CN110770283A - 湿磨中的gh5和gh30 - Google Patents

湿磨中的gh5和gh30 Download PDF

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Abstract

本申请提供了在湿磨过程中改善来自玉米籽粒的总淀粉和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中所述水解酶中的至少一种选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽或其组合。

Description

湿磨中的GH5和GH30
技术领域
本发明涉及在湿磨过程中，优选在纤维洗涤过程中，改善来自玉米籽粒的淀粉和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使所述玉米籽粒与包含GH30多肽、GH5多肽或其组合的酶组合物接触。
发明背景
常规的玉米湿磨是设计用于淀粉和若干种副产物(包括胚芽、谷蛋白(蛋白质)和纤维)的回收和纯化的过程。纤维是价值最低的副产物，因此工业已经投入大量精力来提高更有价值的产物(例如淀粉和谷蛋白)的产率，同时减少纤维级分。高品质淀粉是有价值的，因为它可以在进一步加工成例如干燥的淀粉，改性淀粉、糊精、甜味剂和醇之类的产物后用于各种商业目的。谷蛋白通常用于动物饲料，如玉米谷蛋白粉(约60％蛋白)或玉米谷蛋白饲料(约20％蛋白)。
所述湿磨过程取决于具体使用的研磨设备可以显著变化，但所述过程通常包括：谷物清洁、浸渍、碾磨、胚芽分离、第二次碾磨、纤维分离、谷蛋白分离和淀粉分离。在清洁玉米籽粒后，典型地通过在受控制的时间和温度条件下浸泡在水中或在稀释的SO2溶液中使它们软化。然后，碾磨籽粒以分解果皮，并将胚芽与籽粒的其余部分分离。剩余的浆液，主要由纤维、淀粉和谷蛋白组成，在纤维洗涤过程中进行精细碾磨和筛选，以将纤维从淀粉和谷蛋白分离，然后分离谷蛋白和淀粉，并且可以在洗涤/过滤过程中纯化淀粉。
已经建议在湿磨过程的若干个步骤中使用酶，例如使用酶用于湿磨过程的浸渍步骤。已经示出，商业酶产品
Figure BDA0002325988800000011
(可得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨过程的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种经修饰的湿磨过程，其使用蛋白酶以在玉米湿磨期间显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。Johnston等人,Cereal Chem[谷物化学],81,第626-632页(2004)。
US 6,566,125披露了用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，所述方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒、碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并将碾磨的玉蜀黍浆液与酶(例如，蛋白酶)一起孵育。
US 5,066,218披露了研磨谷物(尤其是玉米)的方法，所述方法包括清洁谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。
WO 2002/000731披露了处理作物籽粒的过程，所述过程包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。
WO 2002/000911披露了分离淀粉谷蛋白的过程，所述过程包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。
WO 2002/002644披露了洗涤获得自研磨方法的淀粉谷蛋白分离步骤的淀粉浆液的过程，所述过程包括用包含有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。
WO 2014/082566和WO 2014/082564披露了用于在湿磨中使用的纤维素分解组合物。
尽管本领域已经研究了在玉米湿磨中使用酶的效果，但是在玉米籽粒的浸渍/浸泡期间，在玉米籽粒的碾磨期间和在淀粉谷蛋白分离期间，仍然需要改善的酶技术，其可以降低与玉米湿磨相关的能量支出和成本，并提供增加的淀粉和谷蛋白的产率。
发明内容
在第一方面，本发明涉及在湿磨过程中用来改善可以从玉米籽粒获得的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括：将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中至少一种所述水解酶选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽及其组合。
在第二方面，本发明涉及酶组合物，该组合物包含分离的GH30多肽、分离的GH5多肽或两者，以及这种酶组合物在湿磨过程中改善可以从玉米籽粒获得的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的用途。
在第三方面，本发明涉及组合物，该组合物包含玉米淀粉、玉米谷蛋白或玉米纤维，所述组合物通过本发明的第一方面和实施例中描述的方法获得。
在其他方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
在第四方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:10或12的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；
(c)SEQ ID NO:10或12的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、选择和/或插入；和
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
在第五方面，本发明涉及组合物，该组合物包含根据本发明的第四方面的多肽。
本发明还涉及核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含编码本发明的第四方面的多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
附图说明
将参考所附附图更详细地描述本发明，并且特别是根据本发明的优选的实施例。附图示出了实现本发明的方式并且不应被解释为限制落入所附的权利要求集的范围的其他可能的实施例。
图1示意性地示出了根据本发明的逆流纤维洗涤系统的第一实施例，
图2示意性地示出了根据本发明的系统的另一个实施例。
图3示意性地示出了具有内置培养箱的筛网单元
图4示意性地示出了水力旋流器形式的筛网单元
具体实施方式
本发明的目的是提供一种方法，该方法在水解过程中，优选在纤维洗涤程序中通过用水解酶组合物处理玉米籽粒来改善可从玉米籽粒获得的淀粉和/或谷蛋白产率。本发明的诸位发明人出人意料地发现，用GH5多肽或GH30多肽或其组合酶处理玉米籽粒，改善了从纤维中结合的淀粉和谷蛋白的释放，并因此改善了可获得的淀粉和/或谷蛋白的产率。
湿磨过程：
将玉米籽粒湿磨以打开籽粒并将籽粒分离成其四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维和谷蛋白。
湿磨过程可以在研磨间显著变化，但是常规的湿磨通常包括以下步骤：
1.浸渍并分离胚芽，
2.纤维洗涤程序
3.淀粉/谷蛋白分离，以及
4.洗涤淀粉。
1.浸渍、碾磨并分离胚芽
通过在约50℃(例如约45℃至60℃之间)的温度，在水中浸泡约30分钟至约48小时(优选地30分钟至约15小时，例如约1小时至约6小时)之间而软化玉米籽粒。在浸渍期间中，籽粒吸水，从而将其水分含量从15％增加至45％并使大小增加超过一倍。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的谷蛋白键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，它们裂开以释放胚芽。胚芽含有玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、谷蛋白和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。
2.纤维洗涤程序
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。收集纤维，并使其成浆液并过筛，以回收任何残留的淀粉或谷蛋白。
3.分离淀粉谷蛋白
将来自纤维洗涤步骤的淀粉-谷蛋白悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和谷蛋白。与淀粉相比，谷蛋白具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出谷蛋白。
4.洗涤淀粉
来自淀粉分离步骤的淀粉浆液含有一些不溶性蛋白和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其去除。在水力旋流器中，将仅剩余1％或2％蛋白的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以去除最后痕量的蛋白并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。
湿磨的产物：可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浸出液、玉米谷蛋白饲料、胚芽、玉米油、玉米谷蛋白粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。
酶的定义：
具有纤维素酶活性或纤维素分解活性的纤维素分解酶或纤维素酶/多肽：术语“纤维素分解酶”、“纤维素酶”和具有纤维素酶活性或纤维素分解活性的多肽在本文可互换使用且是指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶，所述材料包含任何包含纤维素(例如纤维)的材料。纤维素分解酶包括一种或多种内切葡聚糖酶(E.C3.2.1.4)、一种或多种纤维二糖水解酶(E.C 3.2.1.91和E.C 3.2.1.150)、一种或多种β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼1号(Whatman№1)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼1号滤纸用作底物的滤纸测定。所述测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
也可以通过测量在以下条件下，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解期间，糖的产生/释放的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)(或其他预处理的纤维素材料)中的纤维素，在适合的温度(例如40℃-80℃，例如，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)，以及在适合的pH(例如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解进行比较。典型的条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠5(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
Figure BDA0002325988800000062
HPX-87H柱层析(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories))进行糖分析。
具有水解酶活性的水解酶(hydrolytic enzyme)或水解酶(hydrolase)/多肽：“水解酶”和具有水解酶活性的多肽在本文中可互换使用，且是指使用水分解底物的任何催化蛋白。水解酶包含纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。
具有木聚糖酶活性的木聚糖酶/多肽：术语“木聚糖酶”和具有木聚糖酶活性的多肽在本文中可互换使用，且是指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃在0.01％
Figure BDA0002325988800000061
X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性被定义为在37℃、pH 6，在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青蛋白的木聚糖酶活性的量。
其他定义：
在本上下文中，术语以对于技术人员而言是普通的方式使用。其中一些术语如下阐明：
接触时间：对于一种或多种酶与底物反应，一种或多种酶必须与底物接触。“接触时间”是指有效量的一种或多种酶与至少一部分底物物质接触的时间段。在接触时间期间酶可以不与所有底物物质接触，然而将一种或多种酶与底物物质混合允许在接触时间内酶催化水解一部分底物物质的潜力。
玉米籽粒：已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。
一些玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。
玉米籽粒或玉米籽粒的级分：此术语用于描述湿磨过程中的玉米籽粒。当玉米籽粒被分解和加工时，使用该术语时，玉米籽粒的所有分级部分应视为包括在内。该术语包括例如：浸泡的籽粒、碾磨的籽粒、玉米籽粒物质、第一级分、第二级分、玉米籽粒物质的一个或多个级分等。
玉米籽粒物质：优选地用于引用包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质，优选地通过汽蒸和碾磨作物籽粒并从胚芽中分离包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质来实现。当玉米籽粒物质移动通过纤维洗涤时，它被分离成若干个级分，包括第一级分(s)和第二级分(f)。因此，“玉米籽粒物质的级分”和“玉米籽粒物质的一个或多个级分”尤其是指这些第一级分(s)和第二级分(f)。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中，该片段具有果胶裂解酶活性。
胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。被胚芽覆盖或包围的胚乳包含约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。
GH5多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族5的成员(http://www.cazy.org/)。
GH30多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族30的成员(http://www.cazy.org/)。
谷蛋白：谷蛋白是一种蛋白，由两种更小的蛋白—麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成。本文“谷蛋白”是指在玉米籽粒中发现的大多数蛋白。来自玉米湿磨的谷蛋白的主要产品是玉米谷蛋白粉(大约60％蛋白)和玉米谷蛋白饲料(大约20％蛋白)。
碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”是指将玉米籽粒分解成更小的组分。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
孵育时间：玉米籽粒物质的一个或多个级分在纤维洗涤期间与水解酶接触而未经过筛选的时间。
在许多优选的实施例中，根据本发明的方法利用包含空间(V)或“培养箱”的系统，在该系统内材料通过酶而“留下被影响”，并且在这种情况下，孵育时间可以通过以下确定：
可替代地，如果流入至培养箱以每时间单位的体积表示：
Figure BDA0002325988800000092
