CN116162574B - 一种类芽孢杆菌及其固态发酵粗饲料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种类芽孢杆菌及其固态发酵粗饲料的方法，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Paenibacillussp.F4；保藏编号为CCTCCNO：M20211448；该菌株可提高发酵饲料蛋白质含量，分泌的纤维降解酶羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性达到9.72U/g和10.35U/g底物；类芽孢杆菌F4用于固态发酵酒糟、棉渣、棉秆等蛋白含量低、纤维含量高的粗饲料，发酵后饲料中粗蛋白及真蛋白含量大幅提升，中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量大幅降低，且结构变得松软，可有效改善酒糟、棉渣、棉秆等粗饲料的营养品质；解决现有饲用发酵菌株对低蛋白含量、高纤维含量的粗饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高棉副产物和酒糟类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一种类芽孢杆菌及其固态发酵粗饲料的方法。
背景技术
粗饲料是指青干草、农作物秸秆、酒糟等非粮饲草料和副产物饲料，是牛羊养殖的重要饲料资源。我国是牛羊养殖大国，但优质饲草资源和产量不足，国内优质饲草自给率仅63％左右，每年进口苜蓿和燕麦干草达到200多万吨，限制了我国牛羊产业的快速发展。同时我国是农业大国，农作物秸秆资源非常丰富，尤其是在牛羊生产集中的西北和西南地区，棉副产物(棉渣、棉杆等)和酒糟资源十分丰富。但棉副产物和酒糟资源蛋白含量低、纤维含量高，与青干草等优质粗饲料的营养品质差距较大，限制了其广泛利用。
微生物发酵是改善粗饲料营养品质的主要方法，目前主要采用枯草芽孢杆菌、乳酸菌、黑曲霉、酵母菌等菌种发酵粗饲料。但由于酒糟酸度大，以及酒糟和棉渣、棉秆纤维含量高，极大制约了目前常用菌种的发酵效果。为克服上述问题，生产上多采用多菌种协同发酵和菌酶协同发酵方式发酵酒糟、棉秆、棉渣等，单菌发酵较少，增加了发酵生产成本和发酵工艺复杂。因此目前尚缺乏一种能针对棉杆、棉渣、酒糟等高纤维粗饲料有效发酵的菌种。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种类芽孢杆菌及其固态发酵粗饲料的方法，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Paenibacillussp.F4，保藏编号为CCTCC NO：M 20211448，该菌株可提高发酵饲料蛋白质含量，分泌的纤维降解酶羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性达到9.72U/g和10.35U/g底物；类芽孢杆菌F4用于固态发酵酒糟、棉渣、棉秆等蛋白含量低、纤维含量高的粗饲料，发酵后饲料中粗蛋白及真蛋白含量大幅提升，中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量大幅降低，且结构变得松软，可有效改善酒糟、棉渣、棉秆等粗饲料的营养品质；解决现有饲用发酵菌株对低蛋白含量、高纤维含量的粗饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高棉副产物和酒糟类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
为达到上述目的，采用的技术方案如下：
一种类芽孢杆菌F4，保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏时间为2021年11月19日，分类命名为Paenibacillus sp.F4，保藏编号为CCTCC NO：M 20211448，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072。
进一步的，所述类芽孢杆菌F4是从牦牛粪便中分离筛选出来，在鉴别培养基上39℃培养2d，为白色圆形菌落，表面突起，边缘相对整齐，且菌落较大，易挑取；所述牦牛粪便为新鲜牦牛粪便。
