CN114292777A - 一株纤维素降解细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株纤维素降解细菌及其应用，涉及一株纤维素降解微生物及其应用。本发明纤维素降解细菌为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF‑10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23720。以及上述纤维素降解细菌在纤维素生物降解中的用途。本发明菌株可在羧甲基纤维素钠为唯一碳源CMC平板上生长，且经刚果红染色后菌落周围出现明显的纤维素分解透明圈；能分泌四种纤维素酶，包括滤纸酶、内切‑β‑1,4‑葡聚糖酶、外切‑β‑1,4‑葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶；具有降解天然纤维素的能力。
Description
技术领域
本发明涉及一株纤维素降解微生物及其应用。
背景技术
我国是农业大国，农业废弃物产量丰富，尤其是玉米秸秆。据统计，2014～2018年我国秸秆年均产量约为65386.6万吨，其中玉米秸秆占总秸秆量的45％左右。玉米秸秆中含有多种营养元素，包括C、N、P、K以及微量元素等，是重要的生物质资源。
玉米秸秆主要成分为木质纤维素，是一种丰富的可再生资源，可以转化为多种生物能源和化学产品。秸秆还田是当前黑土地保护合理用的主要措施，关键技术要求秸秆能够在土壤中有效的降解并转化为土壤有机质。如何实现秸秆在农业生产中的有效快速降解，一直是生产中的难题，也是需要攻克的技术关键。寻找到可高效降解秸秆木质纤维素的菌株，并开发成菌剂及生物产品，加快秸秆降解对黑土地农业生产具有重要意义。选择微生物对木质纤维素进行降解，已成为近年来纤维素降解和利用的重要手段和研究热点。
纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉与黑曲霉等；然而，由于真菌繁殖速度相比于细菌来说较慢，短时间内降解秸秆效率低，因此寻找一种高效纤维素降解细菌对于提高秸秆降解效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效纤维素降解能力的细菌，以及该菌株在纤维素降解中的用途。
本发明纤维素降解细菌为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23720。
上述纤维素降解细菌在纤维素生物降解中的用途。
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)是一种革兰氏阳性菌，现有的报道主要用于生产尼可霉素抗生素；未见圈卷产色链霉菌属在纤维素降解中的应用。
将秸秆分别加入液体或固体培养基，121℃灭菌20min；然后接种5ml含菌量为1×107CFU/mL的圈卷产色链霉菌液，分别于30℃、180rpm条件下摇床培养7d和30℃条件下静置培养15d，即可实现对秸秆的降解。
本发明圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10可在羧甲基纤维素钠为唯一碳源CMC平板上生长，且经刚果红染色后菌落周围出现明显的纤维素分解透明圈。采用DNS法检测，本发明圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在30℃条件下培养可能分泌四种纤维素酶，包括滤纸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶；具有降解天然纤维素的能力。
本发明圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在LB培养基上单菌落扁平、圆形或近圆形，表面干燥；正面为白色，背面呈暗褐色，孢子呈直或柔曲的链。经16S rDNA基因测序比对，本发明圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10与圈卷产色链霉菌同源性为95％以上，16SrDNA序列系统进化树显示与圈卷产色链霉菌同源。
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10为圈卷产色链霉菌，属于链霉菌属(Streptomyces)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.23720，保藏日期为2021年11月04日。
附图说明
图1是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在CMC固体培养进行刚果红染色照片；
图2是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10纤维素酶活力测定结果图；
图3是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在ISP2固体培养基上生长及形成的菌落照片；
图4是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10根据16S rRNA绘制的分子进化树；
图5是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在液态和固态降解培养基中对玉米秸秆的降解率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
称取不同采样时期的秸秆堆肥样品(来源于中国科学院东北地理与农业生态研究所堆肥)10g加入90ml灭菌超纯水中，30℃180rpm震荡30min，充分混匀然后静置，取1ml悬浊液依次梯度稀释，稀释后的悬液取70μl涂布于CMC固体培养基，30℃培养箱中培养5d，将CMC固体培养基上的菌落进行划线反复纯化5～8次，纯化后的单菌株在CMC固体培养基上培养3d后进行刚果红染色，1mol/L NaCl冲洗后，在平板上有透明圈出现的为可能的纤维素降解菌，从中筛选一株出现明显的纤维素降解透明圈的菌株，编号为菌株WF-10。
对菌株WF-10进行分子生物学鉴定：
取CMC-Na培养基30℃下培养7d的培养物，提取菌株WF-10的基因组DNA，对16SrDNA进行PCR扩增、测序。将菌株WF-10 16SrDNA的测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，选择序列相似性较高的菌株，用MEGA5.0构建系统发育树，如图3所示。结果证实：菌株WF-10是圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)，将其命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10。
