CN115851672A - 一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 - Google Patents
一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115851672A CN115851672A CN202211515014.8A CN202211515014A CN115851672A CN 115851672 A CN115851672 A CN 115851672A CN 202211515014 A CN202211515014 A CN 202211515014A CN 115851672 A CN115851672 A CN 115851672A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xylanase
- mutant
- xylanase mutant
- seq
- bile acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 title claims abstract description 26
- -1 bile acid compound Chemical class 0.000 title abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 abstract description 4
- 241000233894 Neocallimastix patriciarum Species 0.000 abstract description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102220226094 rs17217723 Human genes 0.000 description 5
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 5
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 102220162519 rs144164853 Human genes 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- DKPMWHFRUGMUKF-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,6alpha,7alpha)-3,6,7-Trihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1C(O)C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 DKPMWHFRUGMUKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOYGXTIHTHBSOA-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)-3-thiophen-2-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(=O)C=CC1=CC=CS1 JOYGXTIHTHBSOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DGABKXLVXPYZII-UHFFFAOYSA-N Hyodeoxycholic acid Natural products C1C(O)C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 DGABKXLVXPYZII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 2
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- DGABKXLVXPYZII-SIBKNCMHSA-N hyodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1[C@@H](O)C2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 DGABKXLVXPYZII-SIBKNCMHSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 102220342429 rs750043368 Human genes 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101100241858 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) OAC1 gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010027199 Xylosidases Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010084650 alpha-N-arabinofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 description 1
- PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate dihydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004913 chyme Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- QSOMFNQEXNFPNU-UHFFFAOYSA-L magnesium;hydrogen sulfate;hydroxide;hydrate Chemical compound O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O QSOMFNQEXNFPNU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 101150092906 pmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用。本发明是将来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn进行突变，筛选获得木聚糖酶突变体xynM4、xynM5和xynM6。和原始基因相比，所述木聚糖酶突变体经过85℃处理3分钟后的热稳定性由52％分别提高至65％、73％、85％，最适反应温度由60℃提升至70℃，说明突变体的热稳定性和耐热性得到提升。本发明将所述木聚糖酶突变体和胆汁酸复配制得胆汁酸复配酶制剂，能够明显提高白羽肉鸡的出栏重和欧洲指数，并降低料重比，进而提高家禽养殖中的饲料转化率和生产性能。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用。
背景技术
木聚糖是一种五碳糖，是半纤维素的重要组分，也是自然界中含量仅次于纤维素的多聚糖。木聚糖广泛存在于饲料原料中，如玉米、麦麸、米糠、秸秆、豆粕等，属于饲料中的非淀粉多糖，其在动物消化系统中不能被有效的降解。木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。在养殖行业中，通过在饲料中添加木聚糖酶降解抗营养因子木聚糖对提高饲料利用率非常经济有效。
