CN115836092A - 玉米湿磨中改善的纤维洗涤 - Google Patents

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CN115836092A CN202180048288.8A CN202180048288A CN115836092A CN 115836092 A CN115836092 A CN 115836092A CN 202180048288 A CN202180048288 A CN 202180048288A CN 115836092 A CN115836092 A CN 115836092A
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Abstract

披露了一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括在纤维洗涤步骤期间使碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的SO2和有效量的一种或多种水解酶接触，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。

Description

玉米湿磨中改善的纤维洗涤
技术领域
本发明涉及一种在湿磨工艺(优选在纤维洗涤期间)中通过使玉米籽粒与包含木聚糖酶和/或纤维素酶的酶组合物接触来改善/提高来自所述玉米籽粒的淀粉和/或谷蛋白(gluten)产率的方法。
背景技术
常规的玉米湿磨是一种设计用于淀粉和几种副产物(包括胚芽、谷蛋白(蛋白质)和纤维)的回收和纯化的工艺。纤维是价值最低的副产物，因此工业已经投入大量精力来增加更有价值的产物(如淀粉和谷蛋白)的产率，同时减少纤维级分。高品质淀粉是有价值的，因为它可以在进一步加工成如干燥的淀粉、改性淀粉、糊精、甜味剂和醇等产物后用于各种商业目的。谷蛋白通常用于动物饲料，如玉米谷蛋白粉(约60％蛋白质)或玉米谷蛋白饲料(约20％蛋白质)。
该湿磨工艺取决于具体使用的研磨设备可以显著变化，但该工艺通常包括：谷物清洁、浸渍、碾磨、胚芽分离、第二次碾磨、纤维分离、谷蛋白分离和淀粉分离。在清洁玉米籽粒后，典型地通过在受控制的时间和温度条件下浸泡在水中或在稀释的SO2溶液中使它们软化。然后，碾磨籽粒以分解果皮，并将胚芽与籽粒的其余部分分离。剩余的浆液，主要由纤维、淀粉和谷蛋白组成，在纤维洗涤过程中进行精细碾磨和筛选，以将纤维从淀粉和谷蛋白分离，然后分离谷蛋白和淀粉，并且可以在洗涤/过滤过程中纯化淀粉。
已经建议在湿磨工艺的几个步骤中使用酶，比如使用酶用于湿磨工艺的浸渍步骤。已经示出，商业酶产品
Figure BDA0004040190000000011
(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨工艺的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种经修饰的湿磨工艺，其使用蛋白酶以在玉米湿磨期间显著减少总的加工时间并消除对作为加工剂的二氧化硫的需求。Johnston等人,Cereal Chem[谷物化学],81,第626-632页(2004)。
US 6,566,125披露了用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液，以及将碾磨的玉蜀黍浆液与酶(例如，蛋白酶)一起孵育。
US 5,066,218披露了研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洁谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，然后用纤维素酶研磨谷物。
WO 2002/000731披露了处理作物籽粒的工艺，该工艺包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒，以及用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。
WO 2002/000911披露了淀粉谷蛋白分离的工艺，该工艺包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。
WO 2002/002644披露了洗涤获得自研磨工艺的淀粉谷蛋白分离步骤的淀粉浆液的工艺，该工艺包括用包含有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。
WO 2014/082566和WO 2014/082564披露了用于在湿磨中使用的纤维素分解组合物。
WO 2016/095856披露了包含木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合物以及这些组合物在玉米湿磨工艺中的纤维洗涤中的用途。
WO 2019/023222披露了一种在纤维洗涤步骤中与纤维素酶组合应用GH5木聚糖酶和GH30木聚糖酶的湿磨工艺。
WO 2017/088820披露了一种通过在纤维洗涤步骤中单独添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(GH62)或与木聚糖酶(GH10)组合来改善玉米湿磨中从纤维中释放淀粉的工艺。
WO 2018/053220披露了一种作为湿磨工艺的一部分的纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统经优化为通过使用专用的空间/槽进行酶孵育以在纤维洗涤步骤中应用酶。
尽管本领域已经研究了在玉米湿磨中使用酶的效果，但是在玉米籽粒的浸渍/浸泡期间、在玉米籽粒的碾磨期间和在淀粉谷蛋白分离期间，仍然需要改善的技术，其可以降低与玉米湿磨相关的能量支出和成本并且提供增加的淀粉和谷蛋白的产率。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括在纤维洗涤步骤期间使碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的SO2和有效量的一种或多种水解酶接触，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
定义
酶的定义：
具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的阿拉伯呋喃糖苷酶/多肽：术语“阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,2)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme InternationalIreland,Ltd.)，布瑞公司(Bray,Co.)，爱尔兰威克洛郡(Wicklow,Ireland))以总体积200μl在40℃持续30分钟，接着通过
Figure BDA0004040190000000031
