CN110804560B

CN110804560B - 一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1及其应用、微生物制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110804560B
Application number: CN201911262964.2A
Authority: CN
Inventors: 汤熙翔; 王起林; 冯莹
Original assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110804560A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9‑1及其应用、微生物制剂及其制备方法和应用，其中一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9‑1，保藏编号为：CCTCC NO：M2019661，其具有良好的产纤维素酶和蛋白酶的特性，其发酵产物可以作为用于制备微生物制剂，该微生物制剂可作为饲料添加剂应用于饲料中，水产动物在食用了富含蛋白酶和纤维素酶的饲料后，能够促进水产动物对各类蛋白的消化吸收，降低消化道粘稠度，从而使各类水产动物增重增产，提高饲料消化率。

Description

一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1及其应用、微生物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1及其应用、微生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术

作为世界水产养殖大国之一，我国的水产养殖总产量已连续多年居世界第一。水产饲料是水产养殖的必要条件和物质基础，水产养殖行业的发展一直依赖于饲料行业的发展水平。水产动物对饲料蛋白质水平的要求较高，一般占配方的25-50％，为畜禽的2-4倍，甚至更多。饲料中蛋白质的含量与品质不仅决定了鱼虾的生长速度与健康状况，而且也是鱼虾养殖经济效益的重要影响因素之一。因此，蛋白质来源的成本是水产养殖饲料成本的重要组成部分。传统采用的鱼粉具有氨基酸平衡、碳水化合物含量少、适口性好、易吸收等特点，一直以来是水产饲料中不可或缺的优质蛋白源。然而，由于过度捕捞，用于供应鱼粉和鱼油生产的水生动物数量急剧下降，加上我国本身鱼粉产量一直较少，质量参差不齐，远远不能满足我国饲料工业发展的需求。

酵母通常被认为是蛋白质、核酸、维生素和多糖的良好来源，酵母培养物在养殖业中的应用开始于20世纪20年代，迄今为止，其在反刍动物、猪等养殖领域已有广泛应用；在水产动物方面的报道见于草鱼、奥尼罗非鱼、凡纳滨对虾等，这些研究表明，酵母培养物可以增加饲料的营养，对动物具有促进生长的作用。

但是水产饲料的营养价值不仅在于其是否含有丰富的营养成分，还在于其是否能为水产动物所消化吸收，比如水产动物可产生内源蛋白酶来消化蛋白，但内源蛋白酶的消化率并不能达到百分之百，因此，添加外源蛋白酶可起到辅助补充作用，可进一步提高蛋白质的消化率；又比如纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖,从而提高饲料利用率。但是现有的酵母没有具备良好的产蛋白酶和纤维素酶的特性，因此，其培养物仅仅是增加饲料的营养，并没有真正提高饲料的利用率。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的现有酵母培养物蛋白酶和纤维素酶含量低的问题，本发明提供一种产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1，证明该菌株具有良好的产纤维素酶和蛋白酶的特性，其发酵产物应用在水产饲料中，不仅丰富饲料的营养成分，还促进水产动物对饲料的消化和吸收，提高饲料的利用率。

本发明提供的酵母菌9-1是从大洋沉积物样品中分离得到的，并证明其具有良好的产纤维素酶和蛋白酶的特性；该菌株经分类学研究和分子生物学研究鉴定为酵母属(Papiliotrema rajasthanensis)，保藏编号为：CCTCC NO：M2019661，已于2019年8月26日在中国典型培养物保藏中心保藏。

所述酵母菌9-1的微生物学特征为：

在YPD平板上28℃培养72h后，如图1和图2所示，菌落正面呈现污白色，反面呈淡黄色；菌落表面圆润有光泽，边缘整齐，菌落中央与边缘的颜色一致；表面光滑湿润，粘稠，易挑起，表面光滑随着培养时间增加，菌落颜色变暗；如图3所示，扫描电镜下酵母单个或成团排列，单细胞3-4×5-6微米，着色均匀，呈圆形至椭圆形。

本发明还提供如上所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在水产养殖中的应用。

本发明还提供如上所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在产蛋白酶中的应用。

本发明还提供如上所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在产纤维素酶中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种利用如上所述的酵母菌9-1生产的微生物制剂。

