CN114686386A

CN114686386A - 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用

Info

Publication number: CN114686386A
Application number: CN202210611032.XA
Authority: CN
Inventors: 吴信; 高乐
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-06-01
Filing date: 2022-06-01
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2042-06-01
Also published as: CN114686386B

Abstract

本发明开发一种可以生产甲醇蛋白且联产纤维素酶的毕赤酵母，经微生物发酵生产，可在生产甲醇蛋白的同时联产纤维素酶制剂。本发明的毕赤酵母经诱变和基因工程改造获得，其具有生长速度快，甲醇菌体蛋白生产效率高的特点；甲醇蛋白含量近60%，含有全部8种必需氨基酸，具有优氨基酸配比的特性；在甲醇菌体蛋白生产的同时，联产中性纤维素酶制剂，通过简单固液分离，获得的中纤维素酶制剂，酶活力可以达到13060IU/ml。通过甲醇菌体蛋白联产纤维素酶制剂生产模式，最大程度地提升产品综合经济效益，提升发酵原料的转化率和利用率。

Description

一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株生产甲醇菌体蛋白联产中性纤维素酶的毕赤酵母及其应用。

背景技术

甲醇是一种重要的基础有机化工原料，也是一种新型清洁能源，其用途十分广泛。甲醇的制备工艺主要为煤制甲醇、焦炉气制甲醇及天然气制甲醇。我国甲醇产能已经超过4500万吨/年，并呈现继续增加趋势，而国内甲醇需求量仅为1000万吨/年，急需开发甲醇下游产品。目前，甲醇价格低廉，甲醇蛋白生产成本低，甲醇蛋白营养价值高,以甲醇蛋白代替传统的鱼粉和豆类等蛋白，将会降低饲料蛋白生产成本，提高饲料营养价值和利用率。

畜禽动物养殖过程中，畜禽对日粮化饲料的消化率要比理论值低的多,这主要是基于两方面的原因:一方面日粮化饲料中细胞壁中含有的木聚糖、纤维素、β-葡聚糖、甘露聚糖、果胶等难以消化的物质，不能被作为养分消化吸收，且干扰整个日粮其他营养的消化吸收和利用，阻碍奶牛、肉牛内源消化酶与细胞内营养物质的作用，降低牧草饲料中脂肪、淀粉和蛋白质营养价值。另一方面饲料中含有一些水溶性的非淀粉多糖,这些多糖可以产生抗营养作用,从而出现畜禽对日粮化饲料的利用率下降、生长不良以及产生粘粪、污染环境等一系列问题。亟待针对日粮中生物质结构特性的开发专用饲用纤维素酶制剂作为预消化制剂，在日粮中添加并参与饲料日粮配方。真正将酶制剂赋予了潜在营养价值，且通过酶制剂降低牧草饲料抗营养因子，提升饲料品质及原料利用率，促进生物饲料及其日粮消化吸收。当前我国对饲用纤维素酶制剂的研究尚在起步阶段，具有自主知识产权饲用酶菌株酶活力相对偏低，饲用纤维素酶成本目前高于国外先进技术（如诺维信）。目前酶制剂在动物中应用的研究大多停留在定性方面，而对酶制剂的定量研究较少，尤其在酶制剂对动物生理上的影响研究甚少，许多酶制剂的作用机制及促生长机理还不太清楚，消化生理等方面也有待深入研究。饲用酶如何在不同饲料日粮中精准添加也成为一大难题。饲用纤维素酶制剂仍需要加大科技投入，加强新菌种筛选、微生物发酵、基因改良和应用试验等研究工作，研制出更适合于饲料原料特点的饲用酶制剂产品，打破国外饲用酶制剂的垄断，更好的推动我国饲用酶制剂的生产和广泛应用。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种广泛应用于单细胞蛋白生产的宿主, 以快速利用甲醇；同时其具有高密度生长和高蛋白质分泌能力等优点，也被广泛用于酶制剂的表达。如果毕赤酵母在高密度发酵获得甲醇菌体蛋白的同时，其胞外分泌表达酶制剂，酶制剂和单细胞蛋白同时生产进一步提高其经济价值。