HPX-87H柱色谱法(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)的伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行阿拉伯糖分析来确定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。阿拉伯呋喃糖苷酶可以在例如根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases[更新糖基水解酶的基于序列的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的GH43、GH62、GH51家族中找到。
具有β-葡糖苷酶活性的β-葡糖苷酶/多肽：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人,2002,J.BasicMicrobiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃，pH 4.8下，在含有0.01％
Figure BDA0004040190000000041
20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
具有β-木糖苷酶活性的β-木糖苷酶/多肽：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。可以在含有0.01％
Figure BDA0004040190000000042
20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％
Figure BDA0004040190000000043
20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
具有纤维二糖水解酶活性的纤维二糖水解酶/多肽：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维低聚糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从该链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。可以根据由以下所述的程序来确定纤维二糖水解酶活性：Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；vanTilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581。
具有纤维素酶活性或纤维素分解活性的纤维素分解酶或纤维素酶/多肽：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，几种)水解纤维素材料的酶，该材料包括任何包含纤维素(比如纤维)的材料。纤维素分解酶包括一种或多种内切葡聚糖酶(E.C3.2.1.4)、一种或多种纤维二糖水解酶(E.C 3.2.1.91和E.C 3.2.1.150)、一种或多种β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解期间，糖的产生/释放的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)(或其他预处理的纤维素材料)中的纤维素，在适合的温度(比如40℃-80℃，例如，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)，以及在适合的pH(比如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解进行比较。典型的条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
Figure BDA0004040190000000061
HPX-87H柱色谱法(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐实验室有限公司)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原性糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases[更新糖基水解酶的基于序列的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。GH61多肽最近被归类为溶解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人,2011,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)，并且被称为“辅助活性9”或“AA9”多肽。
具有水解酶活性的水解酶(hydrolytic enzyme)或水解酶(hydrolase)/多肽：“水解酶”是指使用水分解底物的任何催化蛋白。水解酶包含纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)、纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。
具有木聚糖酶活性的木聚糖酶/多肽：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％
Figure BDA0004040190000000071
X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。木聚糖酶可见于例如GH5、GH30、GH10和GH11家族中。
GH5多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族5的成员(http://www.cazy.org/)。
GH8多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族5的成员(http://www.cazy.org/)。
GH30多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族30的成员(http://www.cazy.org/)。
GH10多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在http://www.cazy.org/上可获得的碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族10的成员。(Lombard,V.；Golaconda Ramulu,H.；Drula,E.；Coutinho,P.M.；Henrissat,B.(2013年11月21日).“Thecarbohydrate-active enzymes database(CAZy)in 2013”[2013年碳水化合物活性酶数据库(CAZy)].Nucleic Acids Research[核酸研究].42(D1):D490-D495；Cantarel BL,Coutinho PM,Rancurel C,Bernard T,Lombard V,Henrissat B(2009年1月).“TheCarbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):an expert resource forGlycogenomics”[碳水化合物活性酶数据库(CAZy)：糖基因组学专家资源].Nucleic AcidsRes.[核酸研究]37(数据库期号):D233-8)。