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ IDNO:2的氨基酸1至20是信号肽的计算机程序SignalP(Nielsen等人，1997，ProteinEngineering[蛋白质工程]10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸21至678。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
研磨设备：“研磨设备”是指粉碎机上使用的所有设备。湿磨过程将取决于可用的研磨设备而变化。研磨设备的实例可以是浸渍罐、蒸发器、螺旋压榨机、旋转干燥机、脱水筛网、离心机、水力旋流器等。每个研磨设备/研磨线的尺寸和数量可以在不同的粉碎机上变化，这将影响研磨过程。例如，纤维洗涤筛网单元的数量可以变化，离心机的尺寸也可以变化。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
保留时间：在纤维洗涤程序中允许一种或多种水解酶和玉米籽粒或玉米籽粒的级分反应的时间。
在一些实施例中，保留时间是在再次离开纤维洗涤系统之前，在第一筛网单元(S1)中接收的玉米籽粒物质及其一个或多个级分与有效量的一种或多种水解酶接触的时间段。在保留时间期间，玉米籽粒物质的一个或多个级分在空间(V)中与一种或多种水解酶孵育，然后离开纤维洗涤系统，作为来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)的一部分或作为来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)的一部分。
保留时间可以优选地估计为固形物在如本发明所定义的纤维洗涤系统中花费的平均持续时间。这可以通过以下关系估计：
可替代地，如果流入至系统以每时间单位的体积表示：
Figure BDA0002325988800000102
系统的体积典型地设定为等于系统中所有空隙的体积之和；然而，由于系统中的管道典型地做得很小，其或许优选地忽略管道的体积。
筛选的：术语“筛选的”(“screened”或“screening”)是指将玉米籽粒物质分离成第一级分s和第二级分f以及将这些级分从一个筛网单元移动到另一个筛网单元的过程。非筛选期是提供用于将玉米籽粒物质或其级分与酶一起孵育的非分离期。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选3.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用6.1.0版本。
所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。Needle标注的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖
构成、由广泛出现在植物组织中的呈储藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。
浸渍或浸泡：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO2浸泡作物籽粒。
发明说明：本发明的一个方面提供了在湿磨过程中用来改善可以从玉米籽粒获得的淀粉和/或谷蛋白总产率的方法，该方法包括：将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中至少一种所述水解酶选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽或其组合。
玉米籽粒或玉米籽粒级分中的一些淀粉和/或谷蛋白可以与纤维级分结合，并且在湿磨过程期间从未释放。然而，添加水解酶(其可以包括任何可以使用水分解玉米籽粒中存在的底物的催化蛋白)可以释放一些结合的淀粉和/或谷蛋白，从而改善在湿磨过程中淀粉和/或谷蛋白的总产率。诸位本发明人出人意料地发现，GH5多肽和GH30多肽有效减少纤维级分中结合的淀粉和谷蛋白的量。
在一个实施例中，本发明的方法导致在过程中(如在纤维洗涤程序中)，从纤维释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
湿磨过程中使用的具体程序和设备可以变化，但是该过程的主要原理保持不变(参见湿磨过程的说明)。
在一个实施例中，本发明的方法包含以下步骤：
a)将玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将浸泡的籽粒碾磨，以产生浸泡的和碾磨的籽粒；
c)从浸泡和碾磨的籽粒中分离胚芽以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)将所得玉米籽粒物质进行纤维洗涤程序。
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维级分中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。收集纤维，并使其成浆液并过筛，通常在浸泡、碾磨和从玉米籽粒中分离出胚芽之后(参见湿磨过程的说明)，以回收玉米籽粒物质中任何残留的淀粉或谷蛋白。该加工在本文中称为纤维洗涤程序。
在一个实施例中，在使玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序的步骤之前、期间或之后，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
在一个实施例中，在使玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序的步骤之前，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。根据该实施例，在碾磨期间和/或胚芽分离期间的浸泡过程中，优选地将玉米籽粒与所述一种或多种水解酶混合。
在一个实施例中，在使玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序的步骤之后，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
在一个优选的实施例中，在使玉米籽粒物质经受纤维洗涤程序的步骤期间，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
在一个实施例中，允许所述玉米籽粒或玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶反应至少15分钟，例如至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟。
纤维洗涤程序中使用的特定设备可以变化，但是过程的主要原理保持不变。
在一个实施例中，所述纤维洗涤程序包含为引入一种或多种水解酶而优化的纤维洗涤系统，其中纤维洗涤系统包含空间(V)，该空间(V)被配置为在该纤维洗涤系统中提供以下总反应时间(保留时间)：至少35分钟(如至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。在一个实施例中，在纤维洗涤系统中的总保留时间在35分钟和48小时之间，例如35分钟和24小时、35分钟和12小时、35分钟和6小时、35分钟和5小时、35分钟和4小时、35分钟和3小时、35分钟和2小时、45分钟和48小时、45分钟和24小时、45分钟和小时、45分钟和6小时、45分钟和5小时、45分钟和4小时、45分钟和3小时、45分钟和2小时、1-48小时、1-24小时、1-12小时、1-6小时、1-5小时、1-4小时、1-3小时、1-2小时之间。
在一个实施例中，该纤维洗涤系统包含：
-多个筛网单元(S1……S4)，这些筛网单元以逆流洗涤配置流体连接；每个筛网单元被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分(s)和第二级分(f)，所述第二级分(f)含有与第一级分(s)相比，以wt％测量的更高量纤维；
-空间(V)安排在系统中并且流体连接以接收所述第一级分(s)，所述第二级分(f)，或混合的第一和第二级分(s，f)，优选地仅第二级分(f)，并配置成为在空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或两个级分导出到下游筛网单元(S4)，
其中该系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元(S1)
-将来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)作为含有淀粉的产物流导出，
-导入工艺用水，优选地设置用于将工艺用水导入最下游筛网单元(S4)，
-将来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白。
-将水解酶引入该系统中。
图1示意性地示出了如上描述的纤维洗涤系统的实施例。如图1所示，纤维清洗系统包含多个筛网单元S1、S2、S3、S4，它们以逆流洗涤配置流体连接。“流体连接”典型地意指筛网单元通过使用流动线连接，例如用于在筛网单元之间输送物质的管道。筛网单元S1-S4中的每一个被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分s(s1、s2、s3、s4)和第二级分f(f1、f2、f3、f4)。如技术人员将理解的，在纤维洗涤系统中产生的第一级分的数量取决于系统中包括的筛网单元的数量。系统中的筛网单元的数量优选地在2-8之间，并且在这样的实施例中，第一和第二级分的数量也将在2-8之间。筛网单元被典型地配置，这样使得固体物质在单独的流中分离出来，由此第二级分f含有与第一级分s相比，以wt％测量的更高量纤维。在该图中，符号“s”优选地指无纤维流(含有淀粉)，并且符号“f”优选地指含有纤维的流。f和s上的指数是指流的来源。应注意，尽管优选地第一级分s不含有任何纤维，但是这在实际装置中可能难以实现。
系统中的流动具有下游方向和上游方向：每个筛网单元；例如筛网单元S3，接收流；例如f2，来自上游筛网单元，例如，S2并递送流；例如s3，到上游筛网单元；例如S2。类似地，筛网单元S3从下游筛网单元S4接收流s4，并将流f3递送到下游筛网单元S4。
如图1中所示，工艺用水，典型地是用作系统中的洗涤水的水，被提供给最下游筛网单元S4，并且工艺用水典型地是不含有纤维的水。玉米籽粒物质典型地是在最上游筛网单元S1处提供的液体悬浮液(典型地是水中的悬浮液)。这在图1中由箭头标记的“从研磨”表示。因此，通过筛网单元之间的流体连接，玉米籽粒物质及其级分f在系统中向下游流动，并且工艺用水在系统中向上游移动。因此，系统中的流体配置可以看作是通过含有大量淀粉的流体在最上游筛网单元S1中洗涤的玉米籽粒物质，以及通过含有少量淀粉的流体在最下游筛网单元S4中洗涤的玉米籽粒物质。此外，最上游筛网单元S1中的玉米籽粒物质与最下游筛网单元S4中的玉米籽粒物质的级分f相比含有更高量的淀粉。
使用上述纤维清洗系统的一个目的是，为了提高从纤维中除去淀粉的效率，在玉米籽粒物质或其级分与系统中的酶之间提供至少35分钟(例如至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)的接触时间。在纤维洗涤系统中酶和玉米籽粒物质或其级分之间的接触时间/反应时间称为保留时间。在空间(V)中酶和玉米籽粒物质或其级分之间的接触时间/反应时间称为孵育时间。
在一个实施例中，在配置成纤维洗涤系统中的所述空间(V)中的孵育时间为至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的孵育时间在35分钟和48小时之间，例如35分钟和24小时、35分钟和小时、35分钟和6小时、35分钟和5小时、35分钟和4小时、35分钟和3小时、35分钟和2小时、45分钟和48小时、45分钟和24小时、45分钟和12小时、45分钟和6小时、45分钟和5小时、45分钟和4小时、45分钟和3小时、45分钟和2小时、1-48小时、1-24小时、1-12小时、1-6小时、1-5小时、1-4小时、1-3小时、1-2小时之间。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的孵育温度在25℃°和95℃之间，例如25℃°和90℃、25℃°和85℃、25℃和80℃、25℃和75℃、25℃和70℃、25℃和65℃、25℃和60℃、25℃和55℃、25℃和53℃、25℃和52℃、30℃和90℃、30℃和85℃、30℃和80℃、30℃和75℃、30℃和70℃、30℃和65℃、30℃和60℃、30℃和55℃、30℃和53℃、30℃和52℃、35℃和90℃、35℃和85℃、35℃和80℃、35℃和75℃、35℃和70℃、35℃和65℃、35℃和60℃、35℃和55℃、35℃和53℃、35℃和52℃、39℃和90℃、39℃和85℃、39℃和80℃、39℃和75℃、39℃和70℃、39℃和65℃、39℃和60℃、39℃和55℃、39℃和53℃、39℃和52℃之间。
已发现在最上游筛网单元S1的下游和最下游筛网单元S4的上游的位置添加酶是有利的；在图1的实施例中，酶的添加被示为处于筛网单元S3的流体位置(由图1中标记为“酶”的箭头示出)。
在纤维洗涤系统中通过在最佳点添加酶，可以延长保留时间，这可以提高从纤维中去除或分离淀粉的效率。为了提供与典型的研磨所提供相比更长的保留时间，空间V(在图1中未示出)可以安排在系统中并且流体连接以接收所述第一级分s之一，所述第二级分f之一，或混合的第一和第二级分s，f，优选地仅第二级分f，并配置成为在空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或多个级分导出到下游筛网单元S4。应注意，尽管可能优选的是在系统中安排单独的培养箱单元，但是连接筛网单元的流动线也可用于提供空间。
根据其中纤维洗涤系统包含2个筛网单元的实施例，给料优选地在第一和第二筛网单元之间或在筛网单元1和筛网单元2之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含3个筛网单元的实施例，给料优选地在第二筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元3之间配置的空间中，最优选的在筛网单元2中，或者在筛网单元2和3之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含4个筛网单元的实施例，给料优选地在第二或第三筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元4之间配置的空间中，最优选的在筛网单元2中，或者在筛网单元2和3之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含5个筛网单元的实施例，给料优选地在第二、第三或第四筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元5之间配置的空间中，最优选的在筛网单元3中，或者在筛网单元3和4之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含6个筛网单元的实施例，给料优选地在第二、第三、第四或第五筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元6之间配置的空间中，最优选的在筛网单元4中，或者在筛网单元4和5之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含7个筛网单元的实施例，给料优选地在第二、第三、第四、第五或第六筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元7之间配置的空间中，最优选的在筛网单元4中，或者在筛网单元4和5之间配置的空间中。
根据其中纤维洗涤系统包含8个筛网单元的实施例，给料优选地在第二、第三、第四、第五、第六和第七筛网单元中，或在筛网单元1和筛网单元8之间配置的空间中，最优选的在筛网单元5中，或者在筛网单元5和6之间配置的空间中。
因此，根据本发明优选的实施例的系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元S1，优选地通过包含进入系统的入口，将物质进料到最上游筛网单元S1；
-将来自最上游筛网单元S1的第一级分s1作为含有淀粉的产物流导出，优选地通过包含来自最上游筛网单元的出口，将无纤维流从系统进料出；
-导入工艺用水，优选地安排用于将工艺用水导入最下游筛网单元S4；工艺用水的入口优选地为最下游筛网单元S4的入口；