发明内容

本发明提供一株可以生产甲醇蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母，经微生物发酵生产，可在生产甲醇蛋白的同时联产纤维素酶制剂。发酵液通过板框过滤实现酵母菌体和上清发酵液液的固液分离,将酵母菌体喷雾干燥后可制得单细胞甲醇蛋白,而发酵上清液经一系列后处理工艺可制得纤维素酶制剂。纤维素酶制剂可以饲料领域应用取得较好的进展。

具体来说，本发明首先提供一种毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO. 24324，保藏时间为：2022年1月17日。

进一步地，本发明提供一种产中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，在上述的毕赤酵母菌株中导入特异腐质菌（Humicola insolens）的纤维素酶cel45a编码基因。

更进一步地，本发明提供一种产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，在所述的产中性纤维素酶的毕赤酵母菌株中进一步导入灰腐质霉(Humicola grisea) 的纤维素酶cel5a的编码基因。

优选地，所述导入采用基因编辑的方式实现，且将采用启动子AOX可操作与所述编码基因连接。

更优选地，所述纤维素酶cel5a的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述纤维素酶cel45a的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。另外优选地，所述纤维素酶cel5a的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述纤维素酶cel45a的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

本发明还提供一种生产纤维素酶制剂的方法，其包括利用如所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株生产纤维素酶的步聚。

具体地，包括培养所述产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，收集所述产生的纤维素酶的步骤。

优选地，发酵所述菌株的培养基中含有甘油， KH2PO4， NH4H2PO4， MgSO4·7H2O；发酵过程中，甘油按照0.5-1.0rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；发酵至12-36小时，开始补料甲醇0.1 rpm/h，维持DO≥25%。

具体实施方式中，培养温度 30 ℃，pH值 4. 5~ 5. 0,空气流量 4~8 m³ / h。

本发明还提供所述的方法所得到的纤维素酶制剂。

并进一步提供所述的纤维素酶制剂作为饲料添加剂的应用。

本发明还提供所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株甲醇蛋白中的应用。具体地，包括用甲醇诱导所述产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株的步骤；将发酵液固液分离，收集甲醇菌体蛋白的步骤。

本发明开发一株可以生产甲醇蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母，经微生物发酵生产，可在生产甲醇蛋白的同时联产纤维素酶制剂。本发明的毕赤酵母经诱变和基因工程改造获得，其具有生长速度快，甲醇蛋白含量近60%，比大豆蛋白含量高25%；同时含有全部8种必需氨基酸，具有优氨基酸配比的特性；该种通过微生物发酵法生产甲醇蛋白的模式，其生产原料广泛且廉价，且不受地区、季节和气候的限制，节约土地和水资源。在甲醇菌体蛋白生产的同时，可同时产中性纤维素酶制剂，通过简单固液分离，获得的中纤维素酶制剂，酶活力可以达到13060IU/ml。在动物营养功能评价结果可以看出，中性纤维素酶制剂可有效地降低饲料中抗营养因子，提高奶牛、肉牛对饲料的利用率，节约饲料生产成本。因此，本发明通过甲醇菌体蛋白联产纤维素酶制剂生产模式，最大程度地提升产品综合经济效益，提升发酵原料的转化率和利用率。

附图说明

图1：不同嗜热中性纤维素酶在毕赤酵母异源表达后酶活力比较。

图2：灰腐质霉(Humicola grisea)纤维素酶基因（GenBank: KX096883.1）电泳图。

图3：构建质粒pPICZαA-H.g cellulase 图谱。

图4：毕赤酵母中性位点PNSII-3定点插入的特异腐质菌（Humicola insolens）纤维素酶表达盒示意图。

图5：毕赤酵母中性位点PNSII-3定点插入的特异腐质菌（Humicola insolens）纤维素酶表达盒构建的核酸电泳图。

图6：毕赤酵母中性位点PNSII-3的Crisper-cas9 质粒图谱。

图7：H.Icel45a转化到毕赤酵母菌株C2感受态后转化子筛选情况。

图8：H.Icel45a转化到毕赤酵母菌株C2感受态后转化子PCR验证结果。其中，图中的10个转化子是随机挑选的10个转化子，是通过菌落PCR验证，能够扩增出3000bp片段而认为是阳性转化子。

生物材料保藏信息：

本发明中的毕赤酵母菌株(pichia pastoris)C1，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏时间为：2022年1月17日，保藏号为：CGMCC NO.24324，分类命名是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行描述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1.甲醇营养型毕赤酵母ARTP诱变与筛选获得毕赤酵母菌株C1