GH11多肽是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族11的成员。
GH62多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族62的成员。
GH43多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族43的成员。
GH51多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族51的成员。
其他定义：
在本上下文中，术语以对于技术人员而言是普通的方式使用。其中一些术语如下阐明：
接触时间：对于一种或多种酶与底物反应，该一种或多种酶必须与该底物接触。“接触时间”是指有效量的一种或多种酶与至少一部分底物物质接触的时间段。在接触时间期间，酶可以不与所有底物物质接触，然而将一种或多种酶与底物物质混合允许在接触时间期间酶催化水解一部分底物物质的潜力。
玉米籽粒：已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉蜀黍、甜玉米、糯玉米等。
一些玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。
玉米籽粒或玉米籽粒的级分：此术语用于描述湿磨工艺中的玉米籽粒。当玉米籽粒被分解和加工时，使用该术语时，玉米籽粒的所有分级部分应视为包括在内。该术语包括例如：浸泡的籽粒、碾磨的籽粒、玉米籽粒物质、第一级分、第二级分、玉米籽粒物质的一个或多个级分等。
玉米籽粒物质：优选地用于引用包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质，优选地通过汽蒸和碾磨作物籽粒并从胚芽中分离包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质来实现。当玉米籽粒物质移动通过纤维洗涤时，它被分离成几个级分，包括第一级分(s)和第二级分(f)。因此，“玉米籽粒物质的级分”和“玉米籽粒物质的一个或多个级分”尤其是指这些第一级分(s)和第二级分(f)。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽，其中该片段具有果胶裂解酶活性。
胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。被胚芽覆盖或包围的胚乳包含约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白质来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。
谷蛋白：谷蛋白是由两种更小的蛋白质—麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成的蛋白质。本文“谷蛋白”是指在玉米籽粒中发现的大多数蛋白质。来自玉米湿磨的谷蛋白的主要产物是玉米谷蛋白粉(大约60％蛋白质)和玉米谷蛋白饲料(大约20％蛋白质)。
碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”是指将玉米籽粒分解成更小的组分。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
孵育时间：玉米籽粒物质的一个或多个级分在纤维洗涤期间与水解酶接触而未经过筛选的时间。
在许多优选的实施例中，根据本发明的方法利用包含空间(V)或“培养箱”的系统，在该系统内材料通过酶而“留下被影响”，并且在这种情况下，孵育时间可以通过以下确定：
Figure BDA0004040190000000111
可替代地，如果流入至培养箱以每时间单位的体积表示：
Figure BDA0004040190000000112
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同C末端和/或N末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以生产不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
研磨设备：“研磨设备”是指粉碎机上使用的所有设备。湿磨工艺将取决于可用的研磨设备而变化。研磨设备的实例可以是浸渍罐、蒸发器、螺旋压榨机、旋转干燥机、脱水筛网、离心机、水力旋流器等。每个研磨设备/研磨线的尺寸和数量可以在不同的粉碎机上变化，这将影响研磨过程。例如，纤维洗涤筛网单元的数量可以变化，离心机的尺寸也可以变化。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
保留时间：在纤维洗涤程序中允许一种或多种水解酶和玉米籽粒或玉米籽粒的级分反应的时间。
在一些实施例中，保留时间是在再次离开纤维洗涤系统之前，在第一筛网单元(S1)中接收的玉米籽粒物质及其一个或多个级分与有效量的一种或多种水解酶接触的时间段。在保留时间期间，玉米籽粒物质的一个或多个级分在空间(V)中与一种或多种水解酶孵育，然后离开纤维洗涤系统，作为来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)的一部分或作为来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)的一部分。
保留时间可以优选地估计为固形物在如本发明所定义的纤维洗涤系统中花费的平均持续时间。这可以通过以下关系估计：
Figure BDA0004040190000000131
可替代地，如果流入至系统以每时间单位的体积表示：
Figure BDA0004040190000000132
系统的体积典型地设定为等于系统中所有空隙的体积之和；然而，由于系统中的管道典型地做得很小，其可能优选地忽略管道的体积。
筛选的：术语“筛选的”(“screened”或“screening”)是指将玉米籽粒物质分离成第一级分s和第二级分f以及将这些级分从一个筛网单元移动到另一个筛网单元的过程。非筛选期是提供用于将玉米籽粒物质或其级分与酶一起孵育的非分离期。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选3.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用6.1.0版本。
所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖
构成、由广泛出现在植物组织中的呈储藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。
浸渍或浸泡：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO2浸泡作物籽粒。
具体实施方式
本发明的一个目的是提供一种改善来自玉米湿磨工艺的淀粉和谷蛋白产率的方法。
特别是，本发明的目的是提供一种用于在湿磨工艺中、优选在纤维洗涤程序期间通过用水解酶组合物处理纤维级分来改善可从玉米籽粒获得的淀粉和/或谷蛋白产率的方法。本发明的发明人已经出人意料地发现，在至少一种木聚糖酶和/或纤维素酶以及有效量的SO2存在下对玉米纤维进行酶处理，增加了从纤维中结合的淀粉和谷蛋白的释放，并因此改善了可获得的淀粉和/或谷蛋白产率。
湿磨工艺：
将玉米籽粒湿磨以打开籽粒并将这些籽粒分成其四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维和谷蛋白。
湿磨工艺可以在研磨间显著变化，然而常规的湿磨通常包括以下步骤：
1.浸渍
2.碾磨
3.分离成包含以下的流：
i)胚芽；ii)纤维，iii)淀粉和谷蛋白
4.洗涤纤维、加压并干燥
5.淀粉/谷蛋白分离，以及
6.洗涤淀粉。
浸渍、碾磨并分离胚芽
玉米籽粒通过在约50℃、比如在约45℃至60℃之间的温度下在水中浸泡持续约30分钟至约48小时、优选30分钟至约15小时、比如约1小时至约6小时来软化。在浸泡期间，籽粒吸收水分，其水分含量从15％增加至45％，并且大小增加一倍以上。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中过度生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的谷蛋白键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，通过碾磨使它们裂开以释放胚芽。胚芽含有玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在严格受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、谷蛋白和纤维的密度较重的混合物(玉米籽粒物质包含纤维、淀粉和谷蛋白)分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。随后，可对胚芽进行干燥并且提取油。
包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质随后例如在纤维洗涤步骤中分离成纤维、淀粉和谷蛋白级分。
洗涤纤维、加压并干燥
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。在筛选(洗涤)期间将游离淀粉和谷蛋白与纤维分离，并作为研磨淀粉收集。然后加压剩余的纤维以降低水含量。
分离淀粉谷蛋白
将淀粉-谷蛋白悬浮液以及从纤维洗涤步骤释放的其他淀粉谷蛋白(称为研磨淀粉)分离成淀粉和谷蛋白。与淀粉相比，谷蛋白具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出谷蛋白。
洗涤淀粉
来自淀粉分离步骤的淀粉浆液含有一些不溶性蛋白和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其去除。在水力旋流器中，将仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以去除最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。
湿磨的产物：可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浸出液、玉米谷蛋白饲料、胚芽、玉米油、玉米谷蛋白粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(比如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。
本发明的一个方面提供了在湿磨工艺中增加可以从玉米籽粒获得的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括：将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自由以下组成的组：木聚糖酶多肽、和/或纤维素酶多肽或其组合。
玉米籽粒或玉米籽粒级分中的一些淀粉和/或谷蛋白可以与纤维级分结合，并且在湿磨工艺期间从未释放。然而，添加水解酶(其可以包括任何可以使用水分解玉米籽粒中存在的底物的催化蛋白)可以释放一些结合的淀粉和/或谷蛋白，从而提高在湿磨工艺中淀粉和/或谷蛋白的总产率。
本发明人已经出人意料地发现，将水解酶比如纤维素酶和木聚糖酶加入碾磨的籽粒物质的富含纤维的级分中(特别是在纤维洗涤步骤中)的效果可在升高的SO2水平下得到增强。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使碾磨的玉米籽粒或碾磨的籽粒的级分(特别是富含纤维的级分)与有效量的SO2和有效量的一种或多种水解酶接触，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。优选地，接触在纤维洗涤步骤期间进行。
在一个实施例中，本发明的方法使得与不存在/添加SO2的工艺相比，在该湿磨工艺期间从纤维中释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
在湿磨工艺中使用的具体程序和设备可以变化，但是该工艺的主要原理保持不变(参见湿磨工艺的说明)。
在一个特定实施例中，本发明的方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)使所得包含纤维的玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序，从而分离淀粉、谷蛋白和纤维；
其中至少一种木聚糖酶和/或纤维素酶和有效量的SO2在步骤d)之前或期间存在/添加。
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维级分中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。收集纤维，并使其成浆液并过筛，通常在浸泡、碾磨和从玉米籽粒中分离出胚芽之后，以回收玉米籽粒物质中任何残留的淀粉或谷蛋白。该加工在本文中称为纤维洗涤程序。
在一个优选的实施例中，在使玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序的步骤期间，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的富含纤维的级分与所述一种或多种水解酶混合。
根据本发明，为了在纤维洗涤步骤期间使水解酶的效果最大化，当在纤维洗涤期间存在有效量的SO2时观察到增强效果。通常在浸泡籽粒的步骤中加入SO2，然而，在下游步骤中，比如在纤维洗涤步骤中，SO2水平将降至低于如本方法所要求的水平。