进一步的，所述类芽孢杆菌F4分类学地位根据如下方法确定：
常规方法提取类芽孢杆菌F4的总DNA，用全长通用引物扩增其16S rDNA片段，然后将PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比较分析，并构建系统发育树，经比较分析，本发明的菌株F4属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，将其命名为类芽孢杆菌F4。
进一步的，通过滤纸崩解试验、刚果红试验和纤维酶活的测定，所述类芽孢杆菌F4分泌的纤维降解酶中羧甲基纤维素酶CMCase活力达9.72U/g，滤纸酶FPase活力达10.32U/g。
一种类芽孢杆菌F4的分离方法，包括如下步骤：
步骤S1：采集牦牛新鲜粪便，将新鲜粪样放在超净台，用无菌刀片将粪样剖开，于中间位置取样，每个粪样取10-15g，混匀；
步骤S2：称取5g步骤S1中得到的粪便置于含45mL无菌水的100mL三角烧瓶中，以180r/min震荡30min后静置；取2mL粪便上清液置于含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养2天；
步骤S3：将步骤S2中得到的菌液培养液进行梯度稀释至10-7倍，每个梯度取30μL涂布到筛选培养基中，39℃倒置培养2天；
步骤S4：根据平板上不同形态的菌落，排除具有明显菌丝特征的真菌菌落，并挑取单个菌落于鉴别培养基中划线，重复几次，不断纯化，获得单菌为止；
步骤S5：将步骤S4中得到的单菌划线在鉴别培养基上培养5天，用0.1％刚果红染液染色1h后用1mol/L氯化钠溶液脱色1h后，挑取透明圈较大的菌落多次划线纯化后点种于鉴别培养基上再次用刚果红染色，记录水解透明圈直径d1和单菌菌落直径d2，计算d1/d2的比值，得到纤维素相对降解活性，筛选活性较强的单菌；
步骤S6：将步骤S5中筛选得到的单菌接种于不加琼脂的鉴别培养基中，120r/min振荡培养2天，取菌液10mL加入到含5条滤纸条(1*6cm)和100mL滤纸条崩解培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养7天，重复三次，以未接菌的培养基作为空白对照；培养结束后对滤纸条崩解情况观察并记录，选取滤纸条崩解效果明显的菌株用于酶活的测定；
步骤S7：将步骤S6中得到的单菌测定滤纸酶活性FPase和羧甲基纤维素酶活CMCase，选取活性最强的单菌，得到所述类芽孢杆菌F4。
一种类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，所述类芽孢杆菌F4在低蛋白含量，高纤维含量粗饲料固态发酵中的应用。
一种类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，所述低蛋白含量，高纤维含量粗饲料为白酒糟、棉秆和棉渣。
进一步的，所述利用类芽孢杆菌F4发酵白酒糟的具体方法为：酒糟、麸皮、尿素的质量比为17-20：2：0.3；发酵的条件是：发酵温度30-36℃，种子液添加量8.7×106cfu/g，料水比1:1.3-1.8，发酵时间4-6d；F4发酵后酒糟较未发酵酒糟或者其他菌种发酵的酒糟的中性洗涤纤维NDF、酸性洗涤纤维ADF含量大幅降低；CP和TP含量大幅提升，饲料营养价值显著改善，所述酒糟为浓香型酒糟。
进一步的，所述利用类芽孢杆菌F4发酵棉渣的具体方法为：发酵底物为：棉渣、玉米面、尿素的质量比为12-17：5：0.3；发酵条件为：发酵温度30-35℃，种子液添加量3.64×106cfu/g，料水比1:0.8-1.1，发酵时间5-7d；F4发酵后棉渣较未发酵棉渣或者其他菌种发酵棉渣的CP和TP含量大幅提升，NDF和ADF含量大幅降低，饲料营养价值显著改善。
进一步的，所述利用类芽孢杆菌F4发酵棉秆的具体方法为：发酵底物为棉秆、玉米面、尿素的质量比为12-17：5：0.4；发酵条件为：发酵温度28-33℃，种子液添加量4.55×106cfu/g，料水比1:1.0-1.5，发酵时间7-9d；F4发酵后棉秆较未发酵棉秆或者其他菌种发酵棉秆的CP和TP含量显著提升，NDF和ADF含量显著降低，饲料营养价值显著改善。
有益效果：
本发明的有益效果体现在：
