CN102321716A - 一种阿胶低聚肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种阿胶低聚肽的提取方法，以阿胶为原料用碱性蛋白酶酶解后，再采用中性蛋白酶辅助二次酶解和风味蛋白酶外切和调节风味，膜截留分子量为0.5-15万道尔顿的超滤膜进行超滤和薄膜浓缩精制技术和喷雾干燥得到的阿胶低聚肽产品；本方法操作简便，口感好，成本低，环保高效，非常适合工业化大生产。

Description

一种阿胶低聚肽的制备方法

技术领域

本发明涉及阿胶的深加工技术领域，具体涉及利用生物复合酶酶解阿胶肽的

制备方法。

背景技术

阿胶中主含胶原蛋白（80%），服用方法一般为口服，而食物或药物中的蛋白质一般要被消化液酶解为低聚肽或氨基酸而被机体吸收和利用，而上述适应症人群常见脾胃虚弱或有胃肠道反应，因此消化道酶的活性低，消化能力差，因此口服阿胶不仅会造成患者消化系统的负担，而且也达不到应有的药效。

目前，提取阿胶低聚肽的方法主要有碱液提取法和生物酶解法，前者在提取过程中加入大量的碱处理，既破坏了蛋白质的成分，造成成品苦咸等不良口感，而且对环境造成污染。公开号为CN 102021215A的中国专利申请“一种阿胶肽的提取方法”，公开了100°C煎煮6-8h，然后用碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解6-10h，再用风味蛋白酶酶解8h，酶解过程用氢氧化钠调节PH7-8，再经活性炭脱色，纳滤脱盐浓缩，喷雾干燥的制备方法，该方法操作流程太长，步骤繁琐，不适合工业化生产；胰蛋白酶成本高；控制酶解过程的PH 虽然能略提高得率，但是需要纳滤脱盐，而且纳滤脱盐效果也不显著，影响了成品的得率和风味。公开号为CN101294186A的中国专利申请“阿胶低肽的制备方法”，公开了胃蛋白酶和胰蛋白酶进行水解，再经过，超滤，大孔树脂分离纯化，减压，低温浓缩，干燥的制备方法，该方法步骤繁琐，不适合工业化生产，而且采用低温浓缩影响产品的质量。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的酶解液苦，咸味和分子量大，分子量分布不集中，成本高的缺陷，提供了一种阿胶低聚肽的提取方法，以阿胶为原料用碱性蛋白酶酶解后，再采用中性蛋白酶辅助二次酶解和风味蛋白酶外切和调节风味，膜截留分子量为0.5-15万道尔顿的超滤膜进行超滤和薄膜浓缩精制技术和喷雾干燥得到的阿胶低聚肽产品；本方法操作简便，口感好，成本低，环保高效，非常适合工业化大生产。

为了实现上述技术目的，本发明采取以下技术措施：

一种阿胶肽的制备方法，其步骤如下：

1.    以阿胶为原料，粉碎过60-100目筛，加入原料重量8-12倍的纯水搅拌均匀，85-100°C钝化脂肪酶30min-60min;

2.  冷却至40-60°C，按原料阿胶的重量的1-3%的比率加入碱性蛋白酶，40-70°C恒温酶解2-4h,再分别按原料阿胶的重量的0.5-1.5%中性蛋白酶和0.25-1%的风味蛋白酶，搅拌酶解2-4h,将得到的酶解液升温至85-100°C，灭酶15-30min;

3.  将酶解液离心后过滤，上清液经过中空超滤膜，卷式膜或管式膜精制分离，膜截留分子量为0.5-15万道尔顿的超滤膜，进口压力为1.8-3bar，出口压力1-2bar,酶解液温度为20-30°C进行超滤分离，薄膜浓缩，喷雾干燥即得到阿胶低聚肽成品。

本发明原料阿胶为马科动物驴Equus asinus L.及其他驴皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，性味甘，平，归肺、肝、肾经，功能补血滋阴，润燥，止血，主治血虚萎黄，眩晕，心悸，多种出血证，阴虚证及燥证。

本发明方法的优点和有益效果体现在：

1.  本发明方法生产的阿胶低聚肽产品的纯度高，分子量集中，其中1000-160道尔顿80%以上。

2.  本发明生产出来的阿胶低聚肽的分子量小而且集中，人体容易吸收。

3.  本发明有效避开了化学手段处理所带来的环境污染即对人体危害的问题。

4.  本方法避免了调节PH，纳滤脱盐工序，减少了工业成本，改善了成品的风味，提高了低聚肽的得率。

5.  本发明的生产周期短，操作简便，成本低，产品质量可靠，安全无毒副作用，可广泛用于保健品、药品等领域。

具体实施方式

实施例1

称取粉碎并过80目筛的东阿阿胶20kg，加入蒸馏水160kg，搅拌均匀后，升温至85°C钝化脂肪酶30min；冷却至60°C，加入碱性蛋白酶400g,搅拌酶解2.5h后,加入200g中性蛋白酶，100g风味蛋白酶，55°C搅拌酶解3h,然后升温至100°C，灭酶15min；冷却至室温，4000r/min离心20min,收集上清液，上清液经卷式膜超滤，膜截留分子量为3万，收集超滤液，超滤液经薄膜浓缩，浓缩液经喷雾干燥，得到10.82kg粉末（微黄色）。

