CN116286508B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵低质蛋白饲料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵低质蛋白饲料的方法，属于农业微生物领域，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为BacillusamyloliquefaciensT11；保藏编号为CCTCCNO：M20211450，该菌株可提高发酵低质蛋白饲料蛋白质含量，并分泌羧甲基纤维素酶和滤纸酶降解发酵饲料中纤维，羧甲基纤维素酶和滤纸酶的活力分别可达9.37U/g和9.21U/g底物，该菌株用于发酵全棉籽、棉籽粕和菜籽粕等纤维含量较高的蛋白饲料，其粗蛋白含量大幅提升，粗纤维含量大幅降低，并且显著降低抗营养因子含量，饲料营养价值显著改善。本发明解决现有饲用发酵菌株对高纤维蛋白饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高杂粕、副产物类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵低质蛋白饲料的方法。
背景技术
我国优质蛋白质饲料资源缺乏，仍需大量进口，人畜争粮的现象普遍存在，已成为制约畜牧行业发展的主要因素，随着我国饲料玉米豆粕减量替代计划的推出，多元化饲粮配方将成为我国畜牧养殖业的主要发展方向，因此开发新的饲草料和高值化利用现有饲料原料是行业发展的重要目标。我国菜籽粕、棉籽粕、全棉籽等杂粕、副产物饲料资源丰富，是反刍家畜重要的蛋白质饲料来源，但由于其蛋白质和氨基酸品质较差，纤维含量高，适口性较差等问题，实际生产利用受到限制，节粮作用发挥不够充分，仍需补充大量豆粕等优质蛋白饲料，因此改善其营养价值具有重要意义。饲料资源提质增效加工普遍提倡采用微生物发酵饲料。但目前常用的提升饲料蛋白质含量的发酵菌种如枯草芽孢杆菌等主要应用于豆粕等纤维含量低的饲料原料，由于全棉籽、菜粕、棉籽粕等原料纤维含量高于豆粕等优质蛋白饲料原料，减弱微生物发酵作用，蛋白质提升效果有待提高。目前针对菜籽粕、棉籽粕、全棉籽等杂粕、副产物原料营养特性，既能分泌纤维降解酶，又能有效提升原料蛋白含量的菌株较缺乏。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵低质蛋白饲料的方法，属于农业微生物领域，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens T11；保藏编号为CCTCC NO：M 20211450，该菌株可提高发酵低质蛋白饲料蛋白质含量，并分泌羧甲基纤维素酶和滤纸酶降解发酵饲料中纤维，羧甲基纤维素酶和滤纸酶的活力分别可达9.37U/g和9.21U/g底物，该菌株用于发酵全棉籽、棉籽粕和菜籽粕饲料等纤维含量较高的蛋白饲料，其粗蛋白含量大幅提升，粗纤维含量大幅降低，并且显著降低抗营养因子含量，饲料营养价值显著改善。本发明解决现有饲用发酵菌株对高纤维蛋白饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高杂粕、副产物类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
为达到上述目的，采用的技术方案如下：
一种解淀粉芽孢杆菌T11，所述解淀粉芽孢杆菌T11的分类命名为Bacillusamyloliquefaciens T11；保藏编号为CCTCC NO：M 20211450，保藏日为2021年11月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌T11是从土壤中分离筛选出来，在鉴别培养基上39℃培养2d，为白色圆形菌落，表面突起，边缘相对整齐，且菌落较大，易挑取；所述土壤为竹林、灌木和树根处10cm以下腐殖土。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌T11分类学地位根据如下方法确定：
常规方法提取菌株T11的总DNA，用全长通用引物扩增其16S rDNA片段，然后将PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比较分析，并构建系统发育树，如图2所示。经比较分析，本发明的菌株T11属于芽孢杆菌属(Bacillus)，将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌T11通过滤纸崩解试验、刚果红试验和纤维酶活的测定，发现所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11分泌的纤维降解酶中CMCase活力可达9.37U/g，FPase的活力可达9.21U/g。