在一个实施例中，SO2在纤维洗涤期间以至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm的量存在/添加。
在另一个实施例中，SO2在纤维洗涤期间以400ppm至3000ppm、500ppm至2000ppm、600ppm至1500ppm、比如600ppm至1200ppm范围内的量存在/添加。
在纤维洗涤程序中使用的具体设备可以变化，但是该工艺的主要原理保持不变。WO 2018/053220描述了一种纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包括专用的酶孵育空间/槽。基于本披露和本领域技术人员的一般知识，设计一种为水解酶发挥作用提供足够的孵育时间的纤维洗涤系统将是可能的。在一个实施例中，允许所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分(例如，富含纤维的级分)与所述一种或多种水解酶反应至少15分钟，比如至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟。
在一个实施例中，所述纤维洗涤程序包含为引入一种或多种水解酶而优化的纤维洗涤系统，其中纤维洗涤系统包含空间(V)，该空间(V)被配置为在该纤维洗涤系统中提供以下总反应时间(保留时间)：至少35分钟(如至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。在一个实施例中，在纤维洗涤系统中的总保留时间在35分钟和48小时之间，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和12小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间、在1-48小时之间、在1-24小时之间、在1-12小时之间、在1-6小时之间、在1-5小时之间、在1-4小时之间、在1-3小时之间、在1-2小时之间。
在一个实施例中，该纤维洗涤系统包含：
-多个筛网单元(S1……S4)，这些筛网单元以逆流洗涤配置流体连接；每个筛网单元被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分(s)和第二级分(f)，所述第二级分(f)含有与第一级分(s)相比，以wt％测量的更高量纤维；
-空间(V)安排在系统中并且流体连接以接收所述第一级分(s)，所述第二级分(f)，或混合的第一和第二级分(s，f)，优选地仅第二级分(f)，并配置成为在空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或两个级分导出到下游筛网单元(S4)，
其中该系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元(S1)
-将来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)作为含有淀粉的产物流导出，
-导入工艺用水，优选地设置用于将工艺用水导入最下游筛网单元(S4)，
-将来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白。
-将水解酶引入该系统中。
在一个实施例中，在配置成纤维洗涤系统中的所述空间(V)中的孵育时间为至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的孵育时间在35分钟和48小时之间，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间、在1-48小时之间、在1-24小时之间、在1-12小时之间、在1-6小时之间、在1-5小时之间、在1-4小时之间、在1-3小时之间、在1-2小时之间。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的该孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，比如在46℃和52℃之间。
此外，空间的尺寸(以m3为单位)优选地被配置成提供至少至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟、至少120分钟)的孵育时间。
指定用于孵育的空间(V)优选地具有至少30m3、至少40m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、或至少500m3的体积。孵育时间也可以在多于一个的空间V中，具有至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3的总体积或组合的体积。
在孵育时间期间，优选的不筛选在空间V中接收的流体。因此，离开空间V的流体具有相同的成分，例如淀粉和纤维作为在空间V中接收的流体，尽管它优选地含有更高比例的已从纤维中释放的淀粉。
为了确保酶和纤维之间的紧密接触，可以优选将空间V配置成用于搅拌在所述空间V中含有的物质，比如通过包含转子或叶轮。
优选将空间V布置在最上游的筛网单元S1的下游和所述最下游的筛网单元S4的上游；特别地，将空间V布置成将流体馈送入第二最下游的筛网单元S3中。
适用于本发明的方法的水解酶
在一个实施例中，适合用于在本发明的方法中使用的水解酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)、纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)以及蛋白酶(E.C 3.4)。
在一个实施例中，该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
在另一个实施例中，这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。这些纤维素酶可以至少选自由以下组成的组：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。更特别地，该一种或多种纤维素酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
在一个实施例中，这些水解酶进一步包含阿拉伯呋喃糖苷酶。阿拉伯呋喃糖苷酶可以选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽、GH51多肽、特别是GH62多肽。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，如里氏木霉。根据这些实施例，根据本发明定义的木聚糖酶和或阿拉伯呋喃糖苷酶多肽与来自木霉属(Trichoderma)的内源纤维素酶一起表达。
在一个实施例中，包含一种或多种水解酶的酶组合物可以包含在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的纤维素酶和其他以纯化或半纯化形式添加到酶组合物中的水解酶。