-将来自最下游筛网单元S4的第二级分f4作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白；优选地通过包含来自最下游筛网单元的出口。
该系统还被配置成用于将水解酶引入所述系统，该系统可以是安排在优选位置的入口，以允许玉米籽粒物质或其级分与一种或多种水解酶之间的接触。
参考了图2，示意性地示出了根据本发明的系统的另外的实施例。图1中使用了与图2中使用的相同的符号。如图2所示，筛网单元S1至S4都包含由筛网单元内部的斜虚线表示的筛网元件(筛网)。该斜虚线示出了被配置成用于分离出含有纤维的级分f和优选地不含有任何纤维的级分的装置；例如，这可以由带式过滤器或过滤器提供，该带式过滤器或过滤器通常安排在限定筛网单元的内部空间的壁部分内。
在图2中示出的实施例中，将要混合的各种级分示出为在筛网单元S1-S4外部混合。但是，它们可以在筛网单元内混合。
也如图2中示出的，空间V是与筛网单元S3流体连接的单独的容器，这样使得筛网单元S3在具有纤维和酶的流体在空间V中具有孵育时间之后接收具有纤维和酶的流体。如图2中示意性地示出的，空间V可以具有挡板，用于确保流体不会从容器的入口到出口以直线流动，否则可能使流动走近路，以提供孵育时间。
图2还示出了酶被施加到进入空间V的流f2和s4。在示出的实施例中，酶由剂量泵10给料，剂量泵示意性地示出为由曲轴驱动的活塞泵，其中给料的酶的量通过曲轴的旋转控制(单向入口阀和出口阀存在于筒或筒盖中但未示出)。
因此，根据本发明的系统优选地被配置成用于将水解酶引入所述第一级分(s)和/或引入所述第二级分(f)，和/或引入混合的第一和第二级分和/或引入供应至系统的工艺水流。
筛网单元S的数量可以根据例如容积分成两个流和/或其他设计目标来选择。然而，根据本发明的系统通常将具有最上游筛网单元，最下游筛网单元，并且优选地一个或多个中间筛网单元流体地安排在最上游和最下游筛网单元之间。即，参考图1和2，优选的系统将包含最上游筛网单元S1和最下游筛网单元S4以及安排在之间的多个筛网单元(例如2个)，其中安排在之间是指如图1和2中示出的流体连接。
详细来说，如图1和2中所披露的流体连接的逆流洗涤配置，典型地包含以下列方式安排的多个筛网单元S1…S4，这样使得：
由上游筛网单元S1产生的第二级分f1与由下游筛网单元S3产生的第一级分s3混合，并且所述混合的级分由筛网单元S2分离，该筛网单元S2位于所述上游和所述下游筛网单元S1，S3之间，进入第一级分s2和第二级分f2。
尽管本披露是参考筛网单元S3进行的，但是相同的说明可以应用于任何中间筛网单元，例如筛网S2，或其他中间筛网单元，其中中间筛网单元是指安排在最上游筛网单元下游和最下游筛网单元上游的筛网单元。
如图2中示出的，在一些实施例中优选的是，第二级分f1和第一级分s3的混合在进入中间筛网单元S2之前发生。这种混合可以通过将两个级分导入混合室来提供，该混合室包含典型地提供流体的剧烈搅拌的搅拌工具，或者混合可以通过歧管提供，该歧管具有用于每个流的入口和用于混合流的出口。
作为在进入筛网单元之前混合的替代方案，第二级分f1和第一级分3的混合可以在中间筛网单元S2内发生。这可以例如通过筛网单元的内部配备有搅拌工具来实现，该搅拌工具提供典型地筛网单元内的流体的剧烈搅拌。
尽管在图1和2中披露了实施例示出包含多于两个的筛网单元，系统被认为是完全可操作的，少到两个筛网单元。因此，通常优选的是，包含2-8个筛网单元的系统典型地如图1或2中示出的安排。
此外，空间的尺寸(以m3为单位)优选地被配置成提供至少至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟、至少120分钟)的孵育时间。指定用于孵育的空间(V)优选地具有至少30m3、至少40m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、或至少500m3的体积。孵育时间也可以在多于一个的空间V中，具有至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3的总体积或组合的体积。
在孵育时间期间，优选的不筛选在空间V中接收的流体。因此，离开空间V的流体具有相同的成分，例如淀粉和纤维作为在空间V中接收的流体，尽管它优选地含有更高比例的已从纤维中释放的淀粉。
为了确保酶和纤维之间的紧密接触，可以优选将空间V配置成用于搅拌在所述空间V中含有的物质，例如通过包含转子或叶轮。
如图2中示出的，优选的将空间V安排在最上游筛网单元S1下游和所述最下游筛网单元S4上游；特别的是图2中的实施例示出了空间V被安排成将流体进料到第二最下游筛网单元S3中。
如本文所披露的，可以按不同的方式提供空间，并且如图2中示出的，空间V可以优选地作为单独的培养箱单元提供。培养箱单元可以由适合的流体线配置，以接收第一级分s，第二级分f或第一和第二级分s，f的组合，优选地仅第二级分f，并将由此孵育的材料递送到下游筛网单元S3。
参考了图3，示意性地示出了具有内置培养箱的筛网单元/空间V。如所示，筛网单元/培养箱在下端包含筛选元件14，并且在其上方包含空间V。在空间内部安排挡板以避免从上端(在图3级分f1和s3的披露的实施例中接收)朝向筛选元件14的流体流动的短路。还如所示，筛选出无纤维流s2，提供含有纤维的级分f2。
用于从玉米籽粒物质中释放淀粉的酶典型地具有热窗口，在该窗口内酶的释放是最有效的，并且因此对能够控制系统中选择的位置处的温度可能是有利的，例如在空间V中。为此，根据本发明的系统可以优选地包含用于提供所述空间(V)内部的流体的孵育温度的热元件，优选地在35℃-70℃的范围内，例如40℃-60℃的范围内，例如在39℃-53℃的范围内，例如在45℃-53℃的范围内，例如在39℃-48℃的范围内，例如47℃。在空间作为单独的孵育单元提供的实施例中(如图2中所示)，热元件可以安排在孵育单元内和/或限定孵育单元外壳的壳上。
热元件优选地是可恒温的加热/冷却元件，其适于测量温度并改变从空间进/出的热通量，以将在空间中含有的材料的温度控制在预定范围内。
在一些优选的实施例中，可恒温的加热元件包含电加热/冷却元件或液体加热/冷却元件和温度传感器。
如本文所示，筛网单元提供将流体分离成两个级分s和f，并且筛网单元典型地以机械方式筛选，其中一个或多个，例如所有筛网单元，包含一个或多个具有开口的筛选元件(如在图2中具有斜虚线示出的)，其被配置成允许固体物质的通道低于预定尺寸。可以根据多个设计标准来定义预定义尺寸。然而，它典型地优于不允许纤维通过开口。另一方面，小开口可能具有被封闭的趋势，并且在许多情况下，通过考虑封闭方面和筛选方面来选择开口的实际尺寸，这可能导致允许更少量的纤维通过。
在一些优选的实施例中，一个或多个例如所有筛网单元包含转子刀片和/或筛，其配置成用于提供所述两个级分(s、f)。作为由开口构成的筛选元件的替代方案，一个或多个例如所有筛网单元可以是水力旋流器16，如图4中示意性地示出的。
如以上披露的，该系统被配置成借助给料装置将水解酶引入所述第一级分s和/或引入所述第二级分f和/或引入混合的第一和第二级分和/或引入工艺用水中-参见图2。
这种给料装置典型地适于提供可控的给料量的酶，优选地根据到系统的酶的量与玉米籽粒物质的进料量之间的预定特定比率。为实现此目的，给料装置10可以是计量泵，如由图2中的活塞泵示出的。
可替代地，给料装置可以是具有可控的流出阀的重力流分配器，该流出阀配置成用于控制流过流动阀的酶的量。
在一个实施例中，本发明的GH5多肽具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，本发明的GH30多肽具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，在包含以下步骤的程序中，本发明的GH5多肽具有一定量的木聚糖酶活性，该量足够释放出至少是纤维干物质的15％(w/w)(如纤维干物质的至少16％、17％、18％、19％、20％、21％或至少22％(w/w))的淀粉和谷蛋白：
i.从玉米湿磨设备提供经加压的纤维的样品；
ii.将样品重悬于缓冲液(pH 4，0.02M乙酸钠)中以提供含有5％干固体的浆液。
iii.以相当于每克干固体底物35μg酶蛋白(EP)(如每克干固体底物70μg酶蛋白(EP))的量向浆液中添加GH5多肽，与以相当于每克干固体底物280μg酶蛋白(EP)的纤维素分解酶组合；
iv.样品的孵育在温度为40℃或52℃的空气加热的培养箱中伴随恒定振荡120分钟。
v.加工前将样品在冰水(5℃)中快速冷却
vi.将浆液转移到150-微米的筛中，收集通过的滤液。
vii.将保留的纤维在筛上加压并收集通过的滤液，将收集的滤液与第一份滤液合并。
viii.将加压的纤维转移到200ml的含有水的烧杯中并搅拌混合物。
ix.将浆液转移到150-微米筛并收集通过的滤液，将收集的滤液与第一份滤液合并。
x.将保留的纤维在筛上加压并收集通过的滤液，将收集的滤液与第一份滤液合并。
xi.重复步骤viii至x一次或多次。
xii.将合并的滤液通过玻璃微滤纸(沃特曼公司(Whatman))进行真空过滤，该滤纸保留了通过150-微米筛的从纤维释放出的不溶性固体。
xiii.将200ml水经过滤纸以去除任何痕量可溶物
xiv.干燥并称重保留在滤纸上的总不溶性固体，报告为纤维干物质释放的淀粉和谷蛋白(w/w)。
在一个实施例中，本发明的GH5多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶(EC 3.2.1.4)活性、内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)活性、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)活性、β-葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性、葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58)活性、地衣多糖酶(EC3.2.1.73)活性、外切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维糊精酶(EC 3.2.1.74)活性和/或葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)活性、甘露聚糖内切-β-1,4-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)活性、纤维素β-1,4-纤维二糖苷酶(EC 3.2.1.91)活性、甾醇β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.104)活性、内切糖神经酰胺酶(endoglycoceramidase)(EC 3.2.1.123)活性、脱乙酰壳多糖酶(EC3.2.1.132)活性、β-樱草苷酶(EC 3.2.1.149)活性、木葡聚糖-特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)活性、内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC3.2.1.164)活性、橘皮苷6-O-α-L-鼠李糖-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.168)活性、β-1,3-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.-)活性和阿拉伯糖基木聚糖-特异性内切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.-)活性和甘露聚糖转糖苷酶(EC2.4.1.-)活性。
在一个实施例中，本发明的GH30多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)活性、β-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.31)活性、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)活性、β-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.38)活性、葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性、β-1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)活性、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)活性、内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC:3.2.1.164)活性，和[还原性末端]β-木糖苷酶(EC 3.2.1.-)活性。
在一个实施例中，本发明的GH5多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列；优选地，子序列具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，本发明的GH30多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列；优选地，子序列具有木聚糖酶活性。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含氨基酸1至655、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸28至655、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:1的1至27是信号肽)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸36至655、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:1的28至35是his-标签)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸37至655、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸40至655、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1的成熟多肽包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸45至655、或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至555、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸7至555、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:2的1至6是his-标签)。在另一实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸至少10至555、或由其组成或基本上由其组成。