CN108728373A - 一种高效降解藜麦秸秆的复合菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的提供了一种高效降解藜麦秸秆的10种菌株的复合菌,互利共生协同增效,共同促进纤维素、半纤维素和木质素的降解。本发明的所提供一种高效降解藜麦秸秆的复合菌,对藜麦秸秆的腐熟时间5‑8天,比普通的堆肥发酵缩短了3‑4天。本发明的所提供一种高效降解藜麦秸秆的复合菌,能够在10℃的气温环境下降解藜麦秸秆,特别适合北方低温天气。
Description
技术领域
本发明涉及微生物降解领域,具体涉及一种高效降解藜麦秸秆的复合菌及应用。
背景技术
藜麦在海西的选育试种成功标志着为今后在全国范围内大规模种植提供了可靠的科学依据,对于海西调整种植结构、促进农民增收、改良盐碱土质具有十分重要的意义。藜麦的种植成功不仅是经济作物,还是改善生态环境、调整产业结构、促进农牧民增收的一种农作物。
用藜麦饲喂家畜从史前就已经开始了,利用部分包括藜麦的籽实和其收获、加工后的副产品,如麸皮、秸秆等。藜麦的主要产品是籽实,可用于饲喂家畜、提供蛋白质、改善饲料中的氨基酸平衡,而藜麦秸秆主要组分是纤维素、木质素、果胶、半纤维素、粗蛋白和灰分等,在常温下性质十分稳定,因此降解非常缓慢。环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点,应用微生物学方法腐解处理秸秆具有许多其他物理化学方法不可替代的优点,应用前景广阔,因此,从自然界筛选到具有高效秸秆降解能力的菌株十分重要,而目前采用的微生物对藜麦秸秆的降解和利用还不够充分。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种高效降解藜麦秸秆的复合菌。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
一种高效降解藜麦秸秆的复合菌,其特征在于,它由产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、酿酒酵母菌、乳酸菌、近平滑假丝酵母、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌组成,菌落形成单位之比为3:1:3:2:2:2:2:1:1:1,上述菌剂中:
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)CCTCC AA208050Laceyella;
所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1366;
所述乳酸菌(Lactobacillus algidus)CGMCC 1.3701;
所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 2.3207;
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.519;
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC 1.281;
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901,是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的,其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏日期是2017年7月5日,保藏号是CCTCC NO:M2017413。
一种高效降解藜麦秸秆的复合菌的制备方法,按如下步骤:
分别在相应培养基中接种上述按一定菌落单位比的不同菌落,于30℃摇床中200r/min,震荡培养2天,培养完毕后稀释形成菌液,使浓度为每毫升活菌个数为2亿个,按照复合菌的菌落单位形成比例制得混合菌液;
上述产纤维素酶类芽孢杆菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸菌培养基配方:酵母提取物2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、葡萄糖8.0g/L、K2HPO4 6.5g/L、NaNO3 3.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 2.0g/L、MgSO4 0.05g/L、pH 7.2;
上述酿酒酵母菌、近平滑假丝酵母菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木聚糖酶链格孢菌PDA培养基:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L。
上述复合菌在降解藜麦秸秆中的应用。
本发明具有如下的有益效果:
本发明10种菌株互利共生协同增效,共同促进纤维素、半纤维素和木质素的高效降解。而且,本发明复合菌能够高效地在10℃低温环境下降解藜麦秸秆,对藜麦秸秆的腐熟时间为5-8天,比普通的堆肥发酵缩短了3-4天;将本发明复合菌剂接种到藜麦秸秆发酵培养基中,150rpm振荡,3-6℃培养,藜麦秸秆失重率8天达到69.12%,木质纤维素中纤维素和半纤维素的含量明显降低,对纤维素降解率60.45%,对半纤维素的相对降解率为53.51%,木质素的降解率49.34%,特别适合北方低温天气。将本发明所述复合菌系培养至30代时,各代之间在10℃下对藜麦秸秆降解率无明显差别,具有显著的稳定性。
具体实施方式
以下是对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤,常规方法在PDA培养基上培养,菌株菌丝起初呈现白色絮状,向外周发散生长,菌落近似不规则圆形,在平板上生长5d后有分生孢子座出现,分生孢子最初呈现墨绿色,培养8d后,分生孢子颜色继续加深,并出现胶點团;培养10d后,菌落呈同心轮纹状,分生孢子胶點团呈现黑色,菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块,接种到苯胺蓝选择培养基上,于需氧培养箱中30℃条件下培养10d,观察苯胺蓝褪色情况,挑选褪色速率快,能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株,设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基,通过单一碳源的限定,测定木质素的去除率,选择在木质素培养基中涨势良好,且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法,用疣孢漆斑菌T2901制备孢子悬浊液。而后进行稀释,调整孢子浓度为107/mL,取10μL稀释好的菌悬液滴于ARTP的载片上,进行诱变,用ARTP诱变育种系统4mm射距照射,最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4%加入PDA培养基中)上,于需氧培养箱中30℃条件下培养10d,观察变色圈情况,挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50%,经多次传代培养,菌株T2901可稳定遗传。
(4)木质素降解效果