在上述方案的基础上，进一步地，采用如上所述酵母菌9-1发酵液的干燥物作为有效成分。

本发明的另一个目的在于提供如上所述的微生物制剂在饲料添加剂中的应用。

本发明还提供一种根据如上所述的微生物制剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一、将酵母菌9-1按斜面培养、液体种子培养、液体发酵培养的顺序进行培养，得到发酵液；

步骤二、向发酵液中添加维生素C，添加量为2g/L；

步骤三、将步骤二制得的发酵液进行真空冷冻干燥，得到固态粉末，即可得到微生物制剂。

在上述方案的基础上，进一步地，所述液体发酵培养的培养基为4％蔗糖、2％蛋白胨、2％酵母膏、1％MgSO₄、91％水。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供的酵母菌9-1具有良好的产纤维素酶和蛋白酶的特性，其中蛋白酶是作用于蛋白质或多肽，催化肽键水解的酶；纤维素酶的作用机理主要为：通过促进植物细胞壁的溶解，降解纤维素；

基于上述特性，该酵母菌的发酵液还可以作为饲料添加剂应用于饲料中，水产动物在食用了富含蛋白酶和纤维素酶的饲料后，能够促进水产动物对各类蛋白和纤维素的消化吸收，降低消化道粘稠度，从而使各类水产动物增重增产，提高饲料消化率和利用率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的酵母菌9-1的菌落形态正面图；

图2为本发明提供的酵母菌9-1的菌落形态背面图；

图3为本发明提供的酵母菌9-1透射电子显微镜检形态图；

图4为本发明提供的酵母菌9-1的ITS扩增产物凝胶电泳图；

图5为本发明提供的酵母菌9-1的生长曲线图；

图6为本发明提供的酵母菌9-1的蛋白酶水解圈正面图；

图7为本发明提供的酵母菌9-1的蛋白酶水解圈背面图；

图8为本发明提供的酵母菌9-1的纤维素酶水解圈正面图；

图9为本发明提供的酵母菌9-1的纤维素酶水解圈背面图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：酵母菌9-1的分离和鉴定：

A、酵母9-1的分离和纯化：

将浓度为50ml/L的链霉素和浓度为50ml/L的青霉素加入到YPD固体平板中，再将5g大洋21航次采集到的西南印度洋(36.22°S，52.86°E)2089米深的沉积物样品涂到平板上，48h后使用牙签挑取单菌落在28℃条件下培养，分离得到该菌；

该菌的微生物学特征为：在YPD平板上28℃培养72h后，如图1和图2所示，菌落正面呈现污白色，反面呈淡黄色。菌落表面圆润有光泽，边缘整齐，菌落中央与边缘的颜色一致。表面光滑湿润，粘稠，易挑起，表面光滑随着培养时间增加，菌落颜色变暗；如图3所示，扫描电镜下酵母单个或成团排列，单细胞3-4×5-6微米，着色均匀，呈圆形至椭圆形。

B、酵母菌9-1的基因组DNA提取：

(1)将保种或已纯化的真菌接种到YPD平板上，28℃生长2-3天后，用无菌的牙签挑取少量菌丝体至EP管，放入液氮中冻30-60min；

(2)取出冷冻的菌体，每管加入400μl 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45-60min；

(3)加入400μl的混合液，其混合液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25:24:1混合制得，充分混匀，在13000r/min转速下离心20-30min，将上层水相移入新管；

(4)重复第(3)步；

(5)上清液加入0.7倍体积的异丙醇，于4℃中静置30min或者过夜；

(6)接着将步骤(5)中的静置液在13000r/min的转速下离心15min，除去上清液，剩余沉淀用70％乙醇洗涤2次，吹干；

(7)以20ul DDW溶解沉淀，-20℃保存。

(8)取5μL DNA与1μL溴酚蓝；在0.8％的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。

C、菌株鉴定：

通过引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’和ITS5 5’-GGA AGT AAAAGT CGT AAC AAG G-3’对9-1基因组DNA进行扩增，PCR为95℃预变性3min 95℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s：32个循环，72℃延伸10min，4℃保温，将克隆片段跑胶得到如图4所示的凝胶电泳图；