本发明所涉及的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)F4能够针对酒糟、棉秆、棉渣等粗饲料营养特点，具有意想不到的大幅提升酒糟、棉秆、棉渣等粗饲料蛋白含量的作用，并且大幅降低饲料中的纤维含量，包括中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及粗纤维等，提升营养品质，使发酵后的酒糟结构变得松散，表面出现大量蜂窝状孔洞和明显的菌株附着，可有效改善酒糟、棉渣、棉秆等粗饲料的营养品质；解决现有饲用发酵菌株对低蛋白含量、高纤维含量的粗饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高棉副产物和酒糟类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例所述的类芽孢杆菌F4的菌落形态图；
图2是本发明实施例所述的类芽孢杆菌F4的扫描电镜图；
图3是本发明实施例所述的类芽孢杆菌F4系统发育树；
图4是本发明实施例所述的类芽孢杆菌F4生长曲线图；
图5是本发明实施例所述的未发酵对照组酒糟结构扫描电镜图；
图6是本发明实施例所述的类芽孢杆菌F4发酵后酒糟结构扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：菌株分离
本实施例提供从牦牛粪便中分离一种降解纤维、提升蛋白的类芽孢杆菌F4，分离方法包括如下步骤：
(1)采集牦牛新鲜粪便，将新鲜粪样放在超净台，用无菌刀片将粪样剖开，于中间位置取样，每个粪样取10g，混匀；
(2)称取5g步骤(1)得到的粪便置于含45mL无菌水的100mL三角烧瓶中，以180r/min震荡30min后静置；取2mL粪便上清液置于含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养2天；
(3)将步骤(2)得到的菌液培养液进行梯度稀释至10-7倍，每个梯度取30μL涂布到筛选培养基中，39℃倒置培养2天；
(4)根据平板上不同形态的菌落，排除具有明显菌丝特征的真菌菌落，并挑取单个菌落于鉴别培养基中划线，重复几次，不断纯化，获得单菌为止；
(5)将步骤(4)得到的单菌划线在鉴别培养基上培养5天，用0.1％刚果红染液染色1h后用1mol/L氯化钠溶液脱色1h后，挑取透明圈较大的菌落多次划线纯化后点种于鉴别培养基上再次用刚果红染色，记录水解透明圈直径d1和单菌菌落直径d2，计算d1/d2的比值，得到纤维素相对降解活性，筛选活性较强的单菌；
(6)将步骤(5)筛选得到的单菌接种于不加琼脂的鉴别培养基中，120r/min振荡培养2天，取菌液10mL加入到含5条滤纸条(1*6cm)和100mL滤纸条崩解培养基的250mL锥形瓶中，120r/min振荡培养7天，重复三次，以未接菌的培养基作为空白对照；培养结束后对滤纸条崩解情况观察并记录，选取滤纸条崩解效果明显的菌株用于酶活的测定；
(7)将步骤(6)得到的单菌测定滤纸酶活性(FPase)和羧甲基纤维素酶活(CMCase)，选取活性最强的单菌，得到所述类芽孢杆菌F4。
实施例2：菌落形态及生理生化特性鉴定
对实施例1分离得到的类芽孢杆菌F4进行菌落形态观察和生理生化特性鉴定，菌落形态如图1和图2所示。
所述类芽孢杆菌F4呈乳白色，菌落较大，杆状菌。
对实施例1分离得到的类芽孢杆菌F4进行生理生化特性鉴定实验，所述类芽孢杆菌F4属革兰氏阳性菌，好氧，且对纤维二糖、葡萄糖和蔗糖均有降解效果，不能降解淀粉。
实施例3：分子生物学鉴定
对实施例1分离得到的类芽孢杆菌F4进行16S rDNA分子生物学鉴定。提取单菌落培养物的基因组DNA作为模板，利用细菌16S通用引物27F/1492R进行PCR扩增，产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比较分析，并构建系统发育树，系统发育树见图3。
该序列在NCBI数据库中的比对分析结果显示，与Paenibacillus sp.strain UCCB144、Paenibacillus sp.FJAT-21993、Paenibacillus cineris strain CNU082088、Paenibacillus favisporus strain T2以及Paenibacillus sp.3492BRRJ聚为一支，说明它们的亲缘关系最近。菌株F4被认定为类芽孢杆菌属，命名为类芽孢杆菌F4。