在一个实施例中，一种或多种水解酶是纯化的。这些纯化的酶可用于本发明其他实施例中所述的酶组合物中。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在液体组合物中。组合物可为均匀的或不均匀的。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在固体组合物中。
在一个实施例中，与所述玉米籽粒物质的一个或多个级分混合的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白(EP)/公吨(MT)进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间，如0.010-0.5kg EP/MT玉米籽粒之间，如0.05-0.5kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.5kg/MT之间、或0.1-0.5kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.01-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.1-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.01-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.3kg/MT之间或0.1-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.010-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.2kg/MT之间、或0.1-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或如0.075-0.10kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.11kg/MT玉米籽粒之间。
在优选的实施例中，酶组合物包含获得自里氏木霉培养物的纤维素酶，如里氏木霉ATCC 26921的培养物。适合的纤维素酶是可获得的；例如来自诺维信公司，商品名为
Figure BDA0004040190000000231
具有木聚糖酶活性的多肽
木聚糖酶适合应用于根据本发明的方法中。木聚糖酶多肽可以选自家族GH5、GH10、GH30、GH11和GH8。
更多具体实施例涉及根据本发明的方法，其中GH5木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
在一个实施例中，该成熟多肽为SEQ ID NO:1的氨基酸25至551。
另一个具体实施例涉及根据本发明的方法，其中GH10木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
在一个实施例中，该成熟多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸21至405。
另一个具体实施例涉及根据本发明的方法，其中GH10木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
在一个实施例中，该成熟多肽为SEQ ID NO:4的氨基酸20至319。
具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽
另一个具体实施例涉及根据本发明的方法，其中GH62阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
在一个实施例中，该成熟多肽为SEQ ID NO:3的氨基酸17至325。
具有木聚糖酶活性的多肽的来源
具有木聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株生产的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，比如具有果胶裂解酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽，或革兰氏阴性细菌多肽，比如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一方面，该多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一方面，该多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
该多肽可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，比如假丝酵母属(Candida)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽，比如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)例如黑曲霉(Aspergillus niger)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)例如莱色篮状菌(Talaromyces leycettanus)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)多肽。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，比如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提及的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。
酶组合物
用于根据本发明的方法中的酶组合物可包含木聚糖酶多肽作为主要酶促组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可包含多种酶活性，比如一种或多种(例如，几种)选自由以下组成的组的酶：纤维二糖水解酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。
在以下编号实施例中进一步披露本发明。
实施例1.一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括在纤维洗涤步骤期间使碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的SO2和有效量的一种或多种水解酶接触，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
实施例2.如实施例1所述的方法，其中与不存在/添加SO2的工艺相比，在该湿磨工艺期间从纤维中释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
实施例3.如前述实施例中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；
