CN113667035B - 一种苹果果胶低聚糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果果胶低聚糖的制备方法，其包括以下步骤：取过氧化氢溶液、抗坏血酸溶液与苹果果胶固体混合均匀，得到苹果果胶溶液，真空封装；在常温高压600MPa条件下，使上述真空封装的苹果果胶溶液反应30分钟；将反应结束后的苹果果胶溶液通过10 kDa超滤管过滤，收集滤液；将所述滤液通过C18色谱柱和离子交换柱分离得到组分1‑组分7，即制得苹果果胶低聚糖。由此通过超高压协同无金属′顿体系降解苹果果胶，再通过膜分离和柱分离可纯化出1kDa左右的低聚糖，其糖成分主要含有甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖醛酸、木糖和鼠李糖。

Description

一种苹果果胶低聚糖的制备方法
技术领域
本发明涉及果胶低聚糖的制备技术领域，具体涉及一种苹果果胶低聚糖的制备方法。
背景技术
果胶是一种主要由单糖和杂多糖组成的物质，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，主链是由D-半乳糖醛酸以α-(1→4)键相连，以及其他中性糖组成，例如L-鼠李糖(Rha)，D-半乳糖(Gal)，L-阿拉伯糖(Ara)，葡萄糖(Glu)等。果胶寡糖组分具有抗菌、抗癌、抗氧化等生理活性，是食品添加剂良好的选择。同时果胶寡糖具有一定耐酸性，不被胃酸降解可在大肠中稳定存在，且已被证实了其对肠道菌群选择性生长的促进作用，具有很好的益生元开发潜质。
目前果胶低聚糖的制备方法主要有天然提取法、化学合成法、物理制备法和酶解法。其存在着果胶降解不完全、产物成分复杂、生产成本高、高能耗和环境污染等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种苹果果胶低聚糖的制备方法。该方法绿色高效的分离纯化出果胶低聚糖。
为了实现上述目的，本发明的实施例在一方面提出了一种苹果果胶低聚糖的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取过氧化氢溶液、抗坏血酸溶液与苹果果胶固体混合均匀，得到苹果果胶溶液，真空封装；
(2)在常温高压600MPa条件下，使上述真空封装的苹果果胶溶液反应30分钟；
(3)将反应结束后的苹果果胶溶液通过10kDa超滤管过滤，收集滤液；
(4)将所述滤液通过C18色谱柱和离子交换柱分离得到组分1-组分7，即制得苹果果胶低聚糖。
根据本发明实施例的一种苹果果胶低聚糖的制备方法，通过超高压协同无金属′顿体系降解苹果果胶，再通过膜分离和柱分离可纯化出1kDa左右的低聚糖，其糖成分主要含有甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖醛酸、木糖和鼠李糖。
可选地，在步骤(1)中，过氧化氢溶液与抗坏血酸溶液的比例为1:1。
可选地，在步骤(1)中，料液比为1:2mg/mL。
可选地，在步骤(1)中，过氧化氢浓度为50mM，抗坏血酸浓度为10mM。
可选地，在步骤(4)中，先用XBridge C18分离出组分1和组分2，组分1经DEAE-Sepharose CL 6B分离出组分1-7。
进一步地，在步骤(4)中，XBridge C18的色谱条件为流速：15mL/min，温度：室温，流动相，水和甲醇，梯度洗脱：0-30min，水/甲醇：90/10至70/30；检测器：PDA多通道快速紫外-可见光检测器，进样量：1mL，每管收集5mL，收集90个管。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的果胶低聚糖的制备流程；
图2为根据本发明实施例的苹果果胶低聚糖的糖成份分析图；
图3为根据本发明实施例的组分7的分子量图谱；
图4为根据本发明实施例的无金属芬顿反应和600MPa协同无金属芬顿反应降解果胶分子量的变化图；
图5为根据本发明实施例的600MPa下不同反应添加物降解果胶的分子量变化图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，苹果果胶购自Sigma-Aldrich(Shanghai,China)。
硫酸苯酚法：200μL的样品溶液与100μL 8％的苯酚溶液混合均匀，加入500μL的浓硫酸，测定490nm的吸光值
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
配置50mM的过氧化氢溶液和10mM的抗坏血酸溶液，用氮气曝气30分钟后密封保存。
取12.5mL的过氧化氢溶液、12.5mL的抗坏血酸溶液与12.5mg苹果果胶固体混合均匀，使苹果果胶溶解，装入热封袋中真空封装，该反应体积为25mL，苹果果胶浓度为0.5mg/mL。
在常温高压600MPa条件下，使上述真空封装的苹果果胶溶液在无金属芬顿体系中反应30分钟。
使用10kDa超滤管过滤上述反应结束后的苹果果胶溶液，收集<10kDa的溶液，进行下一步纯化。
使用反相色谱通过Waters制备液系统在XBridge C18(150mm×4.6mm)纯化所得样品，得到组分1和组分2。所述C18色谱条件为，流速：15mL/min，温度：室温，流动相：水(A)和甲醇(B)，梯度洗脱：0-30min，A/B(V/V)：90/10至70/30；检测器：PDA多通道快速紫外-可见光检测器，进样量：1mL。每管收集5mL，收集90个管。
收集的样品通过真空旋转蒸发仪进行浓缩，利用硫酸苯酚法测定总糖浓度，选取组分1冷冻干燥，进行后续步骤，其中，旋转蒸发仪设置温度为40℃。
将C18分离的冻干样品溶于水。用超纯水预平衡DEAE-Sepharose CL 6B(30×2.6cm)。将样品(10mL)装入柱中，并用蒸馏水洗脱500mL。第一阶段收集450min，每一管收集9mL洗脱液，测定每管的总糖含量，第二阶段线性NaCl梯度(0至0.6M，1900mL)洗脱。合并成七个主要的样品(A1-A7)。其中，梯度洗脱流速为1mL/min。
