CN108753640A - 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂 - Google Patents

一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂 Download PDF

Info

Publication number
CN108753640A
CN108753640A CN201810420833.1A CN201810420833A CN108753640A CN 108753640 A CN108753640 A CN 108753640A CN 201810420833 A CN201810420833 A CN 201810420833A CN 108753640 A CN108753640 A CN 108753640A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lignin
production
peroxidase
microbial inoculum
stalk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810420833.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108753640B (zh
Inventor
陈�光
孙旸
苏瑛杰
苟泽昌
于潇潇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Agricultural University
Original Assignee
Jilin Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Agricultural University filed Critical Jilin Agricultural University
Priority to CN201810420833.1A priority Critical patent/CN108753640B/zh
Publication of CN108753640A publication Critical patent/CN108753640A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108753640B publication Critical patent/CN108753640B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂菌群之间互利共生、协同增效，在发酵秸秆过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为23.56U/g、23.02U/g和21.74U/g生物质，发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了60.21%，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了142.14%。筛选到的复合菌株具有强木质素降解能力，经菌株预处理后的秸秆的工业化利用效率显著提升，本研究为秸秆中木质纤维素的酶解糖化提供了一种新的预处理途径。

Description

一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂
技术领域
本发明涉及一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，属于农业集约化生产技术，专用于降解废弃玉米秸秆生产有机肥料，实现有机废弃物的资源化利用。
背景技术
化学能源的短缺和日益严重的环境污染使得人们不断寻求可再生的绿色能源。木质纤维素作为一种碳中性的绿色能源因其具有丰富易得和成本低廉的优点而成为较好的绿色候选资源。基于糖平台的生物炼制技术是利用木质纤维素的有效途径。这一过程主要是将玉米秸秆、麦秆及其他木质纤维素资源转化为多糖，而后通过生物发酵的方式继续将多糖转化为其他生物基产品。其中，玉米秸秆年产量居高，但利用率尚有待提高。酶法水解可有效地将玉米秸秆中的纤维素转化为多糖。但是木质素和半纤维素以共价键形式结合将纤维素包裹其中，形成一种天然的屏障阻碍纤维素酶与纤维素分子的接触，因此限制了纤维素的分解。
预处理可破坏木质素的结构，提高纤维素酶与纤维素结合，从而提高生物质的利用效率。物理、化学、生物方法均可使木质素降解。物理和化学方法可使木质含量降低约50%，然而这两种方法的成本较高，且会带来二次污染。微生物方法以其操作简单，成本低廉且对环境安全有好的特点成为研究的热点，但很多微生物只能分泌降解木质素的少数酶或者酶活性不高，导致木质素降解率较低，并且较少保留纤维素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，上述菌剂中：
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）GIM1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis ）CCTCC AA 208050Laceyella；
本发明所述菌种均可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）和广东省微生物保藏中心（GIM）购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为（Myrotheciumverrucaria）突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期是 2017 年 7月5 日，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂的制备方法，按如下步骤：
将上述菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个 / 克。活化的培养基为PDA培养基：马铃薯 200 g/L ，葡萄糖 20 g/L，琼脂 15 g/L；将菌液按照以下质量比混合：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，进行充分混合获得复合菌剂。
上述复合菌剂在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明的所提供一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂菌群之间互利共生、协同增效，在发酵秸秆过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为23.56U/g、23.02U/g 和21.74U/g生物质，发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了60.21%，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了142.14%。筛选到的复合菌株具有强木质素降解能力，经菌株预处理后的秸秆的工业化利用效率显著提升，本研究为秸秆中木质纤维素的酶解糖化提供了一种新的预处理途径。
具体实施方式
实施例 1 疣孢漆斑菌的诱变筛选
（1）形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5 d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10 d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
（2）菌株的 ITS 序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
（3）菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变（ARTP）法，用疣孢漆斑菌T2901制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10µL稀释好的菌悬液滴于ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基（愈创木酚浓度为0.4%加入PDA培养基中）上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50%，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
实施例2 复合菌剂的制备
一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，该菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，上述菌剂中：
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）GIM1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis ）CCTCC AA 208050Laceyella；本发明所述菌种均可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）和广东省微生物保藏中心（GIM）购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901（Myrothecium verrucaria）突变菌株T2901，保藏号是CCTCC NO:M2017413；
将上述菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个 / 克。活化的培养基为PDA培养基：马铃薯 200 g/L ，葡萄糖 20 g/L，琼脂 15 g/L。
将菌液按照以下质量比混合：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，进行充分混合获得复合菌剂。
实施例3 秸秆的降解
采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对普通玉米秸秆的降解效果。每个300mL 三角瓶
分装烘干的、剪碎至 0.5cm 宽、1-2 cm 长的秸秆5g，(NH4 ) 2SO4 0.2g，MgSO 4·7H 2O0.05g，每瓶加5mM pH 7.0 的磷酸缓冲液15mL。各瓶接种 0.25mL 2.0×108个 /mL 浓度的复合菌剂悬液，同时在对照组取等量的无菌水，混匀后置于 20 ℃恒温培养。定期观察烟秆的形态变化，7 天后洗去测定其玉米秸秆的木质素的降解率。
木质素标准曲线的绘制：配制10g/L的木质素溶液，进行扫描并选择测定波长。然后再通过稀释制备浓度为 10、30、50、70、90mg/L 的木质素溶液。在选定的波长下测定各浓度木质素的吸光度，然后根据木质素与吸光度关系，绘制标准曲线图。
木质素去除率的计算：用多功能酶标仪测定各菌种发酵液木质素吸光度，再根据绘制出的木质素标准曲线计算培养液中木质素的含量，最后根据以下公式计算出菌株碱木质素降解率。计算公式如下所示：
木质素降解率=（C1-C2）/C1*100%
其中：C1是未添加菌液的木质素溶液的含量
C2是菌株降解后木质素溶液的含量
本研究中涉及的复合菌采用液体发酵的形式进行玉米秸秆的固态发酵，以去除秸秆中的木质素。经测定在发酵过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为23.56U/g、23.02U/g 和21.74U/g生物质。发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了60.21%，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了142.14%。实验结果表明，筛选到的复合菌株具有强木质素降解能力，经菌株预处理后的秸秆的工业化利用效率显著提升。本研究为秸秆中木质纤维素的酶解糖化提供了一种新的预处理途径。

