CN105795120A - 使用工程化的解酯耶氏酵母生产高蛋白秸秆饲料的方法 - Google Patents

使用工程化的解酯耶氏酵母生产高蛋白秸秆饲料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种使用工程化的解酯耶氏酵母生产高蛋白秸秆饲料的方法，其特征在于，使用分别转入了密码子优化的β‑葡萄糖苷酶编码基因、密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因和密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因的三种工程化的解酯耶氏酵母的混合物对秸秆与氯化铵的混合物发酵来生产所述饲料成分，其中，所述密码子优化的β‑葡萄糖苷酶编码基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:2所示，并且所述密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:3所示。

Description

使用工程化的解酯耶氏酵母生产高蛋白秸秆饲料的方法
技术领域
本发明涉及合成生物学以及饲料领域，更特别地，涉及使用工程化的解酯耶氏酵母分解秸秆来产生高蛋白饲料成分的方法。
背景技术
纤维素是地球上最丰富的多糖类生物质，它广泛而大量地存在于谷物、豆类、麦类及其加工副产品等畜禽饲料里，是多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本单位为纤维二糖。在天然秸秆中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分纤维素外，猪、鸡等单胃动物胃肠道内因缺乏纤维素酶而不能利用，大大限制了秸秆在饲料行业的应用范围。粗纤维是反刍动物饲料中重要的组分之一，起到提供能量、促进胃肠道对饲料消化吸收、维持瘤胃正常生理等功能作用。秸秆饲料中的纤维素若分解得到单糖或者寡糖，并将部分单糖转化为单细胞蛋白，能有效提高秸秆饲料的利用效率。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种具代表性的非常规酵母，解脂耶氏酵母可用于食品和药物生产。其底物范围广、分泌表达能力较强、没有致病性，并且能利用有机酸、蛋白质和烷烃类等廉价物质的作为底物，并能大量分泌表达出很多有用的代谢产物，例如有机酸、脂肪酶、磷酸酶等工业化产品，这些比其它类型酵母更为优良的特性使其成为一个理想的表达外源基因的宿主。解脂耶氏酵母从上世纪40年代被发现以来，越来越受到研究者的关注，并且在上世纪90年代已经被成功开发为一种新的酵母表达系统。
我国作为一个农业大国,每年都有数千万吨的农副加工产品的下脚料被作为废物丢弃，既浪费了资源又污染了环境。仅以农村秸秆利用为例，每年就有数百万吨植物秸秆被作为燃料利用，有效利用率很低。因此，需要开发一种能够将这些秸秆转化为优质的配合蛋白饲料成分的方法。
发明内容
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种使用工程化的解酯耶氏酵母生产高蛋白饲料成分的方法，其特征在于，使用分别转入了密码子优化的β-葡萄糖苷酶编码基因、密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因和密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因的三种工程化的解酯耶氏酵母的混合物对秸秆与氯化铵的混合物发酵来生产所述饲料成分，其中，所述密码子优化的β-葡萄糖苷酶编码基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:2所示，并且所述密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:3所示。
秸秆是的成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，本发明所述的秸秆可为小麦、水稻、玉米、薯类、油菜、棉花、甘蔗、高粱等的秸秆或其中两种或更多种的组合，优选为玉米秸秆、水稻秸秆或其组合。
所述三种工程化的解酯耶氏酵母以等量混合。
所述方法包括以下步骤：
1)将秸秆与氮源(例如，氯化铵、硫酸铵、尿素等)以10:1-50:1的重量比配制成培养基，灭菌，例如可在121℃下处理25-30min来灭菌；
2)将所述三种工程化的解酯耶氏酵母接种于YPD液体培养基中培养，例如，培养条件可为28℃，200rpm分别摇瓶培养，至OD600＝2.0，将培养得到的三种工程化的解酯耶氏酵母培养物等体积混合，离心收集菌体，将培养得到的三种工程化的解酯耶氏酵母培养物等体积混合，离心收集菌体，重悬于水性液体中，合适的用于重悬的水性液体例如水、磷酸缓冲液等；
3)将步骤2)中得到的重悬的工程化的解酯耶氏酵母接种于步骤1)得到的秸秆与氯化铵的混合培养基中，于23-28℃发酵10-15天后得到发酵产物。
所述发酵产物可直接作为饲料，或者向其中加入淀粉、氨基酸、维生素、矿物质等添加剂，形成配方饲料。因此，本发明还提供了一种高蛋白含量的饲料，其包含通过上述方法得到发酵产物。
附图说明
图1为重组表达载体pINA1297-BG的质粒图；
图2为重组表达载体pINA1297-EG的质粒图；
图3为重组表达载体pINA1297-CBH的质粒图。
具体实施方式
重组质粒的构建