d)使所得包含纤维的玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序，从而分离淀粉、谷蛋白和纤维；
其中至少一种木聚糖酶和/或一种或多种纤维素酶和有效量的SO2在步骤d)之前或期间存在/添加。
实施例4.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤步骤(d)期间以至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm的量存在/添加。
实施例5.如实施例1至4中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤期间以400ppm至3000ppm、500ppm至2000ppm、600ppm至1500ppm、比如600ppm至1200ppm范围内的量存在/添加。
实施例6.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
实施例7.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含一种或多种纤维素酶，特别是从木霉属、更特别是从里氏木霉获得的纤维素酶。
实施例8.如实施例7所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。
实施例9.如实施例8所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
实施例10.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些水解酶进一步包含阿拉伯呋喃糖苷酶。
实施例11如实施例10所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽和GH51多肽。
实施例12.如实施例3至9中任一项所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包括使用纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包括被配置为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟且小于48小时的总保留时间的空间(V)/槽。
实施例13.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在配置于该纤维洗涤系统中的所述空间(V)/槽中的该孵育时间为至少5分钟且小于48小时，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间。
实施例14.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，优选在46℃和52℃之间。
实施例15.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与其中SO2水平低于400ppm的方法相比，在纤维洗涤期间存在/添加的SO2水平导致淀粉和谷蛋白的提取产率相同，同时减少了水解酶和碾磨的玉米籽粒物质之间所需的接触时间。
实施例16.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，比如里氏木霉。
实施例17.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶是纯化的。
实施例18.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在液体组合物中。
实施例19.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在固体组合物中。
实施例20.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与所述碾磨的玉米籽粒物质的一个或多个级分混合/接触的一种或多种水解酶的有效量在0.005kg至0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间。
实施例21.如前述实施例中任一项所述的方法，其中SO2的来源为焦亚硫酸钠(Na2S2O5)和/或添加的SO2气体。
实施例22.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
实施例23.如实施例22所述的多肽，其中该成熟多肽为SEQ IDNO:1的氨基酸1至551。
实施例24.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
实施例25.如实施例24所述的多肽，其中该成熟多肽为SEQ IDNO:2的氨基酸21至405。
实施例26.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
实施例27.如实施例26所述的多肽，其中该成熟多肽为SEQ IDNO:3的氨基酸17至325。
实施例28.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
实施例29.如实施例28所述的多肽，其中该成熟多肽为SEQ IDNO:4的氨基酸20至319。
实施例30.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素酶来源于里氏木霉。
本发明进一步通过以下实例予以举例说明。
实例
酶：
GH5木聚糖酶A：GH5木聚糖酶来源于金黄杆菌属物种-10696，并且披露为SEQ IDNO:1
纤维素酶A：一种来源于里氏木霉的全纤维素酶。该纤维素酶组合物将包含在里氏木霉(T.reesei)中表达的所有纤维素酶活性；例如，内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。
实例1：
10-g纤维测定通过以下进行：使用包括纤维素酶A和GH5木聚糖酶的共混物，与400ppm或800ppm亚硫酸氢盐(HSO3 -)结合，用5％纤维干物质以每克纤维干物质200μg或300μg酶蛋白的剂量在pH 4.0、50℃下孵育150分钟。共混物由基于酶蛋白的8％ GH5木聚糖酶A和92％纤维素酶A组成。在Na2S2O5+H2O->2Na++2HSO3 -反应后，将焦亚硫酸钠(Na2S2O5)加入缓冲液中，生成亚硫酸氢盐。作为比较，包括低剂量(200μg EP/g-ds纤维)和高剂量(300μgEP/g-ds纤维)两者的仅含有92％纤维素酶A和8％ GH5木聚糖酶A(无SO2)的共混物。在纤维测定中，将具有17.77％残留淀粉和9.88％残留蛋白质的玉米纤维用作底物。测量淀粉+谷蛋白(干物质)以及单个蛋白质在以下指定处理下从玉米纤维中的释放。
表1.经过和不经过酶处理的淀粉和谷蛋白产率
Figure BDA0004040190000000331
因此，在纤维素酶A+GH5木聚糖酶A的基础上加入亚硫酸氢盐，可显著提高玉米湿磨工艺中淀粉+谷蛋白以及蛋白质的产率。
实例2.