Claims (2)

1.一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%。
2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于：
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）GIM1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis ）CCTCC AA 208050Laceyella；
所述产漆酶疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）为突变菌株T2901，保藏号是CCTCCNO:M2017413。
CN201810420833.1A 2018-05-04 2018-05-04 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂 Active CN108753640B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810420833.1A CN108753640B (zh) 2018-05-04 2018-05-04 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810420833.1A CN108753640B (zh) 2018-05-04 2018-05-04 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108753640A true CN108753640A (zh) 2018-11-06
CN108753640B CN108753640B (zh) 2020-06-23

Family

ID=64009812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810420833.1A Active CN108753640B (zh) 2018-05-04 2018-05-04 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753640B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797119A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 大连大学 一种降解秸秆纤维素的复合菌剂
CN109805176A (zh) * 2019-02-27 2019-05-28 吉林农业大学 一种玉米秸秆黄贮饲料的制备方法
CN110835610A (zh) * 2018-08-17 2020-02-25 吉林农业大学 一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法
CN111733087A (zh) * 2020-08-11 2020-10-02 山东省科学院生物研究所 一株产漆酶的露湿漆斑菌及其应用
CN111909968A (zh) * 2020-05-18 2020-11-10 南阳师范学院 基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法
CN112210574A (zh) * 2019-07-12 2021-01-12 中石化石油工程技术服务有限公司 一种酶解木质素、精制酶解木质素、木质素-酚醛树脂降滤失剂的制备方法及应用
CN114806890A (zh) * 2022-04-26 2022-07-29 湖南农业大学 辣椒秸秆木质素降解菌剂组合及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104711236A (zh) * 2015-03-11 2015-06-17 湖南大学 木质素降解酶调控剂及其应用
CN105420140A (zh) * 2015-09-17 2016-03-23 河北农业大学 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN106434386A (zh) * 2016-11-24 2017-02-22 郑州大学 用于降解秸秆的微生物、菌剂及其制备方法和应用
CN107828667A (zh) * 2017-11-27 2018-03-23 吉林农业大学 一种疣孢漆斑菌突变株t2901及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104711236A (zh) * 2015-03-11 2015-06-17 湖南大学 木质素降解酶调控剂及其应用
CN105420140A (zh) * 2015-09-17 2016-03-23 河北农业大学 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN106434386A (zh) * 2016-11-24 2017-02-22 郑州大学 用于降解秸秆的微生物、菌剂及其制备方法和应用
CN107828667A (zh) * 2017-11-27 2018-03-23 吉林农业大学 一种疣孢漆斑菌突变株t2901及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIMOTHY DH BUGG ETC.: "The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation", 《CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY》 *
李红亚等: "解淀粉芽孢杆菌 MN-8 对玉米秸秆木质纤维素的降解", 《应用生态学报》 *
邓辉等: "堆肥过程放线菌演替及其木质纤维素降解研究进展", 《应用与环境生物学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110835610A (zh) * 2018-08-17 2020-02-25 吉林农业大学 一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法
CN110835610B (zh) * 2018-08-17 2022-08-26 吉林农业大学 一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法