通过NCBI得到纤维素β-葡萄糖苷酶基因(GeneBank：AF163097)、纤维素外切葡聚糖酶基因(GeneBank：AY861348)和纤维素内切葡聚糖酶基因(GeneBank：EU169241)的序列，并以其为基础分别合成密码子优化的β-葡萄糖苷酶基因序列(SEQ ID NO:1)、纤维素外切葡聚糖酶基因序列(SEQ ID NO:2)和纤维素内切葡聚糖酶基因序列(SEQ ID NO:3)，将所得到的密码子优化的序列分别顺着组成型启动子hp4d的转录方向克隆到质粒pINA1297的Sfi I和Kpn I酶切位点之间，使得组成型启动子hp4d控制基因的转录，从而得到三个重组表达质粒，其分别为带有β-葡萄糖苷酶基因的pINA1297-BG(图1)、带有纤维素外切葡聚糖酶基因的pINA1297-CBH(图2)和带有纤维素内切葡聚糖酶基因的pINA1297-EG(图3)。
重组质粒的转化和筛选
用限制性内切酶NotI将三种重组质粒线性化，制作解脂耶氏酵母polh菌株的感受态，并利用LiAc化学转化法将三种重组质粒分别转化至解脂耶氏酵母感受态细胞中。以不含尿嘧啶的YNB-N5000培养基对转化株进行初步筛选，再利用菌落PCR的方法筛选出纤维素酶基因成功转化的重组菌株。将所得重组菌株接种至PPB液体培养基中，在28℃、200rpm条件下进行摇瓶培养，每24小时测定其酶活力大小变化，选择最佳的转化株进行后续的发酵。本实验最后选取的解酯耶氏酵母重组菌株分别为Polh-1297-BG、Polh-1297-CBH和Polh-1297-EG。其中Polh-1297-BG摇瓶13天后酶活为14.2U/mL，Polh-1297-EG摇瓶13天后酶活为16.3U/mL，Polh-1297-CBH摇瓶13天后酶活为17.4U/mL。
酶活定义为：1mL粗酶液在50℃条件下反应1min产生1微克葡萄糖为一个酶活力单位，即1U。
YNB-N5000培养基配方为：0.17％YNB(无氨基酸酵母氮源)，1％葡萄糖，0.5％硫酸铵，1.5％琼脂粉。
所述的PPB液体培养基配方为：2％蔗糖，0.132％酵母粉，0.132％氯化铵，0.032％磷酸二氢钾，0.0132％硫酸镁，3.34*10-5％硫胺素，以pH为5.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液定容。
秸秆发酵及蛋白含量测定
秸秆底物与氯化铵配制发酵培养基，于121℃灭菌25-30min。将YPD固体培养基平板上保存的解脂耶氏酵母菌株Polh-1297-BG，Polh-1297-EG,Polh-1297-CBH分别接种于YPD液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下摇瓶扩培。当菌液浓度达到OD600＝2.0时，将三种培养液等体积混合。离心收集菌体，用pH 5.0的磷酸缓冲液重悬，接种至待发酵的秸秆培养基中，于28℃发酵10-15天。
取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物至消化管中进行预处理，加2mL 0.1M的氢氧化钠并将消化管置于消化炉上，200℃加热10min，以消除发酵培养基中的氯化铵对蛋白含量测定结果的影响。预处理后向消化管中加入催化剂(1.5g硫酸铜，4.5g硫酸钾)及10ml浓硫酸进行消煮，待消煮完全后利用凯氏定氮仪蒸馏，最后利用0.02M的HCl滴定来测算粗蛋白含量。
此发明中秸秆底物用量、工程化的解酯耶氏酵母用量可根据需要实际需要等比例扩大，秸秆用量可达到百公斤级、吨级规模。
本实验所用凯氏定氮仪为上海新嘉KDN-C型凯氏定氮仪，消化炉为KDN-08C型数显温控消化炉。
所述的YPD液体培养基配方为：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
所述的YPD固体培养基配方为：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉。
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1 发酵少量玉米秸秆
1、在YPD固体平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的单菌落分别接入200mL YPD液体培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养。
2、在摇瓶培养菌液浓度均达到OD600＝2.0时，将三种菌液按等体积混合，收集500mL菌体，用300mL pH 5.0的磷酸缓冲液重悬后加入121℃灭菌处理25min的含50g玉米秸秆及5g氯化铵的发酵培养基中，在28℃恒温发酵。
3、连续培养10天后,随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用2mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为14.54％。
4、连续培养15天后,随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用2mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为16.23％。相对于第10天，蛋白含量上升了11.62％。
以上实验数据均由三个平行实验组求取均值所得。
实施例2 发酵大量玉米秸秆
1、在YPD固体平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的单菌落分别接入2L YPD液体培养基中，30℃，200rpm摇瓶发酵培养。
2、在发酵菌液浓度均达到OD600＝2.0时，将三种菌液按等体积混合收集5L菌体，用3L pH 5.0的磷酸缓冲液重悬后加入121℃灭菌处理30min的含5kg玉米秸秆及500g氯化铵的发酵培养基中，在28℃恒温发酵。