使用无菌的PBS缓冲液从YPD固体培养基将培养3天的毕赤酵母X33细胞冲洗下来，用PBS缓冲液洗涤2～3次，获得干净的细胞；使用血球计数板在显微镜下计数，适当调整细胞浓度，使得细胞浓度在10⁷cfu·m L^-1。

将制备好的毕赤酵母细胞悬液吸取10ul，充分涂匀在无菌金属载片上，设置诱变条件为：射频输入功率120 w，气体流量10S LM，诱变时间分别设置为80-200s。处理结束后将金属载片置于1mL 1×PBS缓冲液的5mL离心管中，震荡混匀后静置2～3h，稀释适当倍数，吸取50ul洗脱液，使用一次性涂布棒均匀涂布在YPD固体平板上，将诱变后的成功生长的毕赤酵母单菌落挑入96深孔板中。深孔板采用含甲醇的MM培养基。30小时后，分别测定剩余甲醇的含量，选取甲醇利用速度最高的诱变毕赤酵母菌株C1，其甲醇的比消耗速率为 0.21g/ (g*h)，而出发菌毕赤酵母X33的数值仅为0.16 g/ (g*h)。对该菌进行了保藏，其保藏号为CGMCC NO.24324。

实施例2. 嗜热中性纤维素酶基因筛选

嗜热纤维素酶不仅仅是可以用于高温条件下生物质的加工与转化，由于热稳定性高的特点往往赋予纤维素酶一些优良特性，比如：酶保存周期长、半衰期长等。因此可以提高纤维素酶的使用效率，在生产应用中往往可以减少纤维素酶的使用量，从而降低酶的使用成本。

针对报道的产嗜热中性纤维素酶的菌株，如特异腐质菌（Humicola insolens），灰腐质霉(Humicola grisea)，嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum），嗜热子囊菌（Thermoascas aurntiacus），嗜热侧孢霉（Scytaliduem thermophillum）纤维素酶基因，通过基因合成和密码子优化，分别在毕赤酵母中进行异源表达，挑取成功转化子，在摇瓶条件下利用甲醇诱导3天后，测定中性纤维素酶酶活力；通过酶活力结果图1显示，发现来源于特异腐质菌（Humicola insolens）的纤维素酶cel45a（GenBank: QCH00668.1）和灰腐质霉(Humicola grisea) 的纤维素酶cel5a（GenBank: KX096883.1）两个中性纤维素酶酶活力最优，其中性纤维素酶酶活力分别达到210.2IU/ml和208.6 IU/ml，后续将该两种纤维素酶基因在毕赤酵母C1菌株中进行转化与表达。

实施例3. 两种中性纤维素酶在毕赤酵母中共表达

两种中性纤维素酶在毕赤酵母中共表达的策略是，一方面，构建pPICZαA-H.gcel5a的表达盒，整合到毕赤酵母基因组上；另一方面，在毕赤酵母基因组中性位点，利用crisper-cas9基因编辑技术插入H.icel45的基因；由于这两个中性纤维素酶基因的启动子均采用AOX，在甲醇诱导条件下，这两个中性纤维素酶基因均可以正常表达。

①灰腐质霉纤维素酶cel5a在毕赤酵母C1菌株中异源表达

灰腐质霉(Humicola grisea)纤维素酶cel5a（GenBank: KX096883.1）通过基因进行合成并完成密码子优化，提高基因元件在酵母中适配性。通过核酸电泳图（图2）确认H.g纤维素酶基因大小为1251bp。选择AvrII和NotI两个酶切位点，采用一步法同源重组到质粒pPIC9K上构建表达质粒pPICZαA-H.g cellulase（图3），通过双酶切验证和测序结果验证表达质粒pPICZαA-cellulase构建正确。用限制性内切酶SacI线性化表达质粒pPIC9K-H.gcellulase，采用电转化法转入毕赤酵母X33菌株中，通过YPD平板（氨苄抗性）筛选阳性转化子，获得产中性纤维素酶的毕赤酵母C2菌株。