10-g纤维测定通常包括在酶存在下，在与工艺相关的条件(pH 4，温度约50℃)下孵育从湿磨植物获得的湿纤维样品，并且孵育时间在1小时和4小时之间。孵育后，将纤维转移并压过75微米筛网，然后收集主要由分离的淀粉和谷蛋白组成的滤液。在筛上进行多次洗涤，并且将洗涤液与初始滤液一起收集。允许收集的滤液静置过夜，从而使不溶物沉降在烧瓶底部。通过真空吸出大部分上清液，然后将剩余的不溶物在50ml锥形管中离心，之后倾析上清液，留下湿的不溶性沉淀物。将湿的不溶性沉淀物冻干过夜至完全干燥。对该不溶性干物质称重以确定不溶性物质的产率百分比，然后通过Leco分析法来分析总氮含量(蛋白质)。
该10-g纤维测定通过以下进行：使用包括纤维素酶A和GH5木聚糖酶A的共混物，用6.4％纤维干物质以每克纤维干物质5000μg酶蛋白的剂量在pH 4.0、48℃下孵育240分钟。该共混物由基于酶蛋白的10％ GH5木聚糖酶A和90％纤维素酶A组成。该共混物在按原样底物和在混合器中剪切(均质化)3分钟的底物两者中进行检测。在具有和不具有1000ppm SO2(从溶于50ml水中的1.48g偏硫酸氢钠的20倍稀释液添加)的条件下用酶共混物处理均质化底物，并且进行无酶处理。在具有和不具有1000ppm SO2的两种条件下用酶共混物处理按原样底物，同时在具有和不具有1000ppm SO2的情况下进行两次无酶处理。由特定处理所释放的不溶性物质(淀粉和谷蛋白)和不溶性蛋白质(谷蛋白)的重量如下所示。
表2.结果
Figure BDA0004040190000000341
Figure IDA0004040191030000011
Figure IDA0004040191030000021
Figure IDA0004040191030000031
Figure IDA0004040191030000041
Figure IDA0004040191030000051
Figure IDA0004040191030000061
Figure IDA0004040191030000071
Figure IDA0004040191030000081
Figure IDA0004040191030000091
Figure IDA0004040191030000101
Figure IDA0004040191030000111

Claims (30)

1.一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括在纤维洗涤步骤期间使碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的SO2和有效量的一种或多种水解酶接触，其中所述水解酶中的至少一种水解酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中与不存在/添加SO2的工艺相比，在该湿磨工艺期间从纤维中释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；
d)使所得包含纤维的玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序，从而分离淀粉、谷蛋白和纤维；
其中至少一种木聚糖酶和/或一种或多种纤维素酶和有效量的SO2在步骤d)之前或期间存在/添加。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤步骤(d)期间以至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm的量存在/添加。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤期间以400ppm至3000ppm、500ppm至2000ppm、600ppm至1500ppm、比如600ppm至1200ppm范围内的量存在/添加。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。
8.如权利要求7所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。
9.如权利要求8所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些水解酶进一步包含阿拉伯呋喃糖苷酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽和GH51多肽。
12.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包括使用纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包括被配置为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟且小于48小时的总保留时间的空间(V)/槽。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在配置于该纤维洗涤系统中的所述空间(V)/槽中的孵育时间为至少5分钟且小于48小时，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，优选在46℃和52℃之间。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与其中SO2水平低于400ppm的方法相比，在纤维洗涤期间存在/添加的SO2水平导致淀粉和谷蛋白的提取产率相同，同时减少了水解酶和碾磨的玉米籽粒物质之间所需的接触时间。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，比如里氏木霉。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶是纯化的。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在液体组合物中。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在固体组合物中。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述碾磨的玉米籽粒物质的一个或多个级分混合/接触的一种或多种水解酶的有效量在0.005kg至0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中SO2的来源为焦亚硫酸钠(Na2S2O5)和/或添加的SO2气体。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
23.如权利要求22所述的方法，其中该成熟多肽为SEQ ID NO:1的氨基酸1至551。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中该成熟多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸21至405。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
27.如权利要求26所述的方法，其中该成熟多肽为SEQ ID NO:3的氨基酸17至325。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；
(b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的该多肽的具有木聚糖酶活性的片段。
29.如权利要求28所述的方法，其中该成熟多肽为SEQ ID NO:4的氨基酸20至319。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶来源于木霉属菌株，特别是里氏木霉。
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