实施例2
利用PMP衍生化的方法，HPLC测定组分中的单糖成分：
用100μL的三氟乙酸(4M)和100μL样品(5mg/mL)混合均匀，氮气吹30min，110℃水解4h，冷却后加入200μL的甲醇溶液，氮气吹扫，此过程重复三次，直至吹干，加入100uL的水复溶。100μL的水解样品和100μL NaOH(0.6M)混合均匀，从中取出50μL的样品，加入50μL的PMP溶液(0.5mol/L甲醇作溶剂)，70℃加热100min，冷却后，加入50μL HCl(0.3M)中和，蒸发干燥。加水1mL复溶，三氯甲烷1mL，萃取分层，取水相，此过程重复三次，过0.22um的水系膜。标准样品与水解样品实验过程一致，在同一条件下同时进行HPLC测定。液相条件：柱子HC-C18,流动相A：0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.7)：乙腈＝85：15(v/v,％)，流动相B：1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.7)：乙腈＝60：40(v/v,％)，流速为1mL/min，温度为25℃，紫外检测为245nm,梯度洗脱，0-10min，100％至90％A，10-30min，90％至80％A，30-45min，80％A，45.01-55min，100％A。结果如图2所示。检测出组分的单糖包括甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。其中，黑色的实心线为组分7，虚线为混合标准品；
组分7平均分子量测定：色谱条件：TSKgel GMPWXL，流动相：水，流速：0.5mL/min，柱温35℃，时间：55min。结果如图3所示，组分7的平均分子量为1kDa左右。
对比例1
取12.5mL的过氧化氢溶液、12.5mL的抗坏血酸溶液与12.5mg苹果果胶固体混合均匀，使苹果果胶溶解，装入热封袋中真空封装，该反应体积为25mL，苹果果胶浓度为0.5mg/mL。
在常温常压下，使上述真空封装的苹果果胶溶液在无金属芬顿体系中反应30分钟，得无金属芬顿反应后的样品。
取上述的无金属芬顿反应+常压处理得到的样品和实施例1中无金属芬顿反应+高压600MPa处理得到的样品进行分子量的测定，色谱条件：TSKgel GMPWXL，流动相：水，流速：0.5mL/min，柱温35℃，时间：55min。
结果如图4所示，超高压的加入有助于果胶降解产生更低分子量的果胶低聚糖(保留时间在20-30min)。
对比例2
实验1、取25mL的水溶解12.5mg苹果果胶固体，得到0.5mg/mL的苹果果胶溶液，装入热封袋中真空封装。
实验2、取12.5mL的抗坏血酸溶液和12.5mL的水与12.5mg苹果果胶固体混合均匀，使苹果果胶溶解，得到0.5mg/mL的苹果果胶溶液，装入热封袋中真空封装。
实验3、取12.5mL的过氧化氢溶液和12.5mL的水与12.5mg苹果果胶固体混合均匀，使苹果果胶溶解，得到0.5mg/mL的苹果果胶溶液，装入热封袋中真空封装。
实验4、取12.5mL的过氧化氢溶液、12.5mL的抗坏血酸溶液与12.5mg苹果果胶固体混合均匀，使苹果果胶溶解，得到0.5mg/mL的苹果果胶溶液，装入热封袋中真空封装。
在常温高压600MPa条件下，分别使实验1-实验4的上述真空封装的苹果果胶溶液在无金属芬顿体系中反应30分钟。
取上述的实验1-实验4处理得到的样品进行分子量的测定，色谱条件：TSKgelGMPWXL，流动相：水，流速：0.5mL/min，柱温35℃，时间：55min。
结果如图5所示，相对于其它几种方法降解果胶，600MPa协同无金属芬顿反应体系能够更加有效的降解果胶，其保留时间(30-40min)的峰面积是远远超过其它几组的峰面。
综上，根据本发明实施例的一种苹果果胶低聚糖的制备方法，通过超高压协同无金属′顿体系降解苹果果胶，再通过膜分离和柱分离可纯化出1kDa左右的低聚糖，其糖成分主要含有甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖醛酸、木糖和鼠李糖。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种苹果果胶低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取过氧化氢溶液、抗坏血酸溶液与苹果果胶固体混合均匀，得到苹果果胶溶液，真空封装；其中，过氧化氢溶液与抗坏血酸溶液的比例为1:1；料液比为1:2mg/mL；
(2)在常温高压600MPa条件下，使上述真空封装的苹果果胶溶液反应30分钟；
(3)将反应结束后的苹果果胶溶液通过10kDa超滤管过滤，收集滤液；
(4)将所述滤液通过C18色谱柱和离子交换柱分离得到组分1-组分7，即制得苹果果胶低聚糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，过氧化氢浓度为50mM，抗坏血酸浓度为10mM。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，先用XBridge C18分离出组分1和组分2，组分1经DEAE-Sepharose CL 6B分离出组分1-7。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，XBridge C18的色谱条件为流速：15mL/min，温度：室温，流动相，水和甲醇，梯度洗脱：0-30min，水/甲醇：90/10至70/30；检测器：PDA多通道快速紫外-可见光检测器，进样量：1mL，每管收集5mL，收集90个管。
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