在另一实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸至少15至555、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸至少20至555、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸至少30至555、或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至585、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸28至585、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:3的1至27是信号肽)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸36至585、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:3的28至35是his-标签)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的至少氨基酸37至585、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的至少氨基酸40至585、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3的成熟多肽包含SEQ ID NO:3的至少氨基酸45至585、或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至391、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸至少5至391、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸至少10至391、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸至少15至391、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸至少20至391、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸至少30至391、或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，SEQ ID NO:5的成熟多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸1至417、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:5的成熟多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸27至417、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:5的1至26是信号肽)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:6的成熟多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸1至417、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:6的成熟多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸27至417、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:6的1至26是信号肽)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:7的成熟多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸1至417、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:7的成熟多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸27至417、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:7的1至26是信号肽)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:8的成熟多肽包含氨基酸1至557、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:8的成熟多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸8至557、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:8的1至7是His-标签)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:8的成熟多肽包含SEQ ID NO:8的至少氨基酸28至557、或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，SEQ ID NO:10的成熟多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸1至576、或由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，SEQ ID NO:10的成熟多肽包含SEQ IDNO:10的氨基酸24至576、或由其组成或基本上由其组成(SEQ ID NO:10的1至23是信号肽)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:12的成熟多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸1至565、或由其组成或基本上由其组成。
在本发明的上下文中，术语“子序列”意指在成熟多肽的氨基(N-)和/或羧基(C-)末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸残基的多肽；其中该子序列具有木聚糖酶活性。在一些实施例中，“子序列”中不存在的氨基酸残基数最多为20，例如最多为19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或最多1个氨基酸残基。
在一些实施例中，成熟多肽中的任一项的子序列可以是至少150个氨基酸的长度、或至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少600个氨基酸的长度、或至少650个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:1的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少600个氨基酸的长度、或至少650个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:2的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:3的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少560个氨基酸的长度、或至少570个氨基酸的长度、或至少580个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:4的子序列可以是至少150个氨基酸的长度、或至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少360个氨基酸的长度、或至少370个氨基酸的长度、或至少380个氨基酸的长度、或至少390个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:5的子序列可以是至少150个氨基酸的长度、或至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少360个氨基酸的长度、或至少370个氨基酸的长度、或至少380个氨基酸的长度、或至少390个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:6的子序列可以是至少150个氨基酸的长度、或至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少360个氨基酸的长度、或至少370个氨基酸的长度、或至少380个氨基酸的长度、或至少390个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:7的子序列可以是至少150个氨基酸的长度、或至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少360个氨基酸的长度、或至少370个氨基酸的长度、或至少380个氨基酸的长度、或至少390个氨基酸的长度。
在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:8的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少600个氨基酸的长度、或至少650个氨基酸的长度。在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:10的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少600个氨基酸的长度、或至少650个氨基酸的长度。在一个实施例中，成熟多肽的SEQ ID NO:12的子序列可以是至少200个氨基酸的长度、或至少250个氨基酸的长度、或至少300个氨基酸的长度、或至少350个氨基酸的长度、或至少400个氨基酸的长度、或至少450个氨基酸的长度、或至少500个氨基酸的长度、或至少550个氨基酸的长度、或至少600个氨基酸的长度、或至少650个氨基酸的长度。
在一个实施例中，包含一种或多种水解酶的酶组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)、EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)、纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和蛋白酶(E.C 3.4)。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)。根据这些实施例，根据本发明定义的GH5和/或GH30多肽与来自木霉属的内源纤维素酶一起表达。
在一个实施例中，包含一种或多种水解酶的酶组合物可以包含再里氏木霉中表达的纤维素酶和其他以纯化或半纯化形式添加到酶组合物中的水解酶。
在一个实施例中，该一种或多种水解酶是纯化的。这些纯化的酶可用于本发明其他实施例中所述的酶组合物中。
在一个实施例中，该一种或多种水解酶在液体组合物中。该组合物可为均匀的或不均匀的。
在一个实施例中，该一种或多种水解酶在固体组合物中。
在一个实施例中，与所述玉米籽粒物质的一个或多个级分混合的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白(EP)/公吨(MT)进入该湿磨过程的玉米籽粒物质之间，例如0.010-0.5kg EP/MT玉米籽粒之间，例如0.05-0.5kg/MT玉米籽粒、或0.075-0.5kg/MT、或0.1-0.5kg/MT玉米籽粒、或0.005-0.4kg/MT玉米籽粒、或0.01-0.4kg/MT玉米籽粒、或0.05-0.4kg/MT玉米籽粒、或0.075-0.4kg/MT玉米籽粒、或0.1-0.4kg/MT玉米籽粒、或0.005-0.3kg/MT玉米籽粒、或0.01-0.3kg/MT玉米籽粒、或0.05-0.3kg/MT玉米籽粒、或0.075-0.3kg/MT或0.1-0.3kg/MT玉米籽粒、或0.005-0.2kg/MT玉米籽粒、或0.010-0.2kg/MT玉米籽粒、或0.05-0.2kg/MT玉米籽粒、或0.075-0.2kg/MT、或0.1-0.2kg/MT玉米籽粒、或例如0.075-0.10kg/MT玉米籽粒、或0.075-0.11kg/MT玉米籽粒之间。
用水解酶组合物酶处理玉米籽粒或玉米籽粒的级分，该水解酶组合物包含至少一种GH5多肽或者至少一种GH30多肽或者至少一种GH5和至少一种GH30多肽的组合，提供了与本领域已知的其他方法生产的产品不同的玉米淀粉、玉米谷蛋白和玉米纤维产品。
在一方面，本发明涉及组合物，该组合物包含玉米淀粉，所述组合物可通过本发明的方法获得。
在一方面，本发明涉及组合物，该组合物包含玉米谷蛋白，所述组合物可通过本发明的方法获得。
在一方面，本发明涉及组合物，该组合物包含玉米纤维，所述组合物可通过本发明的方法获得。
在一方面，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包含如本文定义的分离的GH30多肽。
在一方面，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包含如本文定义的分离的GH5多肽。
在一方面，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包含如本文定义的分离的GH30多肽和如本文定义的分离的GH5多肽。
在一个实施例中，根据本发明的组合物，其中至少一种所述水解酶选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽或其组合，进一步包含一种或多种酶，该酶选自由以下组成的组：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)或蛋白酶(E.C3.4)。
在优选的实施例，该酶组合物包含获得自里氏木霉培养物的纤维素酶，例如里氏木霉ATCC 26921的培养物。适合的纤维素酶是可获得的；例如来自诺维信公司，商品名为
本发明的进一方面涉及GH30多肽在玉米湿磨中的用途。
GH30多肽可以特别是如本文上文所定义的多肽。优选地，使用如上定义的湿磨过程进行玉米湿磨。
在另一方面，本发明提供GH5多肽在玉米湿磨中的用途。GH5多肽可以特别是如本文上文所定义的多肽。优选地，使用任何如上定义的湿磨过程进行玉米湿磨。
在本发明的又另一方面提供了如上所定义的在玉米湿磨中(优选在上述定义的玉米湿磨过程中)的酶组合物的用途。
优选地，当根据本发明使用时，GH30多肽、GH5多肽和/或酶组合物是用于为了增加湿磨过程中来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的目的。
具有木聚糖酶活性的多肽
在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的分离的多肽，这些分离的多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:10的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有木聚糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:10的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸24至576或由其组成。
在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的分离的多肽，这些分离的多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:12的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有木聚糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:12的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及具有果胶裂解酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸所编码。
在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽的变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置包含取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的果胶裂解酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
具有木聚糖酶活性的多肽的来源
本发明的具有木聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，这些多肽可以是具有果胶裂解酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属多肽。
在一方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一方面，该多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一方面，该多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
