. Este material se observó por varios días y aparecieron pocos cuerpos refractibles que parecían endosporas de Pasteuria. Cuando se tiñeron con tinción del cultivo contenía tanto material negativo y positivo. Los cuerpos semejantes endosporas fueron Gram positivos. El material a partir de las cajas de agar se inoculó dentro de caldo nutriente (NB) con BDS. Dentro de 24 horas fue evidente el crecimiento abundante incluyendo estructuras que aparecieron idénticas a las estructuras encontradas en nemátodos infectados. En varios días los cuerpos refractibles llenaron estas estructuras.

EJEMPLO 2 Elección de medio NB y glucosa al 0.5% fueron los medios preferidos. Las esporas producidas en NB se unieron más fácilmente a J2 que aquellas producidas en glucosa al 0.5%. Una preparación de yema de huevo estéril se añadió a J2 y, dentro de 24 horas, se produjeron profusas endosporas. Este medio contenía BCS al 5% y una mezcla de yema de huevo al 5%. Las esporas se unieron muy fácilmente a los J2. Subsecuentemente, una solución saturada de sales de Wesson se añadió a NB y el BCS se eliminó. De nuevo se obtuvieron esporas abundantes dentro de 24 horas. El medio NB que contenía la yema de huevo y las sales se diluyó 1:1 , 1 :5 y 1 :10. En todos los casos el crecimiento y las esporas se obtuvieron. La glucosa al 1 % se utilizó con la yema de huevo y las sales y se obtuvo un buen crecimiento y formación de esporas dentro de 24 horas. Subsecuentemente se determinó que la mezcla de yema de huevo pudo reducirse y que la yema de huevo seca pudo ser utilizada. El medio más reciente es ya sea NB (8 g/l) o glucosa (10 g/l) más 2.5% de sales saturadas de Wesson al 5%. La riqueza de este medio puede reducirse si se desea.

EJEMPLO 3 Aislamiento del cultivo primario Los nemátodos infectados con Pasteuria se cosecharon a partir de raíces de tomate de 12 a 15 días después de la inoculación de las plantas. Los nemátodos se esterilizaron en la superficie con solución de Chlorox al 10% por 5 minutos. A partir de este punto las técnicas asépticas se manejaron estrictamente. Los nemátodos infectados se enjuagaron dos veces en solución salina al 0.6%. Después del enjuague final los nemátodos individuales se colocaron en pozos que contenían 1 ml de caldo nutriente en una caja de 24 pozos. Utilizando palillos de dientes estériles, los nemátodos se trituraron para liberar las estructuras vegetativas de Pasteuria. Todos los cultivos se incubaron a 30°C. La presencia de estas estructuras se confirmó utilizando un microscopio invertido (400X). Los cultivos se monitorearon en una base diaria para la presencia de bolas de micelio, MB, (etapa vegetativa del crecimiento de Pasteuria). Los factores auxiliares (que contienen insertos de cultivo de tejido con membrana de 0.45 mieras) se introdujeron a algunos de los cultivos 24 horas después de la incubación inicial. El número y calidad de MB determinó el progreso en cada paso. En los pozos que no recibieron inserto, el número de MB y el grado de refractibilidad disminuyó conforme el cultivo se hacia más viejo. Casi no MB estuvo presente después de una semana. En los pozos que recibieron el factor auxiliar (insertos) por un total de tres días, el número de MB se incrementó y el grado de refractibilidad permaneció igual por aproximadamente 13 días. En este punto la morfología MB cambió y sus bordes se volvieron rugosos. Estos desaparecieron de los pozos después de 15 días. Al día 16 se detectaron las esporas maduras.