对酵母菌9-1序列(GENE Bank ID：HQ832836.1)进行BLAST分析，结果显示该序列和Papiliotrema rajasthanensis strain AUMC 10795(GENE Bank ID：KY495763.1)相似度最高，达到99.8％。故可鉴定该株菌属于球酵母属(Papiliotrema rajasthanensis)。

实施例2:酵母菌9-1的发酵培养基的优化配制：

本发明选取了多种能用于酵母菌9-1发酵培养基的碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜)、氮源(蛋白胨、牛肉膏、玉米面)和其他生长因子，在28℃，裝液量ml/250m，接种量1％，转速180r/min的同一培养条件下进行酵母9-1发酵培养比较，综合考虑菌含量指标，在发酵72小时后采用干重法对酵母进行称重，筛选出其中最适合酵母菌9-1发酵的培养基；

其中，优化发酵培养基采用单因子法和正交试验设计法，单因子方差分析是一种简单的方差分析模型。它只需将因子效应与误差效应分离开，并通过比较均方来判断因子效应的显著性；正交实验法则凭借其只要较少的实验次数即可引出许多有价值的结论经常正交实验法通常和单因子法结合使用。

单因子法：利用单一变量法从待选的各种碳源、氮源、无机盐中逐一筛选出最合适的发酵碳源是蔗糖，最合适的发酵氮源是酵母膏提取物和蛋白胨，最合适的发酵无机盐是MgSO₄；

正交实验法：用正交表安排多因素试验的方法，称为正交试验设计法。其特点为：①完成试验要求所需的实验次数少；②数据点的分布很均匀；③可用相应的极差分析方法、方差分析方法、回归分析方法等对试验结果进行分析，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法；正交试验设计方法是用正交表来安排试验的，具体水平设置及结果见下表：

表1 酵母菌9-1发酵培养基正交实验因素水平

水平	蔗糖(g/L)	蛋白胨(g/L)	酵母膏(g/L)	MgSO<sub>4</sub>(g/L)	pH
						1	2	2	1	1	7
2	4	4	2	2	8
						3	8	8	4	-	-

表2 酵母菌9-1发酵培养基优化正交试验及结果表

从表2的结果可以得出实验号为11中的酵母干重值最大，因此，酵母菌9-1的最佳培养基为：pH为7，蔗糖4％，蛋白胨2％，酵母膏2％，MgSO₄1％，其余为水。

实施例3:酵母菌9-1的发酵条件的优化及生产曲线：

发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用，尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常必要的技术手段。发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的，往往是多种优化方法的结合,微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，为其提供最佳的环境条件，最终才能得到其最大生物量以及最优的代谢产物；

微生物生长曲线是以微生物数量(活细菌个数或细菌重量)为纵坐标，培养时间为横坐标画得的曲线，了解微生物的生长过程对于工业发酵是非常有必要的；采用比浊法来测量酵母菌9-1的生长曲线，如图5所示，在接种4个小时内即迅速进入对数生长期，在培养至28小时左右进入平台期，并在培养到150个小时之后进入到衰亡期阶段；

采用一系列正交试验，利用优化后的培养基，研究温度、接种量、摇床转速以及摇瓶装液量对海洋酵母9-1的发酵影响，发酵后72小时对酵母细胞数进行计数，具体水平设置及结果见表3：

表3 酵母菌9-1发酵条件优化正交试验及结果表

从表3中可以得出，实验号为50的发酵条件下酵母细胞数最多，因此可得到最佳的发酵条件为温度30℃、接种量4％、摇床转速200r/min，以及摇瓶装液量40ml/250ml。

实施例4:酵母菌9-1的蛋白酶产酶效果测试：

将筛选出的酵母菌9-1在YPD平板上划线分离，在28℃培养2d长出单菌落，用牙签挑取单菌落点种在蛋白酶培养基平板上，再培养3d，每天观察水解圈情况；

其中，蛋白酶筛选培养基的的配方为：干酪素8.0g，Na₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄ 0.5g,NaCl 5.0g,牛肉浸出粉1.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；