该多肽可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一方面，该多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列、但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,1991,Protein Expression and Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，该核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导该多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(WO00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地含有在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选地用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌、谷类镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据所公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
可以根据本领域已知的方法来制备组合物，并且这些组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域已知的方法将组合物稳定化。
优选的实施例
本发明进一步由下述编号的实施例描述：
1.一种在湿磨过程中改善来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中至少一种所述水解酶选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽或其组合。
2.根据实施例1所述的方法，其中在该湿磨过程期间从纤维释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
3.根据前述实施例中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生浸泡的和碾磨的籽粒；
c)从这些浸泡和碾磨的籽粒中分离胚芽以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)将该所得玉米籽粒物质进行纤维洗涤程序。
4.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在根据实施例3所述的步骤d)之前、期间或之后，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
5.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在根据实施例3所述的步骤d)期间，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
6.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中允许所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶接触至少15分钟。
7.根据实施例3-6中任一项所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包含使用为引入一种或多种水解酶而优化的纤维洗涤系统，并且其中该纤维洗涤系统包含配置为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟并且少于48小时的总保留时间的空间。
8.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中配置成该纤维洗涤系统中的所述空间中的孵育时间为至少5分钟并且小于48小时。
9.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该孵育温度在25℃和95℃之间。
10.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述GH5多肽具有木聚糖酶活性。
11.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述GH30多肽具有木聚糖酶活性。
12.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述GH5多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶(EC 3.2.1.4)活性和/或内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性和/或β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)活性和/或β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)活性和/或β-葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性和/或葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58)活性和/或地衣多糖酶(EC 3.2.1.73)活性和/或外切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维糊精酶(EC 3.2.1.74)活性和/或葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)活性和/或甘露聚糖内切-β-1,4-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)活性和/或纤维素β-1,4-纤维二糖苷酶(EC 3.2.1.91)活性和/或甾醇β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.104)活性或内切糖神经酰胺酶(EC 3.2.1.123)活性和/或脱乙酰壳多糖酶(EC 3.2.1.132)活性和/或β-樱草苷酶(EC3.2.1.149)活性和/或木葡聚糖-特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)活性和/或内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.164)活性和/或橘皮苷6-O-α-L-鼠李糖-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.168)活性和/或β-1,3-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.-)活性和/或阿拉伯糖基木聚糖-特异性内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.-)活性和/或甘露聚糖转糖苷酶(EC2.4.1.-)活性。
13.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述GH30多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性和/或β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)活性和/或β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)活性和/或β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)活性和/或β-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.38)活性和/或葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性和/或β-1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)活性和/或葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.136)活性和/或内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC:3.2.1.164)活性和/或[还原性末端]β-木糖苷酶(EC 3.2.1.-)活性。
14.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该GH5多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％同一性
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列。
15.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该GH30多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％同一性
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列。
16.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中包含一种或多种水解酶的所述酶组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)纤维二糖水解酶I(EC3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)或蛋白酶(E.C XXXX)。
17.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，例如里氏木霉。
18.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶是纯化的。
19.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在液体组合物中。
20.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在固体组合物中。
21.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中与一种或多种所述玉米籽粒物质的级分混合的该一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨过程的玉米粒之间。
22.一种包含玉米纤维的组合物，所述组合物可通过如实施例1-21中任一项所述的方法获得。
23.GH30多肽和/或GH5多肽在用于在如实施例1-21中任一项中所定义的湿磨过程中改善来自玉米籽粒的淀粉产率和/或总谷蛋白产率的方法中的用途。
24.一种具有木聚糖酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性；
(c)SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有果胶裂解酶活性。
25.根据实施例24所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
26.根据实施例24或25所述的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严格条件至非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体。
27.根据实施例24-26中任一项所述的多肽，该多肽是由与SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:12的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列具有至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸所编码的。
28.根据实施例24-27中任一项所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:12、或者SEQ ID NO:0或SEQ ID NO:1的成熟多肽、或由其组成。
29.一种组合物，该组合物包含如实施例24-28中任一项所述的多肽。
30.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如实施例24-28中任一项所述的多肽。
31.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如实施例30所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
32.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例30所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
33.一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例32所述的宿主细胞；以及，任选地
b)回收该多肽。
实例
实例1：
在该实例中，在用和不用酶孵育之后，测量从纤维分离的淀粉和谷蛋白的量。
纤维样品在纤维加压后从湿磨设备获得，总干物质含量为20％。将样品重悬于缓冲液(pH 4，0.02M乙酸钠)中，至100-g含有5％干固体的浆液。以每克干固体底物(DS)350μg的最终比率向该浆液中添加酶。参见表1中的样品详细信息。
表1
Figure BDA0002325988800000491
表1：每个测试样品中的温度和酶组合物。*所使用的纤维素分解酶组合物是来自诺维信公司的^所使用的GH5多肽是SEQ ID NO:3的成熟多肽。″所使用的GH30多肽SEQ ID NO:4的成熟多肽。
将样品在空气加热的培养箱中于52℃和40℃(参见表1)的温度下恒定振荡120分钟。孵育后，在加工前将样品在冰水(5℃)中快速冷却。将浆液转移到150-微米筛上，同时收集通过的滤液。
使用刮刀按压保留在筛上的纤维以尽可能多地回收滤液。然后将按压的纤维转移到含有200-ml水的烧杯中并搅拌。将该浆液通过150-微米筛，并将收集的滤液与第一次的滤液合并。再一次重复上述按压、洗涤和过滤步骤，这样使得回收最终的滤液并与前两次的滤液合并。然后将合并的滤液真空过滤，这次通过玻璃微滤纸(沃特曼公司)，其保留从纤维中释放并通过150-微米筛网的不溶性固体。在滤纸上通过200ml水以去除任何痕量的可溶物后，将保留在滤纸上的总不溶性固体干燥并称重。据报道干重为释放的淀粉+谷蛋白，作为起始底物的纤维干物质的百分比(w/w)。结果示于表2中。
表2
在40℃和52℃下，GH5和/或GH30酶添加的效果从淀粉和谷蛋白产量的增加中显而易见。
实例2：
酶：
GH30木聚糖酶A：GH30木聚糖酶源自枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:5)
GH30木聚糖酶B：GH30木聚糖酶源自枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:6)
GH30木聚糖酶C：GH30木聚糖酶源自枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:7)
Celluclast/Celluclast 1.5L：可商购的纤维素酶组合物(诺维信公司，丹麦)。
在pH 3.8下进行10g纤维测定，在52℃下孵育1小时，每克玉米35ug酶蛋白的剂量；将含有GH30木聚糖酶A、GH30木聚糖酶B或GH30木聚糖酶C的酶共混物与Celluclast组合使用。由20％(w/w)GH30木聚糖酶A、GH30木聚糖酶B或GH30木聚糖酶C和剩余80％(w/w)(来自Celluclast)组成共混物。为了比较，包括仅含有Celluclast的酶组合物。在纤维测定中，将具有纤维中有15.52％残留淀粉和12.00％残留蛋白质的玉米纤维用作底物。测量淀粉+谷蛋白(干物质)从指定剂量的玉米纤维的释放；结果提供于下表中。
表3.