EJEMPLO 4 Unión de esporas de Pasteuria a nemátodos Las esporas cosechadas a partir del medio descrito en el ejemplo 2 se utilizaron para los ensayos de unión a nemátodos J2 de nudo de raíz utilizando el método descrito por Dickson. Aproximadamente 1 ml de una suspensión que contenía nemátodos J2 se colocó en un tubo de centrífuga de 1.5 ml y se añadió una gota de la suspensión que contenía los cuerpos refractorios. Los tubos se centrifugaron a 9000 por 3 minutos y el material se colocó en un pozo y se observó con un microscopio invertido. Hubo clara indicación de que los cuerpos refractorios se unieron a J2. En otro experimento, J2 fueron esterilizados brevemente en su superficie y luego se colocaron en agua destilada. Las esporas se añadieron entonces a los J2 en los pozos y se unieron sin centrifugación. Varios pozos que contenían J2 con esporas unidas se observaron para determinar si las uniones eran estables. Los pozos se examinaron cada día por 10 días y todas las uniones fueron estables. Durante estas observaciones fue evidente que los nemátodos podían tomar grumos del material de matriz y que los organismos móviles en forma de varilla aún estaban activos, incluso cuando el único medio disponible era aquel que estaba contenido en una gota del inoculo de esporas añadidos a la suspensión de 1.5 ml de J2. Después de aproximadamente 14 días, algunos de los J2 empezaron a mudar y después de pocos días más todos los J2 empezaron a mudar. Hubo varias diferencias con los cuerpos refractorios producidos in vitro y las endosporas producidas in vivo. El material in vivo tiende a tener concentraciones más densas de endosporas e incluyó material vegetativo abundante mezclado con las esporas de manera que los grumos de endosporas aparecieron unidos a los J2 más que como esporas sencillas. Sin embargo, en una examinación más cercana parece que una o dos esporas se unen y el resto se mantiene aún en matriz vegetativa y no se une directamente a los J2. Otra diferencia fue que, bajo algunas circunstancias, las endosporas in vitro parecen ligeramente más pequeñas.

EJEMPLO 5 Ensayos de campo Varios miles de nemátodos M. Arenaria J2 con cuerpos refractores unidos se añadieron a tomates libres de nemátodos que crecían en suelos pasteu rizados. Después de 25 a 30 días las raíces se cosecharon y se examinaron. Se recuperaron nemátodos hembras de nudo de raíz infectado con Pasteuria y llenos de esporas.

El experimento del tomate se repitió y en todos los casos los nemátodos hembras de los nudos de las raíces se recuperaron las cuales estuvieron llenas con endosporas de Pasteuria penetrans.

EJEMPLO 6 Identificación del factorfes) auxiliar El caldo nutriente se inoculó con material a partir de agar nutriente, el cual se había sometido a varios pasajes. En todos los casos los cuerpos refractores se observaron dentro de unos pocos días. Los datos de secuencia de nucleótidos se obtuvieron a partir de endosporas in vitro. Cuando se compararon con secuencias de ADN del depósito en GenBank, fue claro que los cuerpos en forma de varilla móviles no eran de Pasteuria y que entonces tuvieron que estar presentes dos organismos. Una secuencia polinucleotídica obtenida a partir de un factor auxiliar a partir de un microorganismo móvil en forma de varilla de la presente invención se muestra en SEQ ID NO. 1. El ADN a partir de los organismos móviles en forma de varilla tiene 98% de homología con Enterobacter cloacae y Pantoea ssp., así como con otros. Los factores auxiliares de la presente invención incluyen microbios que tienen secuencias altamente similares a SEQ ID NO. 1. Esta alta similitud de secuencia puede típicamente ser mayor que 50% en una extensión de al menos aproximadamente 20 bases, preferiblemente mayor que 80% y más preferiblemente mayor que 90%. Dicho factor auxiliar de microbios puede identificarse fácilmente mediante, por ejemplo, el uso de SEQ ID NO. 1 , o fragmentos de la misma, como sondas de ADN.