所述解淀粉芽孢杆菌T11的分离方法，包括如下步骤：
步骤S1：采集竹林、灌木和树根处10cm以下腐殖土，混合均匀，装入灭菌袋，冷藏备用；
步骤S2：称取5g步骤S1中得到的土壤置于含45mL无菌水的100mL的三角烧瓶中，以180r/min震荡30min后静置；取2mL土壤上清置于含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养2d；
步骤S3：将步骤S2中得到的菌液培养液进行梯度稀释至10-7倍，每个梯度取30μL涂布到筛选培养基中，39℃倒置培养2d；
步骤S4：根据平板上不同形态的菌落，排除具有明显菌丝特征的真菌菌落，并挑取单个菌落于鉴别培养基中划线，重复几次，不断纯化，获得单菌为止；
步骤S5：将步骤S4中得到的单菌划线在鉴别培养基上培养5天，用0.1％刚果红染液染色1h后用1mol/L氯化钠溶液脱色1h后，挑取透明圈较大的菌落多次划线纯化后点种于鉴别培养基上再次刚果红染色，记录水解透明圈直径d1和单菌菌落直径d2，计算d1/d2的比值，得到纤维素相对降解活性，筛选活性较强的单菌。
步骤S6：将步骤S5中筛选得到的单菌接种于不加琼脂的鉴别培养基中，120r/min振荡培养2d，菌液10mL加入到含5条滤纸条(1*6cm)和100mL滤纸条崩解培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养7d，重复三次，以未接菌的培养基作为空白对照。培养结束后对滤纸条崩解情况观察并记录，选取滤纸条崩解效果明显的菌株用于酶活的测定。
步骤S7：将步骤S6中得到的单菌测定滤纸酶活性FPase和羧甲基纤维素酶活CMCase，选取活性最强的单菌，得到所述解淀粉芽孢杆菌T11。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌T11固态发酵低质蛋白饲料的方法。
进一步的，所述高纤维含量低质蛋白料为全棉籽、菜籽粕和棉籽粕。
进一步的，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵全棉籽的具体方法为：玉米面、麦麸和全棉籽质量比例1：1：7-10，发酵的条件是：发酵温度30-36℃，种子液添加量5.08×106cfu/g，料水比1:0.5-0.7，发酵时间4-6d，发酵后全棉籽粗蛋白含量大幅提升，粗纤维含量大幅降低，并且显著提升游离棉酚脱毒率及脱氧雪腐镰刀菌烯醇降低率，显著降低抗营养因子含量，饲料营养价值显著改善。
进一步的，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵棉籽粕的具体方法为：玉米面、麦麸和棉籽粕质量比例1：1：7-10，发酵的条件是：发酵温度33-38℃，种子液添加量4.06×106cfu/g，料水比1:0.7-1.0，发酵时间3-4d，发酵后棉籽粕的蛋白质含量大幅提升，饲料营养价值显著改善。
进一步的，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵菜籽粕的具体方法为：玉米面、麦麸和菜籽粕质量比例1：1：7-9，发酵的条件是：发酵温度33-38℃，种子液添加量4.06×106cfu/g，料水比1:0.7-1.0，发酵时间3-4d，发酵后菜籽粕粗蛋白含量大幅提升，粗纤维含量大幅降低，饲料营养价值显著改善。
有益效果：
本发明的有益效果体现在：
本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11可分泌高活性纤维降解酶，能够针对全棉籽、菜籽粕、棉籽粕等纤维含量较高的蛋白饲料营养特点，发酵后降低饲料中的纤维含量，同时大幅提升蛋白质含量，降低抗营养因子含量，提升营养品质。克服现有提升饲料蛋白的饲用发酵菌株对高纤维蛋白饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高杂粕、副产物类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例所述的解淀粉芽孢杆菌T11的菌落形态图；
图2是本发明实施例所述的解淀粉芽孢杆菌T11系统发育树；
图3是本发明实施例所述的解淀粉芽孢杆菌T11生长曲线图；
图4是本发明实施例所述的未发酵对照组全棉籽结构扫描电镜图；
图5是本发明实施例所述的解淀粉芽孢杆菌T11发酵后全棉籽结构扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：菌株分离
本实施例提供从土壤中分离一种降解纤维、提升蛋白的解淀粉芽孢杆菌T11菌株，分离方法包括如下步骤：