Figure BDA0002325988800000511
GH30木聚糖酶A、GH30木聚糖酶B和GH30木聚糖酶C与纤维素酶(例如Celluclast)的组合的添加可以显著提高玉米湿磨过程中淀粉+谷蛋白的产率。
实例3：GH5木聚糖酶处理实验室玉米湿磨纤维
酶：
GH5木聚糖酶：GH5_21木聚糖酶源自金黄杆菌属，具有SEQ ID NO:8(WO2016/005522的SEQ ID NO:26)的成熟蛋白的氨基酸序列。
酶混合物D：主要由来自外源供体的纤维二糖水解酶(CBH I和II)和来自天然木霉属宿主的内切葡聚糖酶(EG1和2)组成。
酶混合物T：主要由来自天然木霉属宿主的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶组成(约80％)，并且剩余约20％的蛋白质由来自外源供体的木聚糖酶GH10组成。
Frontia
Figure BDA0002325988800000512
是商业产品，由木聚糖酶和纤维素酶的混合物组成。(诺维信公司，丹麦)。
该10-g纤维测定通常包括：在酶存在下，在与该方法相关的条件(pH 3.5至4，温度约52℃)下并且经1至4hr之间的时间段，孵育从湿磨设备获得的湿纤维样品。孵育后，将纤维转移并按压在筛(典型地为75微米或更小)上，在其中然后收集主要由分离的淀粉和谷蛋白组成的滤过物。在筛上进行多次洗涤，并将洗涤液与初始滤液一起收集。然后将收集的滤液通过漏斗过滤器(具有0.45微米开口的玻璃过滤器)，以进一步将不溶性固体(主要为淀粉和谷蛋白)与剩余滤液(主要是溶解的固体)分离。将这些回收的不溶性固体洗涤，并且然后烘干至干燥。称重不溶的干燥物质，然后使用改良的Ewers方法(酸水解和通过液相色谱法测量葡萄糖)分析淀粉含量。
在pH 4进行10-g纤维测定，如下所述，将纤维在50℃下孵育2小时用不同的酶处理。对照是不添加任何酶的纤维孵育。Frontia
Figure BDA0002325988800000522
是用于此工业应用商业产品，由木聚糖酶和纤维素酶的混合物组成。GH5与两种不同的酶混合物组合给料，这两种酶混合物均源自里氏木霉发酵。将GH5的以添加的总酶蛋白的20％给料，剩余80％由酶混合物背景组成。在所有处理中添加的酶蛋白的总量为每克干纤维500微克。酶混合物D主要由来自外源供体的纤维二糖水解酶(CBH I和II)和来自天然木霉属宿主的内切葡聚糖酶(EG1和2)组成。酶混合物T主要由来自天然木霉属宿主的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶组成(约80％)，剩余约20％的蛋白质由来自外源供体的木聚糖酶GH10组成。结果显示于下表中：
表4
(±一个标准差，n＝3)
实例4
方法说明15mL纤维洗涤测定
15mL细纤维测定法通常包括在与酶相关的条件下(pH 4.0，大约40D<2)4，在酶的存在下，将从玉米湿磨设备获得的湿细纤维样品与杂交培养箱充分混合孵育一小时。孵育后，将纤维通过Millipore无菌过滤器管顶部过滤器单元进行真空过滤。用蒸馏水将纤维重悬至30mL的体积，彻底涡旋并再次真空过滤。收集的滤液由提取的淀粉和谷蛋白组成。将滤液在Avanti J-E中以5,000rpm离心7分钟以沉淀淀粉。使用50mL血清移液器缓慢去除上清液，以免干扰淀粉和谷蛋白沉淀。将该洗涤和离心程序再重复两次以去除溶解的低聚物。
洗涤后，剩余物总体积为5mL(包括淀粉沉淀)。使用EZ-2Elite溶剂蒸发器去除过量的水(方法：水性，最高65℃，3小时，3,000rpm，120mbar)。此后，将沉淀物(含有淀粉和谷蛋白)重悬于500uL的1.6M盐酸中，并在90℃下加热45分钟(1,000rpm)。该孵育将淀粉颗粒分解成糖单体。酸水解后，使用625uL的1.4M氢氧化钠淬灭反应，并冷却至室温。然后，经由添加345uL二硝基水杨酸试剂(DNS)确定还原糖的量。将样品在95℃下以300rpm孵育10分钟。可用的还原糖与DNS反应，导致橙红色光谱增加(Miller，分析化学(AnalyticalChemistry)1959)。然后将样品以5,000rpm离心30秒以收集冷凝液并冷却至环境温度。将每个样品800uL转移到96深孔板上，并使用多通道移液管在蒸馏水中稀释。然后使用通道移液管将200uL转移至Nunc F 96孔板中。使用Tecan Infinite M1000读取560纳米(nm)的吸光度
GH5优于Frontia
Figure BDA0002325988800000531
15mL细纤维测定法在pH 4下进行，在40℃下将纤维用不同的酶处理孵育1小时。对照是不添加酶的纤维孵育。Frontia是商业酶，用于在湿磨过程中从纤维中释放淀粉。GH5共混物由完整的里氏木霉纤维素复合物(80％)和具有SEQ ID NO:8的成熟蛋白的氨基酸序列(20％)的GH5木聚糖酶组成。每克干燥的纤维固体(ug/gDS)中，所有酶共混物均添加了总计500微克的酶蛋白。所有处理一式三份地进行。在560nm处读取吸光度，并使用葡萄糖标准物将其转化为葡萄糖(g/L)。然后使用纤维干燥的固体对计算的葡萄糖进行归一化，并报告为来自纤维的淀粉释放。吸光度值和从纤维释放的淀粉报告于表5中。
表5：来自15mL纤维测定的结果
Figure BDA0002325988800000533
Figure BDA0002325988800000541
(±标准差，n＝3)
实例5-GH5多样性
15mL细纤维测定法在pH 4下进行，在40℃下将纤维用表6中的不同的酶处理孵育1小时。对照是不添加酶的纤维孵育。所有酶共混物均含有400ug/gDS的里氏木霉(对照)。如表6所示，将辅助GH5’s以25ug/gDS添加到适当的处理中。在560nm处读取吸光度，并使用葡萄糖标准物将其转化为葡萄糖(g/L)。然后使用纤维干燥的固体对计算的葡萄糖进行归一化，并报告为来自纤维的淀粉释放。吸光度值和从纤维释放的淀粉报告于表7中。
表7：GH5多样性测试
Figure BDA0002325988800000542
*包含n-his标签。所有野生型酶均具有n-his标签，已显示其具有较低酶活性。
表8：GH5多样性结果
Figure BDA0002325988800000543
(±标准差，n＝3)。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 湿磨中的GH5和GH30
<130> 14211-WO-PCT[2]
<160> 12
<170> PatentIn3.5版
<210> 1
<211> 655
<212> PRT
<213> Ruminiclostridium thermocellum
<400> 1
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala His His His His His
20 25 30
His Pro Arg Ala Asp Pro Gln Arg Gly Arg Pro Tyr Leu Asn Ser Ala
35 40 45
Arg Thr Thr Phe Val Gly Asp Asn Gly Gln Pro Leu Arg Gly Pro Tyr
50 55 60
Ile Ser Thr Glu Trp Thr Ser Ala Ala Pro Tyr Asp Gln Ile Ala Arg
65 70 75 80
Ile Lys Asn Leu Gly Phe Asn Ala Val His His Tyr Ala Glu Cys Phe
85 90 95
Asp Ile Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Ser Lys Ser Pro Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Thr Glu Ile Asp Lys Val Val Glu Arg Thr Arg Glu Leu Gly Leu Tyr
115 120 125
Leu Val Met Thr Ile Gly Asn Gly Ala Asn Asn Gly Asn His Asn Thr
130 135 140
Arg Tyr Ala Lys Asp Phe Trp Ser Phe Tyr Ser Ser Arg Tyr Ala Asn
145 150 155 160
Glu Thr His Val Leu Tyr Glu Ile His Asn Glu Pro Val Ala Trp Gly
165 170 175
Pro Pro Tyr Ser Ser Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ala Val Glu Met
180 185 190
Asn Val Asp Val Tyr Lys Thr Ile Arg Ala Asn Ala Pro Lys Thr Pro
195 200 205
Val Leu Ile Phe Ser Tyr Ser Val Phe Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr
210 215 220
Glu Ala Leu Lys Asp Ile Gln Ala Phe Asn Ser Ala Val Phe Gly Lys
225 230 235 240
Gln Asp Ala Val Trp Thr Asn Glu Ala Val Ala Phe His Gly Tyr Ala
245 250 255
Gly Trp Glu Ala Thr Ser Thr Ala Val Asp Gly Leu Leu Lys Ala Gly
260 265 270
Tyr Pro Cys Phe Met Thr Glu Tyr Ala Gly Gly Ala Trp Gly Ser Gly
275 280 285
Thr Gly Gly Phe Asp Ile Gln Leu Thr Ser Glu Leu Glu Arg Met Gly
290 295 300
Val Ser Trp Leu Thr Phe Gln Tyr Ile Pro Pro Ser Gly Val Ser Asp
305 310 315 320
Asp Val Thr Lys Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Leu Val Glu Asn Ala Gly
325 330 335
Leu Ser Trp Lys Pro Asp Tyr Gly Asn Trp Pro Ala Ala Arg Gly Val
340 345 350
His Gly Asn Gly Gly Leu Pro Arg Lys Thr Ser Thr Trp Val Asn Asn
355 360 365
Phe Leu Thr Gly Thr Thr Arg Ile Glu Ala Glu Asp Phe Asp Trp Gly
370 375 380
Gly Asn Asp Val Ser Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Glu Asn Lys Gly Ala
385 390 395 400
Gln Tyr Arg Leu Asp Glu Ala Val Asp Ile Glu Thr Thr Lys Asp Ala
405 410 415
Asp Gly Gly Tyr Asn Val Gly Trp Ile Glu Asp Gly Glu Trp Leu Glu
420 425 430
Tyr Thr Ile Trp Val Gln His Pro Gly Tyr Tyr Asn Leu Ala Leu Arg
435 440 445
Val Ala Asn Asn Ser Gly Gly Ser Val Gln Val Asn Phe Gly Asn Gln
450 455 460
Asp Lys Thr Gly Thr Trp Val Leu Pro Val Thr Gly Gly Val Gln Thr
465 470 475 480
Trp Lys Thr Asp Thr Arg Gln Val Phe Leu Gly Ser Gly Arg Gln Lys
485 490 495
Leu Arg Ile Asn Ala Leu Ser Gly Gly Phe Asn Leu Asn Trp Ile Glu
500 505 510
Leu Ser Pro Val Ser Thr Gly Pro Ile Ala Asp Gly Thr Tyr Lys Phe
515 520 525
Leu Asn Arg Ala Asn Thr Met Thr Leu Gln Glu Val Thr Ser Asn Asn
530 535 540
Ser Ile Val Thr Ser Thr Tyr Lys Gly Thr Ala Asp Gln His Trp Lys
545 550 555 560
Ile Gln His Ile Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Ile Ser Ser Ala Gly Arg
565 570 575
Gly Trp Asn Trp Asn Trp Trp Met Gly Phe Gly Thr Val Gly Trp Trp
580 585 590
Gly Thr Gly Ser Gly Thr Cys Phe Ile Ile Arg Pro Thr Gly Asp Gly
595 600 605
Tyr Tyr Arg Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Thr Asn Leu Glu Ile Ser
610 615 620
Asn Asn Asp Ser Ser Lys Ile Glu Gly Lys Ala Tyr His Glu Gly Ala
625 630 635 640
Asn Gln Gln Trp Ala Ile Gln Leu Pro Ser Ala Pro Val Phe Pro
645 650 655
<210> 2
<211> 555
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属-18054
<400> 2
His His His His His His Pro Arg Leu Thr Val Pro Pro Gly Ala Pro
1 5 10 15
Ala Glu Ala Trp Ser Gly Met Pro Thr Pro Lys Leu His Val Ser Gly