EJEMPLO 7 Sondas polinucleotídicas e iniciadores El ADN posee una propiedad fundamental denominada complementariedad de bases. En la naturaleza, el ADN existe ordinariamente en la forma de pares de hebras anti-paralelas, las bases en cada una de las hebras se proyectan a partir de la hebra hacia la hebra opuesta. La base adenina (A) en una hebra siempre estará opuesta a la base timina (T) en la otra hebra, y la base guanina (G) siempre estará opuesta a la base citosina (C). las bases se mantienen en contra posición por su capacidad para formar enlaces de hidrógeno en esta manera específica. Aunque cada enlace individual es relativamente débil, el efecto neto de muchas bases unidas mediante fuentes de hidrógeno adyacentes, junto con los efectos de apilamiento de las bases, es una forma estable de las dos hebras complementarias. Estos enlaces se pueden romper mediante tratamientos tales como alto pH o alta temperatura, y estas condiciones resultan en la disociación, o "desnaturalización", de las dos hebras. Si el ADN se coloca entonces en condiciones termodinámicamente favorables para formar puentes de hidrógeno entre las bases, las hebras de ADN se fijarán, o "hibridarán", y reformarán la doble hebra de ADN original. Si se lleva a cabo bajo condiciones apropiadas, esta hibridación puede ser altamente específica. Es decir, solamente las hebras con un alto grado de complementariedad de base serán capaces de formar estructuras estándares de doble hebra. Las relaciones de la especificidad de la hibridación a las condiciones de reacción se conocen bien. Por lo tanto, la hibridación puede utilizarse para evaluar si dos piezas de ADN son complementarias en sus secuencias de bases. Es este mecanismo de hibridación el cual facilita el uso de sondas de la presente invención para detectar fácilmente y caracterizar secuencias de ADN de interés. Los polinucleótidos específicamente ejemplificados de la presente invención puede estos mismos ser utilizados como sondas. Las secuencias polinucleotídicas adicionales pueden añadirse a los extremos de (o internamente en) las secuencias polinucleotídicas ejemplificadas de manera que los polinucleótidos que son más largos que los polinucleótidos ejemplificadas también puedan utilizarse como sondas. Por lo tanto, los polinucleótidos aislados que comprende una o más de las secuencias ejemplificadas están dentro del alcance de la presente invención. Los polinucleótidos que tienen menos nucleótidos que los polinucleótidos ejemplificados también pueden utilizarse y se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para algunos propósitos, puede ser útil el utilizar una secuencia conservada a partir de un polinucleótido ejemplificado .AA A JKkiAAA ISu* * MMJri?jM»*.i*afc.- --i -* i **»***.*-** -**'**-*' ---l iéA&É^t Mm SkJ itl.} en donde la secuencia conservada comprende una porción de una secuencia ejemplificada. Por lo tanto, los polinucléotidos de la presente invención pueden utilizarse para encontrar genes y microbios adicionales, homólogos (completamente o parcialmente). Las sondas de la presente invención pueden estar compuestas de ADN, ARN, o PNA (péptido ácido nucleico). Las sonda normalmente tendrá al menos aproximadamente 10 bases, más usualmente al menos aproximadamente 17 bases, y pueden tener aproximadamente 100 bases o más. Las sondas más grandes pueden fácilmente utilizarse, y dichas ondas pueden ser, por ejemplo, de varias kilobases en longitud. La sonda no necesita tener complementariedad perfecta a la secuencia a la cual se hibrida. Las sondas pueden marcarse utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Un método para el uso de la presente invención como sondas capacita a los primeros segmentos de ADN identificables que son homólogos con las secuencias nucleotídicas descritas utilizando, por ejemplo, análisis Southern o un banco de genes. Un procedimiento de hibridación útil de conformidad con la presente invención típicamente incluye los pasos iniciales de aislar la presente de ADN de interés y purificarlo químicamente. Ya sea usando nemátodos (u otros hospederos parásitos, u otras muestras) o puede utilizarse el ácido nucleico total fraccionado aislado a partir de nemátodos. Las células pueden tratarse utilizando las técnicas conocidas para liberar su ADN (y/o ARN). La muestra de ADN puede cortarse en piezas con una enzima de restricción apropiada. Las piezas pueden separarse por tamaño a través de electroforesis en un gel, usualmente agarosa o acrilamida. Las piezas de interés pueden transferirse a una membrana inmóvil. La técnica de hibridación particular no es esencial para la presente invención. Conforme las mejorías se hacen en las técnicas de hibridación, estas pueden aplicarse fácilmente. Las sonda y la muestra pueden entonces combinarse en una solución amortiguadora