Humicola grisea纤维素酶cel5a氨基酸序列如下（SEQ ID NO：1）：

MYLLLAAALLGAAVLYYLYRSESRLHRPWIPDPESRKFAERPLPPPIDDSFLSSPNYTLPLRTRGRDIVDANGRRFKLAAVNWYGGSDELFVPGGLDVRHRDDIARTIRRMGFNTVRLPYSDELVIKNPVVAPHLLSANPDLAGRRALDIFAAVVEALTAQGIAVIVNDHITTATWCCGADPCDSGWANDHIPSIFCRVRQTEEEWIEHWEEVMKRFVDNPLVIGADLRNEVRGLWGTMPWERWAAAAERAGNRLLRMNPDWLIIVGGTESQNDLTGVARRPIVLDVPDRVVYSAHVYSWSGWGSLGGRYAQRTYPSFVQSMRKNWAYIVEQGIAPVWIGEFGAPVNPGQGDANYWQNLLRYLKVVDADFGYWAINPRKPHENEKESYALLEDDWETPVLDYRMKDLVELMRAGLE。

密码子优化后的核苷酸序列如下（SEQ ID NO：2）：

ATGTATCTACTACTAGCTGCTGCTCTTCTGGGTGCCGCAGTGCTTTACTATCTTTACCGATCTGAGAGTCGATTGCATAGACCTTGGATTCCAGACCCTGAGTCTAGAAAATTCGCTGAAAGACCCCTGCCACCACCCATTGATGATTCCTTTCTATCATCCCCAAACTACACCCTTCCATTACGAACTAGAGGTCGAGATATTGTTGACGCAAATGGACGAAGGTTTAAATTGGCTGCAGTTAACTGGTACGGAGGTTCAGACGAATTGTTCGTGCCTGGAGGTCTTGATGTCAGACACAGGGATGATATTGCCAGAACAATTAGACGTATGGGTTTTAACACTGTTAGATTACCATATTCTGATGAGCTGGTTATAAAAAACCCTGTCGTCGCTCCTCATCTGTTATCAGCTAACCCTGACTTGGCAGGAAGACGTGCTTTGGATATTTTCGCCGCCGTTGTTGAGGCACTGACAGCTCAAGGTATTGCTGTCATTGTTAACGATCATATTACTACTGCTACTTGGTGCTGTGGAGCTGACCCATGTGATTCAGGATGGGCTAATGATCATATTCCATCTATTTTTTGTAGAGTTAGACAAACTGAAGAAGAGTGGATCGAACACTGGGAGGAAGTAATGAAGAGATTCGTGGATAACCCTCTTGTTATTGGAGCTGATCTGAGAAACGAAGTAAGGGGCTTGTGGGGTACGATGCCTTGGGAAAGATGGGCCGCTGCCGCTGAGAGAGCTGGTAACAGACTGTTGCGTATGAACCCTGACTGGCTGATAATAGTGGGAGGAACCGAATCTCAGAACGATCTGACGGGAGTTGCCAGGAGGCCAATTGTACTAGACGTTCCTGACAGAGTTGTTTATAGTGCCCACGTGTATTCCTGGTCTGGTTGGGGTTCCCTGGGTGGAAGATACGCTCAAAGAACATATCCTAGTTTCGTGCAAAGTATGAGGAAGAACTGGGCTTACATCGTGGAACAGGGTATTGCTCCCGTCTGGATTGGTGAGTTTGGTGCCCCTGTGAACCCCGGTCAGGGTGATGCTAATTACTGGCAAAATTTGTTGAGGTATTTGAAAGTGGTTGACGCCGACTTTGGCTACTGGGCAATCAATCCAAGAAAGCCACATGAAAATGAGAAGGAGTCTTACGCCTTACTAGAGGACGATTGGGAAACCCCTGTGCTTGACTACAGAATGAAAGATCTGGTTGAATTGATGAGAGCTGGTTTGGAATAA

②特异腐质菌纤维素酶cel45a利用crisper-cas9技术在毕赤酵母中异源表达

首先选择毕赤酵母基因组上中性位点，异源基因的插入并不会影响底盘细胞正常生理活性。通过之前发表文章中性位点及其转化效率比较（Peng Cai等， Recombinationmachinery engineering facilitates metabolic engineering of the industrialyeast Pichia pastoris. Nucleic Acids Research, Volume 49, Issue 13, 21 July2021, Pages 7791–7805, https://doi.org/10.1093/nar/gkab535），本发明选择染色体2上中性位点PNSII-3，其对应的sgRNA 序列为：TATAAGGCTCTTGTAGATGGAGG。