CN109805176A (zh) * 2019-02-27 2019-05-28 吉林农业大学 一种玉米秸秆黄贮饲料的制备方法
CN109797119A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 大连大学 一种降解秸秆纤维素的复合菌剂
CN112210574A (zh) * 2019-07-12 2021-01-12 中石化石油工程技术服务有限公司 一种酶解木质素、精制酶解木质素、木质素-酚醛树脂降滤失剂的制备方法及应用
CN111909968A (zh) * 2020-05-18 2020-11-10 南阳师范学院 基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法
CN111733087A (zh) * 2020-08-11 2020-10-02 山东省科学院生物研究所 一株产漆酶的露湿漆斑菌及其应用
CN111733087B (zh) * 2020-08-11 2021-11-09 山东省科学院生物研究所 一株产漆酶的露湿漆斑菌及其应用
CN114806890A (zh) * 2022-04-26 2022-07-29 湖南农业大学 辣椒秸秆木质素降解菌剂组合及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108753640B (zh) 2020-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753640A (zh) 一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂
CN107828667A (zh) 一种疣孢漆斑菌突变株t2901及其应用
CN101555461B (zh) 一株产碱性纤维素酶菌株lt3及其选育方法和产酶条件初步优化
Kamsani et al. Production of lignocellulolytic enzymes by microorganisms isolated from Bulbitermes sp. termite gut in solid-state fermentation
Intasit et al. Synergistic production of highly active enzymatic cocktails from lignocellulosic palm wastes by sequential solid state-submerged fermentation and co-cultivation of different filamentous fungi
Han et al. Solid-state fermentation on poplar sawdust and corncob wastes for lignocellulolytic enzymes by different Pleurotus ostreatus strains
CN108728373B (zh) 一种高效降解藜麦秸秆的复合菌及应用
Yao et al. Phanerochaete chrysosporium pretreatment of biomass to enhance solvent production in subsequent bacterial solid-substrate cultivation
CN110331109A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
CN114381378B (zh) 降解木质素的产黄青霉及其应用
Liu et al. Evaluation of various fungal pretreatment of switchgrass for enhanced saccharification and simultaneous enzyme production
CN114672469B (zh) 一种犏牛瘤胃自然共培养物发酵粗饲料生产漆酶的方法
Shariq et al. Production of cellulase and xylanase from Candida tropicalis (MK-118) on purified and crude substrates
CN113652379B (zh) 一种芽孢杆菌胞壁解聚giec及其应用
Shokrkar et al. Exploring strategies for the use of mixed microalgae in cellulase production and its application for bioethanol production
JP6202716B2 (ja) バイオマスの糖化方法
CN112593437A (zh) 一种木质素的生物降解方法
CN112725314A (zh) 一种自然共生的混合培养物发酵粗饲料生产内切葡聚糖酶的方法
Garcia-Kirchner et al. Mixed submerged fermentation with two filamentous fungi for cellulolytic and xylanolytic enzyme production
CN114317381B (zh) 一种t级微生物复合菌剂及其制备方法与应用
WO2011049205A1 (ja) 非滅菌発酵による乳酸製造方法
Kumar et al. Cellulolytic enzymes production from submerged fermentation of different substrates by newly isolated Bacillus spp. FME
Chimtong et al. Symbiotic Behavior during Co-culturing of Clostridium thermocellum NKP-2 and Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum NOI-1 on Corn Hull
CN110835610B (zh) 一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法
CN108424896A (zh) 一种混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant