CN104711236A - 木质素降解酶调控剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木质素降解酶调控剂及其应用，好氧堆肥过程中分两步加木质素降解酶调控剂，木质素降解酶调控剂包括锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂、漆酶调控剂，其中锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂包括吐温80、双氧水和微量激励元素混合液A；漆酶调控剂包括吐温80、l，2二甲氧基苯和微量激励元素液B。这种木质素降解酶调控剂可用于调控真菌中木质素降解酶的分泌，具有促进效果好，技术简单、经济、实用等优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种木质素降解酶调控剂及其应用。
背景技术
木质素主要是农业、木材水解工业和造纸工业的副产物，也存在于城市有机固体废物中。由于产生量大且得不到充分利用，变成了环境污染物，而其它领域产生的大量木质素也在各个层次不同程度地污染了环境。木质素属于苯丙烷类聚合物结构，是十分复杂和稳定的化学结构，不易降解，通常只有改变木质素的这种稳定结构才能对其进行广泛的降解和利用。同时，木质素也是好氧堆肥过程中的主要和关键的难降解有机物，其降解是通过微生物胞外氧化酶和一些非特定的酶进行氧化反应—催化木质素的解聚过程，这种木质素非特性的氧化过程被称为“酶的燃烧”。大量的研究已证明能有效分泌木质素降解酶系的微生物主要是真菌如白腐菌、青霉菌等，它们分泌木质素降解酶氧化断裂木质素的化学键可有效降解木质素，而在这个过程中真菌分泌的木质素降解酶是关键，与木质素降解有关的降解酶以木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)为主，另外还有其他一些辅助酶的作用。它们对木质素有高度的催化降解能力，同时也对特殊有害化学物质(包括杀虫剂、农药、聚苯乙烯(PCBs)、多环芳烃化工材料(PAHs)、合成染料和木材防腐剂)等分解力很强，因此具有重要的研究和应用价值。
白腐真菌能够分泌这些胞外氧化酶，使木质素发生降解，被认为是主要的木质素降解微生物。但不同的白腐真菌分泌木质素降解酶的种类和量不同，同时这些酶能受不同诱导物诱导产生，不同诱导物(也称激励元素或物质)刺激真菌产生不同的木质素降解酶等等。因此，根据多年的研究发现，在好氧堆肥过程中木质素降解酶的产生和调控是决定木质素降解酶的关键，而对木质素降解酶的诱导及外源调控是提高木质素降解效率和加快好氧堆肥速度、缩短堆肥时间或者说是改进好氧堆肥工艺技术的关键。事实上，目前关于木质素降解的外源调控诱导物质和调控机理的研究日益受到关注，特别是发现一种能有效诱导真菌产木质素降解酶的诱导物及诱导调控技术显得非常重要。
目前，发现诱导激励物众多，特别是金属和非金属诱导物，对金属诱导物的研究发现Mn、Mo、Cu、Co、Cd、Hg、Fe、Al等金属离子对木质素降解酶有很大影响，非金属诱导物主要是氧、木质纤维素、黎芦基醇、百草枯、p-香豆酸、二羟基苯甲酸和愈创木酚等芳香化合物，但所有的研究都是针对单一或少数几种金属或非金属混合物来诱导木质素降解酶的，其效果有一定的局限性和单一性，因此，研究诱导物混合体系协调诱导是未来的发展方向和前景，也是目前的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有促进木质素降解酶分泌的木质素降解酶调控剂，还提供了一种技术简单、经济、实用的调控木质素降解酶分泌的应用技术。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种木质素降解酶调控剂，包括锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂、漆酶调控剂，锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂包括吐温80、双氧水和微量激励元素混合液A；漆酶调控剂包括吐温80、l，2二甲氧基苯和微量激励元素液B。
上述的木质素降解酶调控剂，优选的，所述微量激励元素混合液A包括浓度为2.4～6.0×10-3g/L的MnSO4和0.1～1.0×10-2g/L FeSO4；所述微量激励元素液B为0.8～8.0×10-4g/L的CuSO4溶液。
上述的木质素降解酶调控剂，优选的，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂以醋酸缓冲液为溶剂，所述吐温80的含量为0.032wt％～0.094wt％；所述双氧水的含量为0.2wt％～0.7wt％；所述微量激励元素混合液A的含量为5wt％～10wt％；余量为醋酸缓冲液。
上述的木质素降解酶调控剂，优选的，所述漆酶调控剂以酒石酸缓冲液为溶剂，所述吐温80的含量为0.032wt％～0.094wt％；所述l，2二甲氧基苯的含量为0.5wt％～1.0wt％；所述微量激励元素液B的含量为5wt％～10wt％；余量为酒石酸缓冲液。
上述的木质素降解酶调控剂，优选的，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂的pH在4.5～5.5，所述漆酶调控剂的pH为5.0～6.0。