选择特异腐质菌（Humicola insolens）纤维素酶cel45a的氨基酸序列如下（SEQID NO：3）：

ADGKSTRYWDCCKPSCGWAKKAPVNQPVFSCNANFQRLTDFDAKSGCEPGGVAYSCADQTPWAVNDDFAFGFAATSIAGSNEAGWCCACYELTFTSGPVAGKKMVVQSTSTGGDLGSNHFDLNIPGGGVGIFDGCTPQFGGLPGQRYGGISSRNECDRFPDALKPGCYWRFDWFKNADNPSFSFRQVQCPAELVARTGCRRNDDGNFPAVQIPSSSTSSPVDQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPSGCTAERWAQCGGNGWSGCTTCVAGSTCTKINDWYHQCL。

密码子优化后的核苷酸序列如下（SEQ ID NO：4）：

GCCGACGGAAAGTCCACGAGGTATTGGGATTGTTGTAAGCCATCATGTGGTTGGGCCAAGAAAGCTCCAGTGAATCAGCCAGTGTTTTCTTGCAATGCTAACTTTCAGCGACTTACCGATTTTGACGCAAAGTCTGGCTGTGAGCCAGGCGGAGTCGCCTATTCTTGCGCCGATCAAACACCATGGGCTGTTAACGACGATTTTGCTTTCGGTTTTGCAGCTACGTCAATTGCAGGTTCTAACGAAGCTGGTTGGTGTTGTGCTTGTTACGAGTTAACTTTCACTTCCGGTCCAGTTGCTGGTAAGAAGATGGTCGTACAGTCCACTTCTACAGGTGGAGATCTTGGTTCCAATCACTTTGATCTGAATATTCCAGGAGGTGGTGTTGGTATCTTCGACGGATGCACTCCACAGTTCGGTGGCCTGCCAGGACAAAGATACGGCGGAATTTCTTCACGTAACGAGTGTGATCGATTTCCAGATGCTCTGAAACCAGGATGTTATTGGAGATTCGATTGGTTCAAAAACGCCGACAACCCTTCATTTTCTTTTAGGCAAGTTCAGTGTCCTGCTGAGTTGGTGGCTAGAACAGGTTGTAGAAGAAATGACGATGGAAATTTCCCAGCTGTTCAAATTCCATCATCTTCTACCTCATCACCTGTAGATCAGCCTACATCTACTAGTACTACCTCCACTTCAACAACATCCTCTCCACCAGTTCAGCCAACAACTCCTAGTGGATGTACTGCTGAGCGATGGGCTCAATGTGGTGGTAATGGTTGGTCCGGCTGTACGACCTGCGTGGCAGGATCTACATGTACTAAAATTAACGACTGGTACCATCAATGCTTGTAA。

首先构建H.Icel45a在PNSII-3中性位点插入表达盒（见图4），首先扩增获得上游片段PNSII-3-up（500bp），甲醇诱导型启动子AOX1+基因序列H.Icel45a（2049bp），终止子T（200bp），下游片段PNSII-3-down（500bp），通过融合PCR和一步巢氏PCR，获得PNSII-3-H.Icel45a表达盒（图5），片段大小3249bp。PNSII-3-H.Icel45a表达盒和pPICZ-Cas9-PNSII-3质粒（G418抗性）共转化，pPICZ-Cas9-PNSII-3质粒信息见图6。通过电转到毕赤酵母C2菌株中，通过筛选平板获得转化子(图7)，通过菌落PCR验证（图8），转化子5-9能够扩增出插入片段PSNII-3-H.Icel45a的全长，证明该转化子是成功转入Hicel45a表达盒的菌株，从而获得高产中性纤维素酶毕赤酵母菌株C3。

实施例4. 毕赤酵母菌株C3的培养

1、种子培养基及培养条件：选择 YPD 复合培养基为种子培养基：1% 酵母浸粉，2%蛋白胨、2% 葡萄糖， pH自然。培养条件：在 250 mL 摇瓶中装入 50 mL 种子培养基，毕赤酵母接种量为 1%，于 30 ℃，200 r/ min 摇床培养 24 h。