实施例4：生长曲线的测定
操作方法为：挑取一环菌株接种于含50mL LB培养基的250mL三角烧瓶中，于180r/min、39℃的震荡培养箱中进行培养。每2h取200μL的培养液测定OD600，以未接菌的空白培养基作为空白校准，重复三次试验，绘制生长曲线。结果见图4。
实施例5：酒糟发酵
酒糟固态发酵：20g发酵底物(麸皮：酒糟＝1:9(m/m)，干物质(DM)基础)，额外添加1.5％尿素，置于250mL三角烧瓶中。挑取一环类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)F4接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养14小时后为发酵种子液。种子液的添加量为8.7×106cfu/g，共加入5mL种子液，添加25mL的无菌水，于33℃下发酵5d。测定常规养分结果如表1所示，发酵后酒糟较未发酵酒糟的CP和TP含量分别提高了32.04％和42.16％，中性洗涤纤维NDF、酸性洗涤纤维ADF含量分别降低了33.56％和37.74％，营养价值显著改善。发酵前后结构的改变见图5-图6，发酵后酒糟的结构被破坏，变得松软。
枯草芽孢杆菌与类芽孢杆菌亲缘关系较近，枯草芽孢杆菌适宜添加量和条件下发酵同等酒糟底物后粗蛋白质和真蛋白质提升率显著低于本发明菌株效果。适宜条件下混菌发酵(酿酒酵母+枯草芽孢杆菌)增加了降解纤维的功能菌，但是对酒糟纤维的降解率远不及本发明的单菌效果。
表1酒糟发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
注：本发明所有对照组的发酵基质同发酵组，对照组未添加菌种子液，而是添加了相同量的培养基。
表2本发明类芽孢杆菌F4发酵酒糟效果与已报道的其它菌株比较
实施例6：棉渣发酵
棉渣发酵：20g发酵底物(玉米面：棉渣＝1:3(m/m)，干物质(DM)基础)，额外添加1.5％尿素，置于250mL三角烧瓶中，备用。挑取一环类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)F4接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养14小时后为发酵种子液。种子液的添加量为3.64×106cfu/g，共加入4mL种子液，3mL空白培养液，添加11mL的蒸馏水，于33℃下发酵6d。结果如表3所示。相较于棉渣原料，经本发明菌株和方法发酵后棉渣的CP和TP含量分别提高了64.10％和80.46％，NDF和ADF含量分别降低了10.44％和12.20％。在现有技术中，由于棉渣原料的高纤维等特殊性，尚未有其他单菌种能够对棉渣饲料进行效果较好的发酵，因此本实施例未做与其它菌种发酵效果的对比。
表3棉渣发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
实施例7：棉秆发酵
棉秆发酵试验：20g发酵底物(玉米面：棉秆＝1:3(m/m)，干物质(DM)基础)，额外添加2％尿素，置于250mL三角烧瓶中，备用。挑取一环类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)F4接种于含50mL LB培养基的250mL的三角烧瓶中，于180r/min的震荡培养箱中39℃培养14小时后为发酵种子液。种子液的添加量为4.55×106cfu/g，共加入5mL种子液，2mL空白培养液，添加17mL的蒸馏水，于30℃下发酵8d。测定常规养分，结果如表4所示。相较于棉秆原料，发酵后棉秆的CP和TP含量分别提高了87.19％和141.02％，NDF和ADF含量分别降低了12.18％和19.43％。
如表5所示，目前由于棉秆纤维含量高，主要采用乳酸菌、乳杆菌发酵，未见与本试验相同和相近菌株发酵棉杆的报道。单菌乳酸菌适宜条件下发酵棉杆对粗蛋白和真蛋白的提升效果远不及本发明菌株。采用多菌发酵(乳杆菌+芽孢杆菌)或者底物混入低纤维饲料(棉杆+甜菜渣)发酵的蛋白提升率，NDF和ADF降解率也远不及本发明单菌。即使在混菌发酵基础上配合使用纤维酶制剂(混菌+酸性纤维素酶)发酵对棉杆纤维的降解率也不及本发明的单菌效果。
表4棉杆发酵前后营养价值对比(干物质基础％)
表5本发明类芽孢杆菌F4发酵棉秆效果与已报道的其它菌株比较