用多功能酶标仪测定各菌种发酵液木质素吸光度,再根据绘制出的木质素标准曲线来换算出培养液中木质素的含量,最后根据以下公式计算出菌株木质素降解率。计算公式如下所示:
木质素降解率=(C1-C2)/C1*100%
其中:C1是未添加菌液的木质素溶液的吸光度
C2是菌株降解后木质素溶液的吸光度
本研究中涉及的菌种采用固态发酵的形式进行玉米秸秆的固态发酵,以去除玉米秸秆中的木质素。经测定,在固态发酵过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶,其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为6.61U/g、0.78U/g和1.31U/g生物质。发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了42.30%,且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了123.94%,证明该菌对秸秆的降解提供了一种新途径。
实施例2高效降解藜麦秸秆的复合菌的制备
分别在相应培养基中接种不同菌落,于30℃摇床中200r/min,震荡培养2天,
培养完毕后稀释形成菌液,使浓度为每毫升活菌个数为2亿个,菌落形成单位之比见表1,
表1
菌种类 | 菌落形成单位比 |
产纤维素酶类芽孢杆菌 | 3 |
产木聚糖酶链格孢菌 | 1 |
产漆酶疣孢漆斑菌 | 3 |
产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌 | 2 |
产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌 | 2 |
酿酒酵母菌 | 2 |
乳酸菌 | 2 |
近平滑假丝酵母菌 | 1 |
地衣芽孢杆菌 | 1 |
解淀粉芽孢杆菌 | 1 |
产纤维素酶类芽孢杆菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸菌培养基配方:酵母提取物2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、葡萄糖8.0g/L、K2HPO4 6.5g/L、NaNO3 3.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 2.0g/L、MgSO40.05g/L、pH 7.2。
酿酒酵母菌、近平滑假丝酵母菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木聚糖酶链格孢菌PDA培养基:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L。
不同菌液分别按照表1的菌落形成单位之比例混合,制成复合菌剂。
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)CCTCCAA208050Laceyella;
所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1366;
所述乳酸菌(Lactobacillus algidus)CGMCC 1.3701;
所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 2.3207;
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.519;
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC 1.281;
所述产漆酶疣孢漆斑菌为上述T2901。
实施例3复合菌剂在藜麦秸秆上的应用
藜麦秸秆发酵培养基:在1L水中添加藜麦秸秆50g,并添加营养盐K2HPO4 6.5g/L、NaNO3 3.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl2.0g/L、MgSO4 0.05g/L、pH 7.2。
藜麦秸秆失重的测定:将1ml制备好的上述复合菌剂接种到藜麦秸秆发酵培养基中,另一份不加复合菌种作为对照,150rpm振荡,10℃培养,分别在第4天和第8天取样,用滤纸过滤发酵液,将残留物烘干称重,用减重法计算出麦秸失重率。
纤维素的分解率根据下式计算:(对照样品纤维素含量×样品重量-残体纤维素含量×残体重量)/(对照样品纤维素含量×样品重量)×100%,半纤维素和木质素的分解率的计算方法按照纤维素的计算方法进行。本发明复合菌对藜麦秸秆处理后,藜麦秸秆、纤维素、半纤维素和木质素的减重率见表2。
表2
时间/d | 藜麦秸秆% | 纤维素% | 半纤维素% | 木质素% |
4 | 27.56 | 33.22 | 34.41 | 21.42 |
8 | 69.12 | 60.45 | 53.51 | 49.34 |
结果表明,培养4d后,藜麦秸秆木质纤维素已经分解部分,藜麦秸秆失重率为27.56%,培养8d后,藜麦秸秆失重率显著增加,达到69.12%,木质纤维素中纤维素和半纤维素的含量明显降低,对纤维素降解率60.45%,对半纤维素的相对降解率为53.51%,木质素的降解率49.34%,平均分解时间为5-8天比普通的堆肥发酵缩短了3-4天,整个过程在10℃左右的低温环境下进行,解决了北方地区因气温过低导致藜麦秸秆腐熟困难的局面。
Claims (2)
1.一种高效降解藜麦秸秆的复合菌,其特征在于,它由产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、酿酒酵母菌、乳酸菌、近平滑假丝酵母、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌组成,菌落形成单位之比大约为3:1:3:2:2:2:2:1:1:1。
2.如权利要求1所述的复合菌,其特征在于:
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus) CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola )CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis )CCTCC AA 208050Laceyella;
所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 2.1366 ;
所述乳酸菌(Lactobacillus algidus)CGMCC 1.3701;
所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 2.3207;
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.519 ;
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC 1.281;
所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901,保藏号是CCTCC NO:M2017413。
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