20 25 30
Asn Gln Leu Val Asn Ala Asn Gly Gln Pro Val Leu Leu Ser Gly Trp
35 40 45
His Gln Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Thr Tyr Gln Ser Ser Ser Tyr Tyr
50 55 60
Leu Asp Arg Asn Gly Gly Asn Arg His Ala Ala Asn Leu Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Asp Ile Thr Asp Thr Phe Thr Asp Thr Ser Pro Lys Tyr Gly Asn
85 90 95
Asn His Gly Trp Tyr Met Asn Gln Val Arg Leu Phe Ile Asp Arg Glu
100 105 110
Asp Met Gly Asp Val Ala Glu Gly Thr Tyr Asn Phe Ala Gly Leu Gln
115 120 125
Ala Val Thr Gln Asn Val Ile Ile Pro Tyr Ile Asn Tyr Ala Arg Thr
130 135 140
Lys Gly Leu Tyr Val Thr Leu Gly Leu Asp Phe Thr Leu Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gln Ala Thr Thr Gln Ala Asn Leu Asp Lys Phe Asn Gln Ile Trp Ser
165 170 175
Tyr Leu Ala Ser Arg Pro Glu Ile Arg Ser Ala Asp Asn Val Met Phe
180 185 190
Glu Ile Ile Asn Glu Pro Val Leu Ser Tyr Ala Asp Gly Arg Trp Gly
195 200 205
Gly His Pro Ser Asp Pro His Phe Ile Ala Phe Trp Asn Asp Leu Arg
210 215 220
Ser Phe Gln Asn Ser Ile Ile Ser Ser Ile Arg Ala Gln Gly Ala Asp
225 230 235 240
Asn Val Ile Trp Ala Ala Gly Leu Gly Trp Asp Gln Tyr Tyr Gln Leu
245 250 255
Cys Ala Ser His Pro Leu Thr Asp Pro Leu Asn Asn Val Gly Tyr Ala
260 265 270
Val His Trp Tyr Pro Gly Tyr Gly Ala Gly Asp Asn Tyr Ser Val Leu
275 280 285
Gln Gln Gln Trp Asp Thr Asn Ile Lys Pro Cys Ala Asp Asn Tyr Pro
290 295 300
Ile Asn Ile Thr Glu Thr Thr Trp Phe Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ser
305 310 315 320
Asp Tyr Trp Asn Leu Phe Asn Gly Ser Ser Glu Gly Phe Gly Lys Asn
325 330 335
Thr Lys Ala Ile Phe Thr Ala Ala Gly Asn Ala Ser Ile Ala Val His
340 345 350
Met Asn Gly Phe Leu Leu Ala Pro Gly Ala Arg Ser Ser Phe Ala Asp
355 360 365
Pro Thr Ala Gly Leu Leu Tyr Asp Gly Asn Thr Ala Arg Asp Gly Met
370 375 380
Ala Arg Phe Ile Phe Glu Trp Tyr Tyr Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro
385 390 395 400
Trp Asn Gly Ile Trp Asn Gly Leu Phe Thr Gly Ser Thr Tyr Lys Phe
405 410 415
Val Asn Arg Ala Thr Gly Lys Asn Met Asp Val Pro Gly Gly Gln Asn
420 425 430
Asn Asn Asn Leu Gln Leu Asn Gln Trp Thr Asp Asn Gly Ala Thr Ala
435 440 445
Gln Arg Trp Val Val Asp Asp Met Gly Thr Phe Asn Asn Ile Tyr Arg
450 455 460
Met Lys Ser Val Ser Ser Ser Asp Gly Lys Val Met Asp Val Arg Asn
465 470 475 480
Gly Thr Lys Asn Asn Gly Glu Ala Ile Gln Leu Met Gln Asp Phe Ser
485 490 495
Asn Thr Ala Gln Arg Phe Arg Ile Ile Arg Leu Ser Asn Gly Tyr Trp
500 505 510
Ser Ile Ile Asn Val Asn Ser Asn Lys Ala Val Glu Val Ala Gly Gly
515 520 525
Ala Ser His Asp Gly Ala Leu Leu Gln Gln Asn Met Tyr Arg Gly Asp
530 535 540
His His Gln Gln Trp Gln Leu Val Gln Ile Gln
545 550 555
<210> 3
<211> 585
<212> PRT
<213> 金黄杆菌属-10696
<400> 3
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala His His His His His
20 25 30
His Pro Arg Asp Glu Lys Asn Leu Leu Glu Asp Pro Asp Ser Asn Leu
35 40 45
Ser Ala Gly Ala Ser Ala Arg Ala Leu Ala Ala Thr Pro Met Leu His
50 55 60
Val Gly Gly Arg Tyr Leu Lys Asp Pro Cys Asp Asn Asn Val Val Leu
65 70 75 80
His Gly Val Ala Ile Thr Pro Ser Pro Trp Phe Asn Gly Cys Gln Tyr
85 90 95
Gly Ala Asn Ser Gly Tyr Cys Thr Trp Asp Asn Tyr Asn Val Gln Gly
100 105 110
Ala Leu Asn Tyr Asn Lys Ala Val Met Asn Lys Leu Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Asp Gly Trp Tyr Leu Asn Tyr Ile Arg Leu His Ile Asp Pro Tyr Trp
130 135 140
Thr Asn Asp Pro Gly Pro Ala Ile Pro Glu Asn Asp Ile Ser Arg Phe
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Arg Leu Val Thr Tyr Thr Asp Gln Val Ile Ile Pro Leu
165 170 175
Ile Asn His Ala Arg Ser Leu Gly Met Tyr Val Ile Leu Arg Pro Pro
180 185 190
Gly Val Cys Pro Asn Arg Ile Ala Val Asn Asp Ala Tyr His Ser Tyr
195 200 205
Leu Lys Thr Val Trp Thr Phe Leu Ser Gln His Pro Gly Leu Lys Asn
210 215 220
Ala Asp Asn Val Met Phe Glu Leu Ala Asn Glu Pro Val Glu Ile Leu
225 230 235 240
Gly Thr Asn Gly Thr Trp Gly Ser Thr Gly Asn Glu His Phe Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Asn Phe Phe Gln Pro Leu Val Asn Ile Ile Arg Asn Asn Gly
260 265 270
Ala Asn Asn Val Cys Trp Ile Pro Gly Thr Gly Trp Gln Ser His Tyr
275 280 285
Gln Gly Tyr Val Asn Asn Gln Ile Thr Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala
290 295 300
Val His Ile Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gly Leu Ser Asn Tyr Gln Ala
305 310 315 320
Phe Gln Asn Ala Trp Asn Ile Asn Val Lys Pro Ile Ala Asp Ile Ala
325 330 335
Pro Ile Ala Ile Thr Glu Thr Asp Trp Ala Pro Gln Gly Tyr Gly Thr
340 345 350
Phe Gly Ile Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ser Gly Phe Gly Ala
355 360 365
Asn Leu Lys Tyr Ile Val Asp Gln Ser Gly Asn Val Ser Trp Asn Val
370 375 380
Leu Ala Pro Asp Asn Leu Leu His Lys Gly Asp Pro Asn Ala Gly Thr
385 390 395 400
Ala Tyr Asn Asn Asp Trp Glu Ala Cys Ala Ala Pro Val Lys Gln Trp
405 410 415
Phe Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Asn Tyr Pro Val Gly Asn Cys Asn Thr
420 425 430
Thr Ser Ser Leu Val Asn Asn Gly Ile Tyr Glu Ile Glu Phe Gln Thr
435 440 445
Asp Ala Asn Lys Val Val Asp Leu Lys Ser Gly Glu Asp Ala Asn Gly
450 455 460
Ala Val Leu Arg Pro Trp Thr Arg Asn Gly Ala Ala Ala Gln Arg Trp
465 470 475 480
Val Ala Ile Asp Ala Gly Asn Gly Tyr Trp Arg Phe Val Ser Lys Ala
485 490 495
Ser Ala Thr Asn Arg Cys Ile Asp Leu Ala Ser Asn Ser Asn Thr Leu
500 505 510
Gly Thr Ser Ile Arg Leu Trp Gln Asn Tyr Gly Asn Asp Ala Gln Ala
515 520 525
Trp Gln Val Val Ala Val Ser Asn Gly Tyr Tyr Lys Ile Leu Ser Lys
530 535 540
Val Asp Pro Thr Arg Gly Trp Asp Ile Pro Asn Cys Thr Met Asp Gly
545 550 555 560
Asn Ser Asn Leu His Leu Trp Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Cys Gln Leu
565 570 575
Phe Lys Phe Lys Tyr Ile Gly Met Asn
580 585
<210> 4
<211> 391
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 4
Ala Ala Ser Asp Val Thr Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile
1 5 10 15
Arg Gly Phe Gly Gly Met Asn His Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr
20 25 30
Ala Ala Gln Arg Glu Thr Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly
35 40 45
Phe Ser Ile Leu Arg Ile His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr
50 55 60
Lys Glu Val Glu Thr Ala Lys Ser Ala Val Lys His Gly Ala Ile Val
65 70 75 80
Phe Ala Ser Pro Trp Asn Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn
85 90 95
Arg Asn Gly Asp Thr Ser Ala Lys Arg Leu Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala
100 105 110
Ala Tyr Ala Gln His Leu Asn Asp Phe Val Thr Phe Met Lys Asn Asn