上述的木质素降解酶调控剂，优选的，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂中还包括1.0g/L的葡萄糖、1.47×10-2mol/L的KH2PO4、2.03×10-3mol/L的MgSO4、6.8×10-4mol/L的CaCl2、0.19g/L的ZnSO4、0.01g/L的H2BO3、1.0g/L的NaCl。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述木质素降解酶调控剂在调控真菌中木质素降解酶分泌中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用方法具体包括以下步骤：
(1)将真菌接种于驯化发酵培养基中进行驯化培养8天；
(2)将驯化后的真菌接种到发酵培养基中，在发酵培养基中加入锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂，以30～40℃发酵；
(3)在发酵开始10天后，再加入漆酶调控剂，继续发酵30天。优选的，所述真菌为黄孢原毛平革菌。
上述的应用，优选的，所述步骤(1)中所述驯化发酵培养基通过将液体菌剂加入到稻草粉中，以25℃恒温静置培养15天后，放入干燥箱中105℃烘干、研碎制备得到。优选的，所述液体菌剂为黄孢原毛平革菌菌液。
上述的应用，优选的，所述步骤(2)中所述发酵培养基为木质素原料，含水率为60～85％。
上述的应用，优选的，所述木质素原料为锯木厂木屑、稻草秸秆、小麦秸秆、庭院有机植物固体废弃物。优选的，所述庭院有机植物固体废弃物为树叶、树皮和枯枝。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种木质素降解酶调控剂，利用锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂、漆酶调控剂的协同作用，诱导激励白腐真菌菌株产漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶并提高其酶活并用于好氧堆肥过程。经过本发明的研究结果表明，好氧堆肥发酵过程中不仅有这三种酶产生，而且木质素过氧化物酶酶活和漆酶酶活与未添加组合诱导物体系相比提高极大，锰过氧化物酶酶活也提高很多，对在好氧堆肥过程中各种有机固体废物中木质素的降解效率也大大提高。很适合应用于大规模的环保工业和生物化工工业中锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶的生产。
(2)本发明提供了一种木质素降解酶调控剂，其中锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂对锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶有很好的诱导激励作用，对木质素中的非酚型芳香烃聚合物(占木质素中主要成分)有非常好的降解效果，在好氧堆肥过程中能有效启动木质素降解反应并先期降解木质素中非酚型芳香聚合物。
(3)本发明提供了一种木质素降解酶调控剂，其中漆酶调控剂对漆酶有很好的诱导激励作用，有效的降解木质素中剩余的酚型芳香聚合成分。
(4)本发明提供了一种木质素降解酶调控剂在调控真菌中木质素降解酶分泌中的应用，具有对提高好氧堆肥过程中三种木质素的分泌和活性更优的特点，具体对锰过氧化物酶增加活性1.27倍、木质素过氧化物酶5.24倍和漆酶3.61倍。另外，能提高好氧堆肥过程中各种原料中木质素的降解率0.47～0.93倍。
(5)本发明提供了一种木质素降解酶调控剂在调控真菌中木质素降解酶分泌中的应用，不仅可用于环保工业中的有机固废好氧堆肥生产，还可广泛用于生物化工或食品工业中的好氧发酵生产。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中采用的真菌为白腐真菌属黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)，购买于武汉保藏中心，保藏编号为BKMF-1767。
实施例1
本发明的一种木质素降解酶调控剂，包括锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂(H-1)、漆酶调控剂(H-2)。
其中H-1的制备方法为：
将葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4、H2BO3、NaCl、吐温80、浓度为10mmol/L的双氧水、微量激励元素混合液A(微量激励元素混合液A包括5×10-3g/L的MnSO4和0.6×10-2g/L FeSO4)进行混合，用醋酸缓冲液定容至100ml得到H-1调控剂，H-1调控剂pH为5(pH为4.5～5.5均可实施)。
H-1调控剂中，葡萄糖的浓度为1.0g/L、KH2PO4的浓度为1.47×10-2mol/L、MgSO4的浓度为2.03×10-3mol/L、CaCl2的浓度为6.8×10-4mol/L、ZnSO4的浓度为0.19g/L、H2BO3的浓度为0.01g/L、NaCl的浓度为1.0g/L，吐温80在H-1调控剂中的质量百分含量为0.06％、双氧水在H-1调控剂中的质量百分含量为0.4％、微量激励元素混合液A的质量百分含量为8％。
本发明的H-1调控剂，吐温80的质量百分含量为0.032～0.094％、双氧水的质量百分含量为0.2～0.7％、微量元素混合液A的质量百分含量为5～10％均可实施。