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称，主要包括内切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中内切β-1,4木聚糖酶在这一类酶中发挥主要作用。目前市场上大多数木聚糖酶适宜温度在40～60℃，pH在5.0-7.0。来源于瘤胃真菌的内切木聚糖酶由于其良好的酶解特性，使其在饲料、造纸等行业具有很大的应用潜力。为了使瘤胃真菌内切木聚糖酶广泛应用到众多工业领域中，提高其酶活力、耐热性、耐酸性等性能，降低生产成本是急需解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用。本发明通过大量筛选得到耐热性提高的木聚糖酶突变体xynM4、xynM5和xynM6，并与胆汁酸复配成新的酶制剂，用来提高饲料利用率和肉鸡的生长性能。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体为木聚糖酶突变体xynM，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示、或者如SEQ ID No.5所示、或者如SEQ ID No.7所示。
进一步的，所述木聚糖酶突变体xynM具体为：由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM4；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸和第62位的丝氨酸变为脯氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM5；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸、第62位的丝氨酸变为脯氨酸和第76为甘氨酸变为谷氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM6。
本发明还提供了一种编码基因，所述编码基因为所述的木聚糖酶突变体xynM的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示、或者如SEQ ID No.6所示、或者如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，其包含所述的编码基因。
本发明还提供了一种重组工程菌，其特征在于，其包含所述的编码基因。
本发明还提供了一种胆汁酸复配酶制剂，所述胆汁酸复配酶制剂中包含所述的木聚糖酶突变体xynM和胆汁酸。
进一步的，所述胆汁酸复配酶制剂是由含木聚糖酶突变体xynM的重组工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸以1:8～12的质量体积比混合而成的。
进一步的，所述胆汁酸复配酶制剂中木聚糖酶突变体xynM的酶活不低于10万U/g。
本发明还提供了所述的木聚糖酶突变体或者所述的胆汁酸复配酶制剂在制备提高动物生长性能的饲料添加剂中的应用。
进一步的，所述木聚糖酶突变体或者胆汁酸复配酶制剂的用量为饲料重量的0.005％～0.02％。
进一步的，所述饲料添加剂中含有木聚糖酶突变体xynM4、xynM5和xynM6中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
1、本发明以瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因为基础进行突变改良，筛选获得了单点突变Y43F的木聚糖酶突变体xynM4，双点突变Y43F/S62P的木聚糖酶突变体xynM5，以及三点突变Y43F/S62P/G76E的木聚糖酶突变体xynM6。和原始基因相比，木聚糖酶突变体经过85℃处理3分钟后的热稳定性由52％分别提高至65％、73％、85％，最适反应温度由60℃提升至70℃，说明木聚糖酶突变体具有更好的热稳定性和耐热性。
2、本发明还利用含木聚糖酶突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸进行复配，得到的胆汁酸复配酶制剂能够明显提高白羽肉鸡的出栏重和欧洲指数，并降低料重比，进而提高白羽肉鸡养殖中的饲料转化率和生产性能。
附图说明
图1是所述木聚糖酶基因的扩增电泳结果图。
图2是所述木聚糖酶突变体热稳定性比较。
图3是所述木聚糖酶突变体最适反应温度比较。
图4是所述木聚糖酶突变体在15L发酵罐中的发酵曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
本发明所用培养基配方如下：
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；
MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；
BSM培养基：26.7mL 85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mL PMT1。
以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。
酶活力测定：参照《GBT 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》中的测定方法。
实施例1：木聚糖酶突变体基因构建和筛选
参考瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn(GenBank:AKN90969.1)的氨基酸序列，翻译成对应的核苷酸序列，并经过基因序列优化后，由人工合成，得到的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据序列设计引物如下，在5’端设计EcoR I限制性酶切位点，3’端设计Not I限制性酶切位点。
xyn-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCAGC(SEQ ID NO：9)；
xyn-R：ATAAGCGGCCGCCTAATCACCAATGTAAACCT(SEQ ID NO：10)。
用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以人工合成的基因为模版，以及上述设计的引物序列进行随机突变，PCR扩增结果如图1所示。将扩增好的随机突变PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-xynMx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+)载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-xyn0。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入2个表达原始木聚糖酶的单菌落xyn0为对照。每孔装入300uL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达木聚糖酶。将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，然后检测木聚糖酶的活性以及其耐热性。将耐热性高于对照的突变体基因进行测序。
经过测序后获得木聚糖酶突变体xynM4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
实施例2：以木聚糖酶突变体xynM4基因为模板进行随机突变