2、100 L 发酵罐发酵培养基及培养条件：选择毕赤酵母100 L 发酵罐发酵培养基：42g/L甘油，1.2g/L KH₂PO₄，18g/L NH₄H₂PO₄，6.5 g/L MgSO₄·7H₂O。培养条件:100L发酵罐装液量为70 L，毕赤酵母接种量为 1%，培养温度 30 ℃，pH 值 4. 5~ 5. 0，空气流量 4~8 m³ / h，甘油按照0.5-1.0rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 12 h后，补料甲醇0.1 rpm/h，维持DO≥25%；每隔24h取样测定纤维素酶酶活力。

3、酶活力测定：

在50℃、pH值为4.5的条件下，每分钟从浓度为15 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1µmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/ mL表示。

吸取1.80 mL羧甲基纤维素钠溶液（pH4.5），加入到刻度试管中，50℃预热5 min，再加入0.20 mL经过适当稀释的酶液（已经过50℃预热5 min），混匀，50℃精确保温10 min后加入3 mL DNS试剂，混匀。沸水浴煮沸5 min，用自来水冷却至室温，不定容混匀。以空白样为对照调仪器零点，在540 nm处测定吸光值。

样品酶活力的计算按下式计算：

式中：

X— 试样中的纤维素酶活力， U/mL；A — 酶反应液扣除空白样的吸光度；

K — 标准曲线的斜率；C_O — 标准曲线的截距；m—称样量，毫升(mL)；

M — 葡萄糖的摩尔质量M (C₆H₁₂O₆) = 180.2 g/mol；t — 酶解反应时间，min；1000 — 转化因子，1mmol= 1000µmol；n—试样的稀释倍数。

5、纤维素酶制剂检测与应用

在毕赤酵母菌株C3发酵24h时，细胞培养密度达到150g细胞干重/L，开始流加10g/L的甲醇。随着甲醇诱导，毕赤酵母菌株C3中异源表达的纤维素酶酶活力持续提升，当发酵到168h时，发酵液中纤维素酶酶活力最高可以达到13060IU/ml。

纤维素酶制剂现已经完成小规模应用评价试验，泌乳牛219头（含新产牛）使用未添加纤维素酶制剂的全日粮饲料作为对照组：泌乳牛230头（含高三区）使用添加纤维素酶制剂的全日粮饲料作为实验组；按照200g纤维素酶/头/天添加量加入全日粮饲料饲喂实验组；未添加纤维素酶的全日粮饲料饲喂对照组。饲喂的全日粮饲料重量保持一致。通过40天日粮、粪便取样实验数据平均处理和分析，以预消化制剂方式处理反刍饲料，反刍饲料消化率提升20.85%，其中中性洗涤纤维消化率提升8.72%，粗蛋白消化率提升10.8%，淀粉消化率提升1.33%（如下表），有效地降低饲料中抗营养因子，提高奶牛、肉牛对饲料的利用率，节约饲料生产成本。

其中，饲料中中性洗涤纤维的测定按照：GB/T 20806-2006 ；粗蛋白含量测定方法：粗蛋白质GB/T 6432-1994；淀粉含量测定方法：食品中淀粉的测定GB/T5009.9-2008。

6、毕赤酵母生产甲醇菌体蛋白分析

粗蛋白质GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白的测定方法》。氨基酸含量测定采用A200型amino Nova氨基酸分析仪参照中华人民共和国国家标准GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》进行测定。

毕赤酵母菌株C3在5L发酵罐连续发酵120h后，甲醇诱导产生大量的中性纤维素酶。通过板框过滤将发酵液实现固液分离，收集甲醇菌体蛋白；经测定，甲醇菌体蛋白粗蛋白含量为59.32%，氨基酸含量为46.98%。其中必需氨基酸种类包括有8种。即：赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，必需氨基酸总含量为20.21%，占到总氨基酸的43.02%。结果如下表。

与传统农业蛋白相比，本发明的毕赤酵母菌株C3发酵法生产甲醇菌体蛋白的优点，包括：1）蛋白质含量近60%，比大豆蛋白含量高25%；同时含有全部8种必需氨基酸，具有优氨基酸配比的特性；2）微生物繁殖速度快，生产效率高；3）生产原料广泛且廉价，可以实现低值原料的资源化利用；4）可以工业化生产，不受地区、季节和气候的限制，节约土地和水资源。5)在生产甲醇蛋白的同时联产中性纤维素酶制剂，中性纤维素酶酶活力可以达到13060 IU/ml，其可有效地降低饲料中抗营养因子，提高奶牛、肉牛对饲料的利用率，节约饲料生产成本。6）通过甲醇菌体蛋白联产纤维素酶制剂生产模式，最大程度地提升产品综合经济效益，提升发酵原料的转化率和利用率。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 416