微量激励元素混合液A中，MnSO4的浓度可以在2.4～6×10-3g/L之间均可实施；FeSO4的浓度可以在0.1～1×10-2g/L之间均可实施。
H-2的制备方法为：
将吐温80、l，2二甲氧基苯、5～10ml的微量激励元素液B(本实施例采用的微量激励元素液B为浓度5×10-4g/L的的CuSO4溶液)进行混合，用浓度为10mmol/L酒石酸作为缓冲液定容至100ml得到H-2调控剂，H-2调控剂pH为5.0(pH为5.0～6.0均可实施)。
H-2调控剂中，吐温80的质量百分含量为0.06％；l，2二甲氧基苯的质量百分含量为0.75％、微量激励元素液B的质量百分含量为8％。
本发明的H-2调控剂，吐温80的质量百分含量为0.032～0.094％、1，2二甲氧基苯的质量百分含量为0.5～1.0％、微量激励元素液B的质量百分含量为5～10％均可实施。
微量激励元素液B中，CuSO4溶液可以在0.8～8×10-4g/L之间均可实施。
实施例2
本发明实施例1的木质素降解酶调控剂在调控真菌中木质素降解酶分泌中的应用，具体的应用方法包括以下步骤：
(1)培养黄孢原毛平革菌：
1.1、挑取黄孢原毛平革菌，先在斜面培养基中培养5～7天。其中斜面培养基采用马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)。PDA培养基的配方为：1000ml马铃薯煮汁，20g蔗糖，20g琼脂，调节pH为5.0，在120℃灭菌20min。
1.2、将斜面培养基上的菌种接种于PDA固体平板培养基(PDA固体平板培养基的配方与步骤1.1的PDA培养基配方相同)，待PDA固体培养基上的菌体长满平板时用打孔器打下4片9mm2大小的菌片，放入PDA液体培养基中(PDA液体培养基的配方为：1000ml马铃薯煮汁、20g蔗糖，调节pH为5.0)，于30℃、150r/min下培养7天，直至菌体长满PDA液体培养基表面。
(2)驯化培养：
2.1、将PDA液体培养基中的菌丝体取出，放置于100ml无菌水中，搅拌，然后进行孢子计数，得到黄孢原毛平革菌菌液，黄孢原毛平革菌菌液的浓度(以孢子计)为1.0×106个/mL。
2.2、将黄孢原毛平革菌菌液按照接种量为20v/v％接入到250ml三角瓶中，在三角瓶中装100ml无菌水，搅拌混合得到混合溶液。
2.3、准确称取2g稻草粉，过0.25mm(60目)筛，经苯醇抽提后，放入250ml三角瓶中，加入5ml浓度为0.1％的氯化钠无机盐水使其充分湿润，并于120℃下灭菌20min制成稻草粉培养基。用灭菌的医用注射器吸取10ml步骤2.1制备得到的黄孢原毛平革菌菌液加至稻草粉培养基中，以25℃恒温静置培养15天后，放入干燥箱中105℃烘干、研碎得到驯化发酵培养基。
2.4、将步骤2.2制备得到的混合溶液按照2.5v/v％的接种量接种于驯化发酵培养基中，以40℃、150r/min培养8天。
(3)将经过步骤(2)驯化后的黄孢原毛平革菌以0.8v/v％接种到发酵培养基(发酵培养基为含木质素原料，如锯木厂木屑、稻草秸秆、小麦秸秆、庭院有机植物固体废弃物；纯的含木质素原料占固体物总含量70％，发酵基质的含水率为60～85％)中，在发酵培养基中加入8ml的锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂，在40℃发酵。
(4)在发酵开始10天后，在发酵培养基中加入8ml的漆酶调控剂，继续发酵30天。
在实施例2的应用过程中，锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂的加入量为5～10ml均可实施，并达到相同或相似的技术效果。同理，漆酶调控剂的加入量为5～10ml均可实施。
对比例1
按照实施例2的方法培养黄孢原毛平革菌，在发酵过程中不加入木质素降解酶调控剂。
分别考察实施例2和对比例1的发酵液中，漆酶(Lac)、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)的酶活。其中木质素过氧化物酶的酶活检测采用Tien&Kirk方法(1988)，定义每一分钟氧化1μmol黎芦醇成黎芦醛所需的酶量为一个酶活力单位。锰过氧化物酶采用Paszczynski(1988)方法，定义每一分钟氧化μmol Mn2+为Mn3+所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活测定方法是在420nm处测ABTS被氧化的吸光度变化；反应体系包括0.5ml浓度为1.0mmol/L的ABTS、2.0mL浓度为100mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝5.0)和0.5mL漆酶粗酶液。定义每一分钟转化1μmol的ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。表1为黄孢原毛平革菌中三种木质素降解酶的酶活检测情况。
表1：三种木质素降解酶增加情况
从表1中可知：采用了实施例1的木质素降解酶调控剂及应用方法，黄孢原毛平革菌中木质素降解酶的活性显著提高了。
实施例3
(1)按照实施例2的方法对黄孢原毛平革菌进行驯化培养：
(2)将驯化后的黄孢原毛平革菌以2.5v/v％的接种量分别接种至以下发酵培养基中：
发酵培养基1：锯木厂木屑(纯锯木厂木屑的质量占固体物总含量的70％)，发酵基质的含水率为85％。