de hibridación y mantenerse a una temperatura apropiada hasta que ocurra la fijación. Por lo tanto, la membrana se lava para dejarla libre de materiales extraños dejando las moléculas de la muestra y de la sonda unidas que típicamente se detectan y cuantifican por autoradiografía y/o conteo por centelleo líquido. Como se conoce bien en la técnica, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico híbrida al formar una unión no covalente fuerte entre las dos moléculas entonces se asume razonablemente que la sonda y la muestra son esencialmente idénticas o muy similares. La marca detectable de la sonda provee un medio para determinar de manera conocida si la hibridación a ocurrido. En el uso de los segmentos de nucleótidos como sondas, la sonda particular se marca con cualquier marca adecuada conocida por los expertos en la técnica, incluyendo marcas radioactivas y no radioactivas. Las marcas radioactivas típicas incluyen 32P, 35S, o similares. Las marcas no- radioactivas incluyen, por ejemplo, ligandos tales como biotina o tiroxina, así como enzimas tales como hidrolasas o peroxidasas, o varios quimoluminiscenos tales como luciferina, o compuestos fluorescentes como fluoresceína y sus derivados. Además, las sondas pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la solicitud Internacional No. WO 93/16094. Varios grados de severidad de hibridación pueden emplearse. Conforme más severas sean las condiciones, mayor complementariedad se requiere para la formación del dúplex. La severidad puede controlarse mediante temperatura, concentración de la sonda, longitud de la sonda, fuerza iónica, tiempo, y similares. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones de severidad moderada a alta mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G.H., M.M. Manak (1987) ADN Probes, Stockton Prees, New York, NY., pp. 169-170. Como se utiliza en la presente condiciones "de severidad moderada a alta" para hibridación se refiere a las condiciones que se logran con el mismo, o aproximadamente el mismo grado de especificidad de la hibridación como con las condiciones "como se describieron anteriormente". Los ejemplos de condiciones de severidad moderadas a altas se proveen en la presente. Específicamente, se llevó a cabo la hibridación de ADN inmovilizado sobre Southern blots con sondas especificas del gen marcado con 32P utilizando métodos estándares (Maniatis et al). En general, la hibridación y los lavados subsecuentes se llevaron a cabo bajo condiciones de severidad moderada a alta que permitieron la detección de secuencias blanco í*títláá ¿it-?.*.*L**,.*i?.ii.?;.? i¿kl* con homología a las secuencias ejemplificares en la presente. Para las sondas de genes de ADN de doble hebra, la hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido en SSPE 6X, solución Denhardt 5X, SDS al 0.1%, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula a partir de Beltz et al. (1983): Tf=81.5°C+16.6Log[Na+]+0.41(% de G+C)-0.61 (% de formamida)-600/longitud de dúplex en pares de bases. Los lavados típicamente se llevan a cabo como sigue: (1 ) dos veces a temperatura ambiente por 15 minutos en SSPE 1X, SDS al 0.1% (lavado de baja severidad). (2) Una vez a Tf-20° por 15 minutos en SSPE 0.2X, SDS al 0.1% (lavado a severidad moderada). Para las sondas oligonucleótidas, la hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido en SSPE 6X, solución Denhardt 5X, SDS al 0.1%, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tf para las sondas oligonucleótidas se determinó mediante la siguiente fórmula a partir de Suggs et al. (1981): Tf (°C)=2(número de pares de bases T/A) +4 (numero de pares de base G/C) Los lavados se llevaron a cabo típicamente como sigue: (1) dos veces a temperatura ambiente por 15 minutos SSPE 1X, SDS al 0.1% (lavado a severidad baja). (2) una vez a la temperatura de hibridación por 15 minutos en SSPE 1X, SDS al 0.1 % (lavado a severidad moderada). En general, la sal y/o temperatura puede alterarse para cambiar la severidad. Con un fragmento de ADN marcado mayor que aproximadamente 70 o aproximadamente de bases en longitud, las siguientes condiciones pueden utilizarse: Baja: 1 a SSPE 2X, a temperatura ambiente Baja: 1 a SSPE 2X, 42°C Moderada: SSPE 0.2X o 1 X, 65°C Alta: SSPE 0.1X, 65°C La formación y estabilidad del dúplex depende de la complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido, y, como se evidenció anteriormente, un cierto grado de no coincidencia puede tolerarse. Por lo tanto, como las secuencias polinucleotídicas de la presente invención incluyen mutaciones (tanto particulares como múltiples), deleciones, e inserciones en la secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en donde dichas mutaciones, inserciones, y deleciones permiten la formación de híbridos estables con un polinucleótido blanco de interés. Las mutaciones, inserciones, y deleciones pueden producirse en una secuencia polinucleotídica dada utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Otros métodos pueden volverse conocidos en el futuro. Las variantes mutacionales, insercionales, y delecionales de las secuencias polinucleotídicas de la invención pueden utilizarse de la misma manera como las secuencias polinucleotídicas ejemplificadas siempre y cuando las variantes tengan similitud de secuencia sustancial con la secuencia original. Como se utiliza en la presente, similitud de secuencia sustancial se refiere al grado de similitud de nucleótidos que es suficiente para capacitar el polinucleótido variable para que funcione a la misma capacidad que la secuencia original. Preferiblemente, esta similitud es mayor que 50%; más preferiblemente, esta similitud es mayor que 75%; y más preferiblemente, esta similitud es mayor que 90%. El grado de similitud necesario para que la variante funcione a su capacidad pretendida dependerá del uso pretendido de la secuencia. Se sabe bien por las personas expertas en esta técnica el hacer mutaciones mutacionales, mutaciones insercionales, y mutaciones delecionales que se diseñan para mejorar la función de la secuencia o de otra manera proveen otra ventaja metodológica. En una modalidad adicional, las secuencias polinucleotídicas de la presente invención (y porciones de las mismas tales como regiones conservadas y porciones que sirven para distinguir estas secuencias a partir de secuencias previamente conocidas) pueden utilizarse como, y/o utilizarse en el diseño de, iniciadores para amplificación por PCR. Para llevar a cabo la amplificación PCR, un cierto grado de no coincidencia puede tolerarse entre el iniciador y el molde. Por lo tanto, las mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5') de los polinucleótidos ejemplificados pueden utilizarse de esta manera. Las mutaciones, inserciones *m. **.*.,. tíLen.** i. ,--.^^?^*ííS^i^?-s*í^&*M!iÉ »* í**^ m ''ti^f^¡? ?- - -?J*O*Í&M?. ¡i y deleciones pueden producirse en un iniciador dado por métodos conocidos por un experto en la técnica. Otras secuencias de ADN a partir del organismo móvil en forma de varilla aislado ejemplificado en la presente pueden utilizarse con base en las sondas de ADN y/o iniciadores para identificar otros microbios con factores auxiliares y genes. Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirá por personas expertas en la técnica y que se incluirán dentro del espíritu y al alcance de esta aplicación y el alcance de las reivindicaciones anexas. ^¿,..i » u *.**.* *íU*Mká* LISTADO DE SECUENCIA <110> Gerber, John White, James <120> Materiales y Métodos para la Producción Eficiente de Pasteuria <130> GER-100XC1 <160> <170> Patente en versión 3.0 <210> 1 <211> 1455 <212> ADN <213> Desconocido <220> <221> carácter!sticas_misceláneas <222> (109) .. () <223> Cualquier nucleótido <220> <221> características_misceláneas <222> (112) .. () <223> Cualquier nucleótido <400> 1 ggcaggccta acacatgcaa tcgagcggca gcggaaagta gcttgctact ttgccggcga 60 gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctacctgang gntggggatc actactggaa 120 acagttgcta ataccgcata acgtctcaag accaaagagg gggaccttcg ggcctcttgc 180 catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt aacggctcac ctaggcgacg 240 atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc 300 ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc 360 gcgtgtatga agaaggcctt cgggttgtaa agtactttca gcggggagga aggcgttgag 420 gttaataacc tcagcgattg acgttacccg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag 480 cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg 540 caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcattcgaa 600 actggcaggc tagagtcttg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt 660 agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg 720 tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780 tcgacttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt aagtcgaccg 840 cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900 gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag 960 agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg agacaggtgc tgcatggctg 1020 tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct 1080 ttgttgccag cggttaggcc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag 1140 gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg 1200 gcgcatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt gcgtcgtagt 1260 ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag 1320 aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtaaggg cgaattctgc 1380 agatatccat cacactggcg gccgctcgag cagcatctag agggcccaat tcgccctata 1440 gtgagtcgta ttaca 1455 1 GER-100XC1 Se .: \DOCS\APP\MISC\A-G\GER- lOOXCl . SEQ . WPD/DNB/srp

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir endosporas de Pasteuria in vivo, dicho método comprendiendo introducir Pasteuria, dentro del medio de cultivo, crecer la Pasteuria en dicho medio de cultivo, y obtener dichas endosporas.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho medio de crecimiento comprende un factor auxiliar que facilita el crecimiento in vitro de dicha Pasteuria

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho factor auxiliar es un microorganismo o un compuesto químico conocido por un microorganismo.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste de Enterobacter cloacae y Pantoea spp.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho microorganismo tiene todas las características identificables de ATCC .

6.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicho factor auxiliar es un compuesto químico producido por dicho microorganismo.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho factor químico pasa a través de una membrana que tiene poros de aproximadamente 0.5 µm.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho factor químico es HF-1.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho medio de crecimiento no comprende un antibiótico.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho paso de crecimiento se lleva a cabo sin agitación

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de sulfato de manganeso y lípidos se añade para producir la producción de endosporas.

12.- Un método para producir una planta a partir de la infección mediante nemátodos en donde dicho método comprende aplicar a la planta, o a los alrededores de la planta, un factor auxiliar el cual promueve la colonización y proliferación de un agente de biocontrol de nemátodo bacteriano.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha sustancia es un factor auxiliar el cual promueve el crecimiento de Pasteuria.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho factor auxiliar es un microorganismo, o es un compuesto químico producido por un microorganismo.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, 5 caracterizado además porque dicho microorganismo es un microorganismo móvil en forma de varilla.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste de Enterobacter Pantoea spp. 10

17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho microorganismo tiene todas las características identificables de ATCC .

18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho factor auxiliar es un compuesto químico 15 producido por un microorganismo.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, * caracterizado además porque dicho factor químico pasa a través de una i • membrana que tiene poros de aproximadamente 0.5 µm.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, 20 caracterizado además porque dicho factor químico es HF-1.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho factor auxiliar se aplica al suelo.

- 22.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho factor auxiliar se aplica como un revestimiento de semilla.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 12, 5 caracterizado además porque dicha planta produce dicho factor auxiliar.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha planta se transforma para que exprese dicho factor auxiliar.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, 10 caracterizado además porque dicho factor auxiliar se expresa en las raíces de dicha planta.

26.- Un compuesto designado HF-1 el cual facilita el crecimiento in vitro de Pasteuria, el cual puede obtenerse a partir de ATCC , y el cual es menor de 50 µm en tamaño. 15

27.- Un cultivo biológicamente puro de aislado designado ATCC .

28.- Una composición de endospora producida por el k • procedimiento de conformidad con la reivindicación 1.

29.- Un método para producir endosporas bacterianas in vitro en 20 donde dicho método comprende crecer dicha bacteria en un medio de crecimiento el cual comprende un factor auxiliar el cual promueve el crecimiento de dicha bacteria en donde dicho factor auxiliar es un microorganismo o un compuesto químico producido por un microorganismo.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha bacteria y parásitos se crecen in vitro en la ausencia de tejido hospedero vivo. -f 1 JliHf ii¡ l¡||