以实施例1中筛选到的突变体xynM4为模版，使用与实施例1相同的随机突变方法，进行第二轮突变和筛选，筛选时以xynM4为对照，检测木聚糖酶的活性，将耐热性高于xynM4的突变体基因进行测序。
经过大量筛选测定后获得耐热性较好的两株突变体xynM5和xynM6：
xynM5突变方式为Y43F/S62P，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
xynM6突变方式为Y43F/S62P/G76E，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其对应核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
实施例3：木聚糖酶突变体转化毕赤酵母GS115
将上述的木聚糖酶突变体基因用EcoR I和Not I双酶切位点连接到pPIC9K质粒上并转化至大肠杆菌DH5α中，获得表达载体，测序验证。将表达载体用Sal I酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115中，MD平板筛选得到转化子并转接到YPD平板中活化(一般挑24-48个转化子)。活化后的转化子接于摇瓶进行发酵(每瓶含20mL BMGY培养基)，30℃振荡培养18h后，加1％甲醇诱导，继续振荡培养，此后每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定发酵液上清的平均酶活性，以及经过85℃处理3分钟后的热稳定性。
按照国标中木聚糖酶测定的方法，取发酵液离心后的上清液测定耐热性及最适反应温度。结果如图2和图3所示，木聚糖酶突变体在85℃处理后的耐热性由52％提高至65％、73％、85％，最适反应温度由60℃提升至70℃。
实施例4：木聚糖酶突变体xynM6在15L发酵罐中发酵和制备
将表达木聚糖酶突变体xynM6的基因工程菌分别划线于YPD平板上，30℃培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到300mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为5，用作种子液接种发酵罐。发酵生产工艺：BSM培养基，pH4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。
发酵曲线如图4所示：每隔8h取样，测定产酶水平，发酵162h后酶活力水平达到最高点。
实施例5：酶制剂的制备及在白羽肉鸡养殖中的应用实验
将实施例4制备的木聚糖酶突变体粉制剂以1:10的质量体积比与胆汁酸均匀混合，制备得到胆汁酸复配酶制剂。
其中，酶制剂中木聚糖酶突变体的酶活力不低于10万U/g。胆汁酸的有效成分组成包括猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，所述猪胆酸和猪去氧胆酸之和的重量百分比为78.0％，鹅去氧胆酸的重量百分比为20.0％，其余为水分和灰分(重量百分比总和以100％计算)。
将体重接近、健康的雏鸡随机分为5组，每组500只，每组设置2个重复，每个重复250只鸡，饲养期42天。饲养42天出栏后，检测各组的生长指标。试验设计如表1所示。
表1试验分组设计
表2不同分组的白羽肉鸡生产指标对比
注：肉鸡养殖的欧洲指数计算公式＝[(体重x成活率)/(料肉比x出栏日龄)]x10000。欧洲效益指数，是一个肉鸡养殖的综合衡量指标。
试验统计结果如表2所示，几个组在成活率方面差别不大，但添加酶制剂的肉鸡出栏重明显提高，料重比也明显降低；从欧洲指数来看，3个试验组都明显高于对照组和胆汁酸组。
以上结果说明，添加含有木聚糖酶突变体xynM4、xynM5和xynM6的酶制剂能够提高白羽肉鸡养殖中的饲料转化率，提高生产性能，且效果优于单独使用胆汁酸。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体为木聚糖酶突变体xynM，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示、或者如SEQ ID No.5所示、或者如SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体xynM具体为：由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM4；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸和第62位的丝氨酸变为脯氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM5；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第43位的酪氨酸变为苯丙氨酸、第62位的丝氨酸变为脯氨酸和第76为甘氨酸变为谷氨酸得到的木聚糖酶突变体xynM6。
3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因为权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynM的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示、或者如SEQ ID No.6所示、或者如SEQ IDNo.8所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求3所述的编码基因。
5.一种重组工程菌，其特征在于，其包含权利要求3所述的编码基因。
6.一种胆汁酸复配酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸复配酶制剂中包含权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynM和胆汁酸。
7.根据权利要求6所述的胆汁酸复配酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸复配酶制剂是由含木聚糖酶突变体xynM的重组工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸以1:8～12的质量体积比混合而成的。
8.权利要求1所述的木聚糖酶突变体或者权利要求6所述的胆汁酸复配酶制剂在制备提高动物生长性能的饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶突变体或者胆汁酸复配酶制剂的用量为饲料重量的0.005％～0.02％。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂中含有木聚糖酶突变体xynM4、xynM5和xynM6中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211515014.8A CN115851672A (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211515014.8A CN115851672A (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115851672A true CN115851672A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85668018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211515014.8A Pending CN115851672A (zh) | 2022-11-30 | 2022-11-30 | 一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115851672A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102753680A (zh) * | 2009-12-11 | 2012-10-24 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