3、连续培养10天后，随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用3mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为14.84％。
4、连续培养15天后，随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用3mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为16.57％。相对于第10天，蛋白含量上升了11.66％。
以上实验数据均由三个平行实验组求取均值所得。
实施例3 发酵少量水稻秸秆
1、在YPD固体平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的单菌落分别接种于200mL YPD液体培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养。
2、在摇瓶培养菌液浓度均达到OD600＝2.0时，将三种菌液按等体积混合，收集500mL菌体，用400mL pH 5.0的磷酸缓冲液重悬后加入121℃灭菌处理25min的含50g水稻秸秆及5g氯化铵的发酵培养基中，在28℃恒温发酵。
3、连续培养10天后，随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用2mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为13.28％。
4、连续培养15天后,随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用2mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为14.75％。相对于第10天，蛋白含量上升了11.07％。
以上实验数据均由三个平行实验组求取均值所得。
实施例4 发酵大量水稻秸秆
1、在YPD固体平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的单菌落分别接入2L YPD液体培养基中，30℃，200rpm摇瓶培养。
2、在发酵菌液浓度均达到OD600＝2.0时，将三种菌液按等体积混合，收集5L菌体，用4L pH 5.0的磷酸缓冲液重悬后加入121℃灭菌处理30min的含5kg水稻秸秆及500g氯化铵的发酵培养基中，在28℃恒温发酵。
3、连续培养10天后，随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用3mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为13.72％。
4、连续培养15天后，随机取样烘干，称取1.000g(精确到0.002g)发酵产物样品，用3mL 0.1M氢氧化钠预处理后，利用凯氏定氮法测定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量为15.23％。相对于第10天，蛋白含量上升了11.01％。
以上实验数据均由三个平行实验组求取均值所得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种使用工程化的解酯耶氏酵母生产饲料成分的方法，其特征在于，使用分别转入了密码子优化的β-葡萄糖苷酶编码基因、密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因和密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因的三种工程化的解酯耶氏酵母的混合物对秸秆与氯化铵的混合物发酵来生产所述饲料成分，其中，所述密码子优化的β-葡萄糖苷酶编码基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述密码子优化的外切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:2所示，并且所述密码子优化的内切葡聚糖酶编码基因序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秸秆为小麦、水稻、玉米、薯类、油菜、棉花、甘蔗、高粱的秸秆中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三种工程化的解酯耶氏酵母以等量混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将秸秆与氮源以10:1-50:1的重量比配制成培养基，灭菌；
2)将所述三种工程化的解酯耶氏酵母接种于YPD液体培养基中培养，将培养得到的三种工程化的解酯耶氏酵母培养物等体积混合，离心收集菌体，重悬；
3)将步骤2)得到的重悬的工程化的解酯耶氏酵母接种于步骤1)得到的秸秆与氯化铵的混合培养基中进行发酵，得到发酵产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氮源选自氯化铵、硫酸铵、尿素中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中的发酵条件为23-28℃恒温，有氧条件。
7.一种高蛋白含量的饲料，其特征在于，包含通过权利要求1-6中任一项所述的方法得到发酵产物。
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