综上所述，本发明提供了一种类芽孢杆菌及其固态发酵粗饲料的方法，该菌株于2021年11月19日保存于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Paenibacillus sp.F4，保藏编号为CCTCC NO：M 20211448；该菌株可提高发酵饲料蛋白质含量，分泌的纤维降解酶羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性达到9.72U/g和10.35U/g底物；类芽孢杆菌F4用于固态发酵酒糟、棉渣、棉秆等蛋白含量低、纤维含量高的粗饲料，发酵后饲料中粗蛋白及真蛋白含量大幅提升，中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量大幅降低，且结构变得松软，可有效改善酒糟、棉渣、棉秆等粗饲料的营养品质；解决现有饲用发酵菌株对低蛋白含量、高纤维含量的粗饲料原料发酵效果不理想的问题，对于提高棉副产物和酒糟类饲料营养品质和饲料资源开发具有较大应用潜力。
类芽孢杆菌F4的rDNA测序：
以上所述，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已通过上述实施例揭示，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种类芽孢杆菌F4，其特征在于，所述类芽孢杆菌F4保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏时间为2021年11月19日，分类命名为Paenibacillus sp.F4，保藏编号为CCTCC NO：M 20211448，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072。
2.一种如权利要求1中所述的类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，其特征在于，所述类芽孢杆菌F4在低蛋白含量，高纤维含量粗饲料固态发酵中的应用；
所述低蛋白含量，高纤维含量粗饲料为白酒糟、棉秆和棉渣。
3.一种如权利要求2中所述的类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，其特征在于，利用类芽孢杆菌F4发酵白酒糟的具体方法为：酒糟、麸皮、尿素的质量比为17-20：2：0.3；发酵的条件是：发酵温度30-36 ℃，种子液添加量8.7×106 cfu/g，料水比1:1.3-1.8，发酵时间4-6d。
4.一种如权利要求2中所述的类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，其特征在于，利用类芽孢杆菌F4发酵棉渣的具体方法为：发酵底物为：棉渣、玉米面、尿素的质量比为12-17：5：0.3；发酵条件为：发酵温度30-35 ℃，种子液添加量3.64×106 cfu/g，料水比1:0.8-1.1，发酵时间5-7d。
5.一种如权利要求2中所述的类芽孢杆菌F4固态发酵粗饲料的方法，其特征在于，利用类芽孢杆菌F4发酵棉秆的具体方法为：发酵底物为棉秆、玉米面、尿素的质量比为12-17：5：0.4；发酵条件为：发酵温度28-33 ℃，种子液添加量4.55×106 cfu/g，料水比1:1.0-1.5，发酵时间7-9d。
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Non-Patent Citations (3)
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| 大熊猫粪便中纤维素降解菌的鉴定与作用机理;曹涵文等;《福建农林大学学报(自然科学版)》;第45卷(第3期);第64-71页，参见全文 * |
| 白酒糟纤维素降解菌的优选及酒糟降解工艺;阳刚等;《农业工程学报》;第220-229页，参见全文 * |
| 纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化;李争明等;《生物技术通报》;第152-158页，参见全文 * |
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