<212> PRT

<213> 灰腐质霉(Humicola grisea)

<400> 1

MYLLLAAALLGAAVLYYLYRSESRLHRPWIPDPESRKFAERPLPPPIDDSFLSSPNYTLPLRTRGRDIVDANGRRFKLAAVNWYGGSDELFVPGGLDVRHRDDIARTIRRMGFNTVRLPYSDELVIKNPVVAPHLLSANPDLAGRRALDIFAAVVEALTAQGIAVIVNDHITTATWCCGADPCDSGWANDHIPSIFCRVRQTEEEWIEHWEEVMKRFVDNPLVIGADLRNEVRGLWGTMPWERWAAAAERAGNRLLRMNPDWLIIVGGTESQNDLTGVARRPIVLDVPDRVVYSAHVYSWSGWGSLGGRYAQRTYPSFVQSMRKNWAYIVEQGIAPVWIGEFGAPVNPGQGDANYWQNLLRYLKVVDADFGYWAINPRKPHENEKESYALLEDDWETPVLDYRMKDLVELMRAGLE 416

<210> 2

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGTATCTACTACTAGCTGCTGCTCTTCTGGGTGCCGCAGTGCTTTACTATCTTTACCGATCTGAGAGTCGATTGCATAGACCTTGGATTCCAGACCCTGAGTCTAGAAAATTCGCTGAAAGACCCCTGCCACCACCCATTGATGATTCCTTTCTATCATCCCCAAACTACACCCTTCCATTACGAACTAGAGGTCGAGATATTGTTGACGCAAATGGACGAAGGTTTAAATTGGCTGCAGTTAACTGGTACGGAGGTTCAGACGAATTGTTCGTGCCTGGAGGTCTTGATGTCAGACACAGGGATGATATTGCCAGAACAATTAGACGTATGGGTTTTAACACTGTTAGATTACCATATTCTGATGAGCTGGTTATAAAAAACCCTGTCGTCGCTCCTCATCTGTTATCAGCTAACCCTGACTTGGCAGGAAGACGTGCTTTGGATATTTTCGCCGCCGTTGTTGAGGCACTGACAGCTCAAGGTATTGCTGTCATTGTTAACGATCATATTACTACTGCTACTTGGTGCTGTGGAGCTGACCCATGTGATTCAGGATGGGCTAATGATCATATTCCATCTATTTTTTGTAGAGTTAGACAAACTGAAGAAGAGTGGATCGAACACTGGGAGGAAGTAATGAAGAGATTCGTGGATAACCCTCTTGTTATTGGAGCTGATCTGAGAAACGAAGTAAGGGGCTTGTGGGGTACGATGCCTTGGGAAAGATGGGCCGCTGCCGCTGAGAGAGCTGGTAACAGACTGTTGCGTATGAACCCTGACTGGCTGATAATAGTGGGAGGAACCGAATCTCAGAACGATCTGACGGGAGTTGCCAGGAGGCCAATTGTACTAGACGTTCCTGACAGAGTTGTTTATAGTGCCCACGTGTATTCCTGGTCTGGTTGGGGTTCCCTGGGTGGAAGATACGCTCAAAGAACATATCCTAGTTTCGTGCAAAGTATGAGGAAGAACTGGGCTTACATCGTGGAACAGGGTATTGCTCCCGTCTGGATTGGTGAGTTTGGTGCCCCTGTGAACCCCGGTCAGGGTGATGCTAATTACTGGCAAAATTTGTTGAGGTATTTGAAAGTGGTTGACGCCGACTTTGGCTACTGGGCAATCAATCCAAGAAAGCCACATGAAAATGAGAAGGAGTCTTACGCCTTACTAGAGGACGATTGGGAAACCCCTGTGCTTGACTACAGAATGAAAGATCTGGTTGAATTGATGAGAGCTGGTTTGGAATAA 1251