(1)采集竹林、灌木和树根处10cm以下腐殖土，混合均匀，装入灭菌袋，冷藏备用；
(2)称取5g步骤(1)得到的土壤置于含45mL无菌水的100mL的三角烧瓶中，以180r/min震荡30min后静置。取2mL土壤上清置于含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养2d。
(3)将步骤(2)得到的菌液培养液进行梯度稀释至10-7倍，每个梯度取30μL涂布到筛选培养基中，39℃倒置培养2d；
(4)根据平板上不同形态的菌落，排除具有明显菌丝特征的真菌菌落，并挑取单个菌落于鉴别培养基中划线，重复几次，不断纯化，获得单菌为止；
(5)将步骤(4)得到的单菌划线在鉴别培养基上培养5天，用0.1％刚果红染液染色1h后用1mol/L氯化钠溶液脱色1h后，挑取透明圈较大的菌落多次划线纯化后点种于鉴别培养基上再次刚果红染色，记录水解透明圈直径d1和单菌菌落直径d2，计算d1/d2的比值，得到纤维素相对降解活性，筛选活性较强的单菌。
(6)将步骤(5)筛选得到的单菌接种于不加琼脂的鉴别培养基中，120r/min振荡培养2d，菌液10mL加入到含5条滤纸条(1*6cm)和100mL滤纸条崩解培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养7d，重复三次，以未接菌的培养基作为空白对照。培养结束后对滤纸条崩解情况观察并记录，选取滤纸条崩解效果明显的菌株用于酶活的测定。
(7)将步骤(6)得到的单菌测定滤纸酶活性(FPase)和羧甲基纤维素酶活(CMCase)，选取活性最强的单菌，得到所述解淀粉芽孢杆菌T11菌株。
实施例2：菌落形态及生理生化特性鉴定
对实施例1分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11进行菌落形态观察和生理生化特性鉴定，菌落形态见图1。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)T11于鉴别培养基上39℃培养2d，为白色圆形菌落，表面突起，边缘相对整齐，且菌落较大，易挑取。
对实施例1分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11进行生理生化特性鉴定实验，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11属革兰氏阳性菌，兼性厌氧，可以降解淀粉。
实施例3：分子生物学鉴定
对实施例1分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11进行16S rDNA分子生物学鉴定。提取单菌落培养物的基因组DNA作为模板，利用细菌16S通用引物27F/1492R进行PCR扩增，产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比较分析，并构建系统发育树，如图2所示。该序列在NCBI数据库中的比对分析结果显示，与Bacillus velezensis strainWU-3、Bacillussubtilis strainWU-13、Bacillus amyloliquefaciens strain BV2007基因相似性最高，因此，将其归为Bacillus amyloliquefaciens，命名为T11。
实施例4：生长曲线的测定
操作方法为：挑取一环菌株接种于含50mL LB培养基的250mL三角烧瓶中，于180r/min，39℃的震荡培养箱中进行培养。每2h取200μL的培养液测定OD600，以未接菌的空白培养基作为空白校准，重复三次，绘制生长曲线。结果见图3。
实施例5：全棉籽发酵
全棉籽发酵：20g发酵底物(玉米面：麦麸：全棉籽＝1：1：8(m/m)，干物质(DM)基础)，置于250mL三角烧瓶中，挑取一环解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T11接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养18小时后为发酵种子液。种子液的添加量为5.08×106cfu/g，共加入5mL种子液，添加7mL的无菌水，于33℃下发酵5d。对照组添加的是无菌的培养液，其他条件与发酵组相同。该菌株发酵后全棉籽粗蛋白质提高20.52％，粗纤维降低8.05％(表1)，游离棉酚脱毒率为56.45％，脱氧雪腐镰刀菌烯醇降低了23.08％(表2)，同时在电镜下可以观察全棉籽结构变得松散，说明该菌株可有效降解全棉籽纤维结构，如图4-图5所示。