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在CMC固体培养基上刚果红染色如图1所示，在ISP2固体培养基上生长及产生的菌落如图4所示。
实施例2
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10纤维素酶活力测定
将圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10接种到发酵产酶培养基(发酵产酶培养基：CMC-Na 10g、NaCl 0.1g、KH2PO4 1.0g、NaNO3 2.5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.1g、FeCl3 0.01g、蒸馏水1000mL)，于30℃、200rpm条件下振荡培养，每隔24h取一次样，8000rpm离心5min，上清液即为粗酶液。
A、内切葡聚糖酶活测定：取4支规格相同的洁净试管，1支试管作为空白，其余3支为待测试管。准确称量1.5mL的1％CMC-Na标准溶液，分别加入4支试管中，向3支待测管中分别加入0.5mL稀释后的粗酶液，摇匀后将4支试管置于50℃水浴锅中反应30min。取出后向空白管加入0.5mL煮沸灭活的稀释粗酶液，充分摇匀后，立即向各试管中加入1.5mL DNS试剂，沸水浴10min，取出快速冷却至室温，并分别向各试管中加10mL蒸馏水，摇匀后静置。用紫外分光光度计，于540nm波长，空白调零，测定待测试管中液体的吸光度。每管设3次平行，根据葡萄糖标准曲线确定还原糖含量，进而计算羧甲基纤维素酶活力。
B、外切葡聚糖酶活测定：取4支规格相同的洁净试管，1支试管作为空白，其余3支为待测试管。准确称量1.5mL的1％微晶纤维素标准溶液，分别加入4支试管中，向3支待测管中分别加入0.5mL稀释后的粗酶液，其余步骤与A一致。
C、滤纸酶活测定：取4支规格相同的洁净试管，1支试管作为空白，其余3支为待测试管。准确称量1.5mL 0.05mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液及0.5g无淀粉滤纸条(1cm ×6cm)，分别加入至4支试管中，向3支待测管中分别加入0.5mL稀释后的粗酶液，其余步骤与A一致。
D、β-葡萄糖苷酶活力(β-Gase)的测定：取4支规格相同的洁净试管，1支试管作为空白，其余3支为待测试管。准确称量1.5mL的1％水杨苷溶液，分别加入4支试管中，向3支待测管中分别加入0.5mL稀释后的粗酶液，其余步骤与A一致。
酶活结果如图2所示；酶活测试结果证实本发明圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)WF-10，在30℃条件下培养能分泌四种纤维素酶，包括滤纸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。其中，培养至第四天滤纸酶和内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活均达到最大值，分别为46.79U/mL和71.63U/mL；培养至第三天外切-β-1,4-葡聚糖酶达到最大值，为29.41U/mL，培养至第七天β-葡萄糖苷酶达到最大值，为12.06U/mL。
实施例3
验证圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10的高效性和实际应用性，对其进行液态发酵和固态发酵试验。
1.液态发酵降解秸秆：取5mL圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10菌液接种到优化后的液态发酵培养基(优化后的液态发酵培养基配方：玉米秸秆粉15g、NaCl 0.1g、KH2PO4 1.0g、(NH4)2SO4 4g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.1g、FeCl3 0.01g、蒸馏水1000mL)中，以不接菌液的液态发酵培养基作为对照，在30℃、180rpm条件下培养7d后，离心弃上清，加稀酸溶液反复冲洗秸秆，然后再用蒸馏水冲洗，离心后采用失重法测定秸秆的相对降解率。
2.固态发酵降解秸秆：取5mL圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10菌液接入优化后的固态发酵培养基(优化后的固态发酵培养基配方：2～5cm的玉米秸秆10g、NaCl 0.01g、KH2PO4 0.1g、(NH4)2SO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.03g、CaCl2 0.01g、FeCl30.001g、蒸馏水100mL)中，以不接菌液的固态发酵培养基作为对照，在30℃的培养箱中进行固态发酵，每3d摇匀一次；15d后将秸秆取出，加稀酸溶液反复冲洗秸秆，然后再用蒸馏水冲洗，离心后采用失重法测定秸秆的相对降解率，降解率如图5所示。
将圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10接种于ISP2液体培养基中，即得到圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10菌液。
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10在液态和固态发酵实验后对秸秆的降解率分别高达39.67％和54.30％，说明本发明圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10对玉米秸秆具有较好的降解效果。
Claims (3)
1.一株纤维素降解细菌，其为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)WF-10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23720。
2.权利要求1所述的纤维素降解细菌在纤维素生物降解中的用途。
3.根据权利要求2所述的纤维素降解细菌在纤维素生物降解中的用途，其特征在于纤维素降解细菌在秸秆生物降解中的用途。
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