<210> 3

<211> 284

<212> PRT

<213> 特异腐质菌（Humicola insolens）

<400> 3

ADGKSTRYWDCCKPSCGWAKKAPVNQPVFSCNANFQRLTDFDAKSGCEPGGVAYSCADQTPWAVNDDFAFGFAATSIAGSNEAGWCCACYELTFTSGPVAGKKMVVQSTSTGGDLGSNHFDLNIPGGGVGIFDGCTPQFGGLPGQRYGGISSRNECDRFPDALKPGCYWRFDWFKNADNPSFSFRQVQCPAELVARTGCRRNDDGNFPAVQIPSSSTSSPVDQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPSGCTAERWAQCGGNGWSGCTTCVAGSTCTKINDWYHQCL 284

<210> 4

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GCCGACGGAAAGTCCACGAGGTATTGGGATTGTTGTAAGCCATCATGTGGTTGGGCCAAGAAAGCTCCAGTGAATCAGCCAGTGTTTTCTTGCAATGCTAACTTTCAGCGACTTACCGATTTTGACGCAAAGTCTGGCTGTGAGCCAGGCGGAGTCGCCTATTCTTGCGCCGATCAAACACCATGGGCTGTTAACGACGATTTTGCTTTCGGTTTTGCAGCTACGTCAATTGCAGGTTCTAACGAAGCTGGTTGGTGTTGTGCTTGTTACGAGTTAACTTTCACTTCCGGTCCAGTTGCTGGTAAGAAGATGGTCGTACAGTCCACTTCTACAGGTGGAGATCTTGGTTCCAATCACTTTGATCTGAATATTCCAGGAGGTGGTGTTGGTATCTTCGACGGATGCACTCCACAGTTCGGTGGCCTGCCAGGACAAAGATACGGCGGAATTTCTTCACGTAACGAGTGTGATCGATTTCCAGATGCTCTGAAACCAGGATGTTATTGGAGATTCGATTGGTTCAAAAACGCCGACAACCCTTCATTTTCTTTTAGGCAAGTTCAGTGTCCTGCTGAGTTGGTGGCTAGAACAGGTTGTAGAAGAAATGACGATGGAAATTTCCCAGCTGTTCAAATTCCATCATCTTCTACCTCATCACCTGTAGATCAGCCTACATCTACTAGTACTACCTCCACTTCAACAACATCCTCTCCACCAGTTCAGCCAACAACTCCTAGTGGATGTACTGCTGAGCGATGGGCTCAATGTGGTGGTAATGGTTGGTCCGGCTGTACGACCTGCGTGGCAGGATCTACATGTACTAAAATTAACGACTGGTACCATCAATGCTTGTAA 855

Claims

1.一种毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)，其特征在于，所述菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO. 24324。

2.一种产中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，在如权利要求1所述的毕赤酵母菌株中导入特异腐质菌（Humicola insolens）的纤维素酶cel45a编码基因。

3.一种产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，在如权利要求2所述的产中性纤维素酶的毕赤酵母菌株中进一步导入灰腐质霉(Humicola grisea) 的纤维素酶cel5a的编码基因。

4.如权利要求3所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述导入采用基因编辑的方式实现，且将采用启动子AOX可操作与所述编码基因连接。

5.如权利要求4所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述纤维素酶cel5a的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述纤维素酶cel45a的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

6.如权利要求5所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述纤维素酶cel5a的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述纤维素酶cel45a的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.一种生产纤维素酶制剂的方法，其包括利用如权利要求3-6任一项所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株生产纤维素酶的步聚。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括培养所述产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株，收集产生的所述纤维素酶的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵所述菌株的培养基中含有甘油，KH₂PO₄，NH₄H₂PO₄，MgSO₄·7H₂O；发酵过程中，甘油按照0.5-1.0rpm/ 30 min /次补料，维持DO≥20%；发酵至12-36小时，开始补料甲醇0.1 rpm/h，维持DO≥25%。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，培养温度30℃,pH 值4. 5~ 5. 0,空气流量4~8 m³/h。

11.如权利要求7至10任一项所述的方法所得到的纤维素酶制剂。

12.如权利要求11所述的纤维素酶制剂作为饲料添加剂的应用。

13.如权利要求4-6任一项所述的产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株甲醇蛋白中的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，包括用甲醇诱导所述产两种中性纤维素酶的毕赤酵母菌株的步骤；将发酵液固液分离，收集甲醇菌体蛋白的步骤。