由于全棉籽纤维含量较高，目前分别采用提升蛋白和发酵纤维的饲用菌种混合发酵，以达到克服全棉籽高纤维、提升蛋白含量的目的。而本发明菌种T11单菌发酵全棉籽后蛋白含量提升幅度是目前常用混菌发酵方式的近2倍，发酵效果明显优于混菌发酵方式，粗纤维降低率，游离棉酚FG降低率，脱氧雪腐镰刀菌烯醇降低率也明显优于目前适宜添加量和发酵条件下的常用混菌发酵(相对于本申请对照组)(表3)。
表1全棉籽发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
注：本发明所有对照组的发酵基质同发酵组，对照组未添加菌种子液，而是添加了相同量的培养基。
表2全棉籽发酵后游离棉酚和霉菌毒素的变化(干物质基础)
表3本发明菌株T11发酵全棉籽效果与其它混菌发酵效果比较(干物质基础)
实施例6：棉籽粕发酵
棉籽粕发酵：20g发酵底物(玉米面：麦麸：棉籽粕＝1：1：8(m/m)，干物质(DM)基础)，置于250mL三角烧瓶中。挑取一环Bacillus amyloliquefaciens strain T11接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养18小时后为发酵种子液。种子液的添加量为4.06×106cfu/g，共加入4mL种子液，添加12mL的无菌水，于36℃下发酵3d。对照组添加的是无菌的培养液，其他条件与发酵组相同。本发明菌株T11发酵棉籽粕后粗蛋白提高23.85％(表4)。枯草芽孢杆菌是目前广泛用于提升饲料蛋白质的饲用发酵菌，本发明菌株T11对发酵棉籽粕蛋白质含量提升幅度高于中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的枯草芽孢杆菌菌株(表5)。本发明菌种对棉籽粕蛋白质含量提升幅度远高于与其亲缘关系接近的枯草芽孢杆菌单菌在适宜添加量和条件下的发酵效果，与目前常用的真菌(酵母菌)与芽孢杆菌混菌发酵的效果差不多。
表4棉籽粕发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
表5本发明菌株T11发酵棉籽粕效果与中国工业微生物菌种保藏管理中心其他菌株比较
实施例7：菜籽粕发酵
菜籽粕发酵：20g发酵底物(玉米面：麦麸：菜籽粕＝1:1：8(m/m)，干物质(DM)基础)，置于250mL三角烧瓶中。挑取一环Bacillus amyloliquefaciens strain T11接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养18小时后为发酵种子液。种子液的添加量为4.06×106cfu/g，共加入4mL种子液，添加12mL的无菌水，于36℃下发酵3d。对照组添加的是无菌的培养液，其他条件与发酵组相同。经本发明菌株T11发酵后菜籽粕蛋白质提高18.24％，粗纤维CF降低率为9.32％(表6)。枯草芽孢杆菌是广泛用于提升饲料蛋白质的饲用发酵菌，本发明菌株T11对菜籽粕发酵蛋白质提升幅度高于其它2种常用枯草芽孢杆菌菌株单菌适宜条件下发酵，且高于目前芽孢杆菌等细菌与真菌(酵母菌)适宜条件下混合发酵菜籽粕的蛋白提升效果，本发明菌株T11对菜籽粕发酵粗纤维降低率高于其它2种常用枯草芽孢杆菌菌株单菌发酵，且高于目前芽孢杆菌等细菌与真菌(酵母菌)混合发酵菜籽粕的粗纤维降低效果(表7)。
表6菜籽粕发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
表7本发明菌株T11发酵菜籽粕效果与已报道的其他菌株比较
综上所述，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵低质蛋白饲料的方法，属于农业微生物领域，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens T11；保藏编号为CCTCCNO：M 20211450，该菌株可提高发酵低质蛋白饲料蛋白质含量，并分泌羧甲基纤维素酶和滤纸酶降解发酵饲料中纤维，羧甲基纤维素酶和滤纸酶的活力分别可达9.37U/g和9.21U/g底物，该菌株用于发酵全棉籽、棉籽粕和菜籽粕饲料等纤维含量较高的蛋白饲料，其粗蛋白含量大幅提升，粗纤维含量大幅降低，并且显著降低抗营养因子含量，饲料营养价值显著改善。本发明解决现有饲用发酵菌株对高纤维蛋白饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高杂粕、副产物类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
解淀粉芽孢杆菌T11的rDNA测序：
1tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa
61cacgtgggta acctgcctgt aagactgggataactccggg aaaccggggc taataccgga
121tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggcttcggctacca cttacagatg
181gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc
241cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag
301gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg
361atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag
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1201aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg
1261cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc
1321ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacat
1381ccgaagtcgg tgaggtaacc
以上所述，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已通过上述实施例揭示，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种解淀粉芽孢杆菌T11，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌T11的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens T11；保藏编号为CCTCCNO：M 20211450，保藏日为2021年11月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072。
2.如权利要求1中所述的一种解淀粉芽孢杆菌T11，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌T11分类学地位根据如下方法确定：
常规方法提取菌株T11的总DNA，用全长通用引物扩增其16SrDNA片段，然后将PCR产物进行基因测序，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比较分析，并构建系统发育树，比较分析，所述菌株T11属于芽孢杆菌属，将其命名为解淀粉芽孢杆菌T11。
3.如权利要求1中所述的一种解淀粉芽孢杆菌T11，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌T11分泌的纤维降解酶中羧甲基纤维素酶CMCase活力为9.37U/g，滤纸酶FPase的活力为9.21U/g。
4.一种如权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌T11在高纤维含量低质蛋白饲料固态发酵中的应用。
5.一种如权利要求4中所述的解淀粉芽孢杆菌T11在高纤维含量低质蛋白饲料固态发酵中的应用，其特征在于，所述高纤维含量低质蛋白饲料为全棉籽、菜籽粕和棉籽粕。
6.一种如权利要求5中所述的解淀粉芽孢杆菌T11在高纤维含量低质蛋白饲料固态发酵中的应用，其特征在于，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵全棉籽的具体方法为：玉米面、麦麸和全棉籽质量比例1：1：7-10，发酵的条件是：发酵温度30-36℃，种子液添加量5.08×106cfu/g，料水比1:0.5-0.7，发酵时间4-6d。
7.一种如权利要求5中所述的解淀粉芽孢杆菌T11在高纤维含量低质蛋白饲料固态发酵中的应用，其特征在于，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵棉籽粕的具体方法为：玉米面、麦麸和棉籽粕质量比例1：1：7-10，发酵的条件是：发酵温度33-38℃，种子液添加量4.06×106cfu/g，料水比1:0.7-1.0，发酵时间3-4d。
8.一种如权利要求5中所述的解淀粉芽孢杆菌T11在高纤维含量低质蛋白饲料固态发酵中的应用，其特征在于，所述利用解淀粉芽孢杆菌T11发酵菜籽粕的具体方法为：玉米面、麦麸和菜籽粕质量比例1：1：7-9，发酵的条件是：发酵温度33-38℃，种子液添加量4.06×106cfu/g，料水比1:0.7-1.0，发酵时间3-4d。
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