如图6和图7所示，酵母菌9-1在72小时培养后产生半径为1.2cm的透明圈，说明酵母菌9-1具有良好的产蛋白酶效果。

实施例5:酵母菌9-1的纤维素酶产酶效果测试：

将筛选出的酵母菌在YPD平板上划线分离，在28℃培养2d长出单菌落，用牙签挑取单菌落接种在纤维素酶培养基平板上，培养3d后加入0.5％刚果红染色50min，然后倒掉刚果红，用5％NaCl浸泡1h，1h后除去NaCl观察是否有透明圈产生；

其中，纤维素酶筛选培养基的配方为：NaCl 5g，MgSO₄ 0.5g,KH₂PO₄ 0.5g,CaCl₂0.1g,K₂HPO₄ 2.0g,CMC-Na 15g,(NH₄)₂SO₄ 2.0g,酵母浸出粉1.0g,胰酪蛋白胨5.0g,蒸馏水1000ml,琼脂粉15g,pH为7.0；

如图8和图9所示，酵母菌9-1在纤维素酶培养基上培养72小时后产生半径为1cm的透明圈，说明酵母菌9-1具有良好的产纤维素酶效果。

实施例6:酵母菌9-1微生物制剂的制备：

包括以下制备步骤：

步骤一、酵母菌9-1(Papiliotrema rajasthanensis)，保藏编号为：CCTCC NO：M2019661，按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养：将保种管中的9-1活化到斜面培养基上，28℃条件下，待其生长48小时后，挑取单菌落加入到YPD种子液培养基中，28℃条件下，种子液摇培24小时后，按接种量4％接种到扩大发酵瓶中进行液体发酵培养，具体地，在1L三角瓶中裝液500ml，通气培养72h，测得发酵液的活菌数＞10⁸CFU/mL；

其中，斜面和种子培养基为的YPD培养基，其配方为：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，其余为水，pH为7；液体发酵培养基配方:蔗糖4％，蛋白胨2％，酵母膏2％，MgSO₄1％，91％水，pH为7；发酵培养条件为温度30℃，转速180转/分钟；

步骤二、向上述发酵液中加入维生素C，添加量为2g/L；其中，维生素C作为保护剂，起协调保护的作用，有利于微生物制剂的保藏；

步骤三、将混合发酵液放入真空冷冻干燥机中进行干燥处理，除去多余的水分，得到固态粉末，即可得到酵母菌9-1微生物制剂；发酵液通过真空干燥得到固态粉末有利于微生物制剂的保存。

实施例7:酵母菌9-1微生物制剂在水产养殖中的应用：

将实施例6中制得的酵母菌9-1微生物制剂添加到麦糠、豆粕、鱼粉等固体辅佐料的混合物中即可得到水产饲料，其制备的饲料可应用于水产养殖中；

具体地，将实施例6中制得的酵母菌9-1微生物制剂作为凡纳滨对虾幼体饵料添加剂，以市面上的2种虾幼体饵料为对照，3组试验组在育苗池4m x 6m x 1.8m中进行育苗实验。育苗用海水经沉淀沙滤、再经5μm孔径的滤袋过滤进人育苗池，海水比重1.018-1.022,育苗温度26-31℃。通过检测存活率和出苗率进行评估新型饲料添加剂的作用效果。发现，酵母菌9-1微生物制剂的饲料添加剂组可显著性提高凡纳滨对虾幼苗的存活率和出苗率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一株产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1(Papiliotrema rajasthanensis)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2019661。

2.根据权利要求1所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在水产养殖中的应用。

3.根据权利要求1所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在产蛋白酶中的应用。

4.根据权利要求1所述的产纤维素酶和蛋白酶的酵母菌9-1在产纤维素酶中的应用。

5.一种利用权利要求1所述的酵母菌9-1生产的微生物制剂。

6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：采用所述酵母菌9-1发酵液的干燥物作为有效成分。

7.根据权利要求5或6所述的微生物制剂在饲料添加剂中的应用。

8.一种根据权利要求5或6所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

步骤二、向发酵液中添加维生素C，添加量为2g/L；

9.根据权利要求8所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养的培养基的配方为4％蔗糖、2％蛋白胨、2％酵母膏、1％MgSO₄、91％水。