| CN104109660A (zh) * | 2013-04-17 | 2014-10-22 | 东莞泛亚太生物科技有限公司 | 酶活性提高的木聚糖酶 |
| WO2017112533A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
| CN109750016A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-05-14 | 云南师范大学 | 热稳性提高的木聚糖酶突变体及其制备方法和应用 |
| CN110042092A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-07-23 | 青岛红樱桃生物技术有限公司 | 一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 |
| CN112094834A (zh) * | 2019-06-18 | 2020-12-18 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 比活力提高的木聚糖酶突变体 |
-
2022
- 2022-11-30 CN CN202211515014.8A patent/CN115851672A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102753680A (zh) * | 2009-12-11 | 2012-10-24 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
| CN104109660A (zh) * | 2013-04-17 | 2014-10-22 | 东莞泛亚太生物科技有限公司 | 酶活性提高的木聚糖酶 |
| WO2017112533A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
| CN110042092A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-07-23 | 青岛红樱桃生物技术有限公司 | 一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 |
| CN109750016A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-05-14 | 云南师范大学 | 热稳性提高的木聚糖酶突变体及其制备方法和应用 |
| CN112094834A (zh) * | 2019-06-18 | 2020-12-18 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 比活力提高的木聚糖酶突变体 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105614023B (zh) | 一种用于豆粕发酵的发酵酶解剂及其应用 | |
| CN103261409B (zh) | 甘露聚糖酶、其编码基因及其生产 | |
| BRPI9906426B1 (pt) | Composição líquida e em pó, e, usos das composições | |
| CN109247447B (zh) | 替代血浆蛋白粉生产教槽料的酵母水解物及其制备方法 | |
| CN103627686B (zh) | 一种木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN106520642B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102002465B (zh) | 一种酸性β-甘露聚糖酶VMAN及其基因和应用 | |
| CN110317748A (zh) | 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用 | |
| CN101974460B (zh) | 一种海洋来源Bacillus barbaricus SCSIO 02429以及用它制备鱿鱼小肽的方法 | |
| CN100491533C (zh) | 改良的高比活木聚糖酶及其基因、包括该基因的表达载体和重组酵母细胞以及表达方法 | |
| CN109997970B (zh) | 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN116925927A (zh) | 一种黑曲霉（Aspergillus niger）PL-L2及其应用 | |
| CN108118006A (zh) | 一种耐温木聚糖酶马克斯克鲁维酵母工程菌株及其应用 | |
| CN114774396B (zh) | 角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用 | |
| CN115851672A (zh) | 一种木聚糖酶突变体及胆汁酸复配酶制剂和应用 | |
| CN103695383B (zh) | 一种高效表达α-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株 | |
| CN116064479B (zh) | 一种含木聚糖酶突变体和胆汁酸的复合制剂及其应用 | |
| CN115851670B (zh) | 木聚糖酶突变体及与杜仲叶提取物的复配制剂和在饲料添加剂的应用 | |
| CN115851671A (zh) | 木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用 | |
| CN116042581B (zh) | 一种共表达突变酶重组菌及其制剂和在制备水产动物的饲料添加剂中的应用 | |
| CN116004585B (zh) | 一种桉树精油突变酶制剂及其在家畜养殖中的应用 | |
| CN117296994B (zh) | 一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用 | |
| CN102987057B (zh) | 一种通过微生物发酵生产生物鱼粉的方法 | |
| CN103756919A (zh) | 一种木聚糖酶的重组菌株及其应用 | |
| CN115975992B (zh) | 一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No. 9 Yanying North Road, Yanbei Street Office, Qihe County, Dezhou City, Shandong Province, 253000 Applicant after: Shandong Longchang Animal Health Products Co.,Ltd. Address before: 251100 No.1, North Park Road, Qihe Economic Development Zone, Dezhou City, Shandong Province Applicant before: SHANDONG LONGCHANG ANIMAL HEALTH PRODUCT Co.,Ltd. |