发酵培养基2：稻草秸秆(纯稻草秸秆的质量占固体物总含量70％)，发酵基质的含水率为85％。
发酵培养基3：小麦秸秆(纯小麦秸秆的质量占固体物总含量70％)，发酵基质的含水率为85％。
发酵培养基4：庭院有机植物固体废弃物(纯庭院有机植物固体废弃物的质量占固体物总含量70％)，发酵基质的含水率为85％。(本实施例中庭院有机植物固体废弃物的成分主要是树叶、树皮和枯枝等。
(3)分别在上述发酵培养基中加入8ml的锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂，在40℃发酵。
(4)在发酵开始10天后，在发酵培养基中加入8ml的漆酶调控剂，继续发酵30天。
在实施例3的应用过程中，锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂的加入量为8ml均可实施，并达到相同或相似的技术效果。同理，漆酶调控剂的加入量为8ml均可实施。
对比例2
按照实施例3的方法培养黄孢原毛平革菌，在发酵过程中不加入木质素降解酶调控剂及分布分阶段加入方法。
分别考察实施例3和对比例2的发酵液中，各原料中木质素酶的降解情况。
表2：各种堆肥原料中木质素降解情况
从表2中可知，在利用含不同木质素含量的四种有机降解原料进行堆肥实验中，我们得到了不同木质素降解效果，其中庭院有机植物固体废弃物在实施例3中所述木质素降解酶调控剂及应用方法后木质素降解效果有很大提高，增长了0.93倍，其它几种有机固体废物的降解效果也在实施例3中所述木质素降解酶调控剂及应用方法后显著提高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (10)
1.一种木质素降解酶调控剂，其特征在于，包括锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂、漆酶调控剂，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂包括吐温80、双氧水和微量激励元素混合液A；所述漆酶调控剂包括吐温80、1，2二甲氧基苯和微量激励元素液B。
2.根据权利要求1所述的木质素降解酶调控剂，其特征在于，所述微量激励元素混合液A包括浓度为2.4～6.0×10-3g/L的MnSO4和0.1～1.0×10-2g/L的FeSO4；所述微量激励元素液B为0.8～8.0×10-4g/L的CuSO4溶液。
3.根据权利要求1所述的木质素降解酶调控剂，其特征在于，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂以醋酸缓冲液为溶剂，所述吐温80的含量为0.032wt％～0.094wt％；所述双氧水的含量为0.2wt％～0.7wt％；所述微量激励元素混合液A的含量为5wt％～10wt％；余量为醋酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的木质素降解酶调控剂，其特征在于，所述漆酶调控剂以酒石酸缓冲液为溶剂，所述吐温80的含量为0.032wt％～0.094wt％；所述1，2二甲氧基苯的含量为0.5wt％～1.0wt％；所述微量激励元素液B的含量为5wt％～10wt％；余量为酒石酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的木质素降解酶调控剂，其特征在于，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂的pH为4.5～5.5，所述漆酶调控剂的pH为5.0～6.0。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的木质素降解酶调控剂，其特征在于，所述锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂中还包括1.0g/L的葡萄糖、1.47×10-2mol/L的KH2PO4、2.03×10-3mol/L的MgSO4、6.8×10-4mol/L的CaCl2、0.19g/L的ZnSO4、0.01g/L的H2BO3、1.0g/L的NaCl。
7.一种权利要求1至6中任一项所述木质素降解酶调控剂在调控真菌中木质素降解酶分泌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方法具体包括以下步骤：
(1)将真菌接种于驯化发酵培养基中进行驯化培养8天；
(2)将驯化后的真菌接种到发酵培养基中，在发酵培养基中加入锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的调控剂，以30～40℃发酵；
(3)在发酵开始10天后，再加入漆酶调控剂，继续发酵30天。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中所述驯化发酵培养基通过将液体菌剂加入到稻草粉中，以25℃恒温静置培养15天后，放入干燥箱中105℃烘干、研碎制备得到。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中所述发酵培养基为木质素原料，含水率为60～85％。
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