阿胶低聚肽含量测定

1．方法提要

低分子量的蛋白质水解物（包含肽类及游离氨基酸）可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质物质，测定出离心清液中的酸溶蛋白质含量，清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为低聚肽的含量。

2．分析步骤

2.1 酸溶蛋白质含量的测定

称取2g（精确至1mg）样品，加入至10mL容量瓶中，用15%三氯乙酸溶液定容，混合均匀，静置10min。将样品溶液在4000rpm下离心10min后，取全部清液，按GB/T 5009.5规定的方法测定清液中的酸溶蛋白质，蛋白质换算系数为6.25。检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。

2.2 游离氨基酸含量的测定

样品前处理：称取20～30mg样品，精确到0.0001g，用3％磺基水杨酸溶液溶解均匀。将样品溶液转移至50ml容量瓶中，定容。将样品溶液在转速为4000r/min离心机上离心5min得清液，再用0.45μm微孔滤膜过滤清液，将滤液转移至50ml容量瓶中，定容后作为仪器检测用样品。其余操作同GB 12292水果、蔬菜汁 游离氨基酸含量的测定规定的方法。

2.3 结果的表述

低聚肽的含量                                                

按式（1）计算：

……………………………………………………（1）

式中：  

——样品中低聚肽含量（以干基计），%；

——样品中酸溶蛋白质含量（以干基计），%；

——样品中游离氨基酸含量（以干基计），%。

2．4测定结果

测定成品中低聚肽的含量，结果见表1。

表1肽粉中低聚肽的含量测定结果

样品	阿胶低聚肽
		低聚肽含量	86.2%

3.相对分子质量小于1000的肽所占比例(高效凝胶过滤色谱法)

3.1方法提要

采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件（即GPC软件），对色谱图及其数据进行处理，计算得到低聚肽的相对分子质量大小及分布范围。

3.2试剂

乙腈：色谱纯；三氟醋酸：分析纯；水：超纯水或二次蒸馏水。

相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素C（cyyochrome,MW12500）；抑酞酶（aprotinin,MW6500）；杆菌酶（bacitracin,MW1450）；乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451）；乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW189）。

3.3仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；流动相真空抽滤脱气装置；超声波振荡器；分析天平：感量0.0001g。

3.4色谱条件与系统适应性实验

色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱；流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1（体积比）检测波长：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数（N）按三肽标准品（乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸）峰计算不低于5000，低聚肽的分配系数（Kd）应在0～1之间。

3.5相对分子质量校正曲线制作

分别用流动相配制成0.1%（W/V）的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数（lgMW）对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

3.6样品制备

称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。

3.7相对分子质量的计算

将3.6 制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000以下的肽的峰面积相对百分比之和。

3.8测定结果

阿胶低聚肽分子量分布范围测定结果见表6，7。

表2、阿胶低聚肽分子量分布结果

分子量范围	开始时间min	结束时间min	重均分子量	峰面积%（λ220nm）
					1000-10000	13.896	18.985	1511	8.22
500-1000	18.985	20.620	672	27.11
					140-500	20.620	23.289	306	61.35
70-140	23.289	24.802	98	3.32

以上结果表明，海洋胶原肽和大豆肽分子量主要集中在140-1000，占70%以上。

实施例2

称取粉碎并过60目筛的东阿阿胶30kg，加入蒸馏水240kg，搅拌均匀后，升温至100°C钝化脂肪酶60min；冷却至60°C，加入碱性蛋白酶300g,搅拌酶解4h后,加入150g中性蛋白酶，75g风味蛋白酶，70°C搅拌酶解3h,然后升温至100°C，灭酶15min；冷却至室温，4000r/min离心20min,收集上清液，上清液经中空超滤膜超滤，膜截留分子量为15万，收集超滤液，超滤液经薄膜浓缩，浓缩液经喷雾干燥，得到15.95kg粉末。

实施例3

称取粉碎并过100目筛的东阿阿胶10kg，加入蒸馏水120kg，搅拌均匀后，升温至100°C钝化脂肪酶60min；冷却至40°C，加入碱性蛋白酶300g,搅拌酶解4h后,加入150g中性蛋白酶，25g风味蛋白酶，40°C搅拌酶解3h,然后升温至100°C，灭酶15min；冷却至室温，4000r/min离心20min,收集上清液，上清液经管式膜超滤，膜截留分子量为0.5万，收集超滤液，超滤液经薄膜浓缩，浓缩液经喷雾干燥，得到6.16kg粉末。

Claims (3)

1. 一种阿胶低聚肽的制备方法，包括原料阿胶酶解、浓缩、干燥，其特征在于：用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解，酶解液进行超滤。

2.根据权利要求1所述的甲鱼低聚肽的制备方法，其特征在于：碱性蛋白酶加入量为原料阿胶重量的1-3%，酶解2-4h，再加入原料阿胶重量0.5-1.5%的中性蛋白酶和0.25-1%的风味蛋白酶，恒温酶解2-4h后，酶解液升温至85-100°C，灭酶15-30min。

3.根据权利要求1所述的阿胶低聚肽的制备方法，其特征在于：超滤选用膜截留分子量为0.5-15万道尔顿的中空超滤膜或卷式膜或管式膜。