115 120 125
Gly Val Asn Leu Tyr Ala Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro Asp Tyr Ala
130 135 140
His Glu Trp Thr Trp Trp Thr Pro Gln Glu Ile Leu Arg Phe Met Arg
145 150 155 160
Glu Asn Ala Gly Ser Ile Asn Ala Arg Val Ile Ala Pro Glu Ser Phe
165 170 175
Gln Tyr Leu Lys Asn Leu Ser Asp Pro Ile Leu Asn Asp Pro Gln Ala
180 185 190
Leu Ala Asn Met Asp Ile Leu Gly Thr His Leu Tyr Gly Thr Gln Val
195 200 205
Ser Gln Phe Pro Tyr Pro Leu Phe Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Asp
210 215 220
Leu Trp Met Thr Glu Val Tyr Tyr Pro Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ala
225 230 235 240
Asp Arg Trp Pro Glu Ala Leu Asp Val Ser Gln His Ile His Asn Ala
245 250 255
Met Val Glu Gly Asp Phe Gln Ala Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg
260 265 270
Ser Tyr Gly Pro Met Lys Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr
275 280 285
Asn Met Ala His Phe Ser Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Ile
290 295 300
Asp Ala Thr Lys Asn Pro Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys
305 310 315 320
Gly Asp Asn Lys Val Val Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly
325 330 335
Val Asn Gln Asn Phe Val Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Asn Val Ser
340 345 350
Arg Trp Ile Thr Ser Ser Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Val Ser Gly Asn His Phe Trp Ala His Leu Pro Ala Gln Ser Val
370 375 380
Thr Thr Phe Val Val Asn Arg
385 390
<210> 5
<211> 417
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 5
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr
20 25 30
Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly Met
35 40 45
Asn Trp Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg Glu Thr
50 55 60
Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Ile
65 70 75 80
His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys Glu Val Glu Thr Ala
85 90 95
Lys Ser Ala Leu Lys Leu Gly Ala Ile Val Phe Ala Ser Pro Trp Asn
100 105 110
Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn Arg Asn Gly Asp Thr Ser
115 120 125
Ala Lys Arg Leu Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu
130 135 140
Asn Asp Phe Val Thr Phe Met Lys Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp
165 170 175
Thr Pro Gln Glu Met Leu Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile
180 185 190
Asn Ala Arg Val Ile Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Leu Lys Asn Leu
195 200 205
Ser Asp Pro Ile Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Ala Asn Met Asp Ile
210 215 220
Leu Gly Thr His Leu Tyr Gly Thr Gln Leu Ser Gln Phe Pro Tyr Pro
225 230 235 240
Leu Phe Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Asp Leu Trp Met Thr Glu Val
245 250 255
Tyr Tyr Pro Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala
260 265 270
Leu Asp Val Ser Gln His Ile His Asn Ala Met Val Glu Gly Asp Phe
275 280 285
Gln Ala Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro Met Lys
290 295 300
Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala His Phe Ser
305 310 315 320
Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Ile Asp Ala Thr Lys Asn Pro
325 330 335
Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly Asp Asn Lys Val Val
340 345 350
Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly Val Asn Gln Asn Phe Val
355 360 365
Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Asn Val Ser Arg Trp Ile Thr Ser Ser
370 375 380
Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Gly Asn His
385 390 395 400
Phe Trp Ala His Leu Pro Ala Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Val Asn
405 410 415
Arg
<210> 6
<211> 417
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 6
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr
20 25 30
Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly Met
35 40 45
Asn Trp Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg Glu Thr
50 55 60
Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Ile
65 70 75 80
His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys Glu Val Glu Thr Ala
85 90 95
Lys Ser Ala Val Leu Leu Gly Ala Ile Val Phe Ala Ser Pro Trp Asn
100 105 110
Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn Arg Asn Gly Asp Thr Ser
115 120 125
Ala Lys Arg Leu Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu
130 135 140
Asn Asp Phe Val Thr Phe Met Lys Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp
165 170 175
Thr Pro Gln Glu Met Leu Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile
180 185 190
Asn Ala Arg Val Ile Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Leu Lys Asn Leu
195 200 205
Ser Asp Pro Ile Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Ala Asn Met Asp Ile
210 215 220
Leu Gly Thr His Leu Tyr Gly Thr Gln Leu Ser Gln Phe Pro Tyr Pro
225 230 235 240
Leu Phe Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Asp Leu Trp Met Thr Glu Val
245 250 255
Tyr Tyr Pro Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala
260 265 270
Leu Asp Val Ser Gln His Ile His Asn Ala Met Val Glu Gly Asp Phe
275 280 285
Gln Ala Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro Met Lys
290 295 300
Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala His Phe Ser
305 310 315 320
Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Ile Asp Ala Thr Lys Asn Pro
325 330 335
Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly Asp Asn Lys Val Val
340 345 350
Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly Val Asn Gln Asn Phe Val
355 360 365
Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Asn Val Ser Arg Trp Ile Thr Ser Ser
370 375 380
Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Gly Asn His
385 390 395 400
Phe Trp Ala His Leu Pro Ala Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Val Asn
405 410 415
Arg
<210> 7
<211> 417
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 7
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr
20 25 30
Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly Met
35 40 45
Asn His Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg Glu Thr
50 55 60
Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Ile
65 70 75 80
His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys Glu Val Glu Thr Ala
85 90 95
Lys Ser Ala Val Lys His Gly Ala Ile Val Phe Ala Ser Pro Trp Asn
100 105 110
Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn Arg Asn Gly Asp Thr Ser
115 120 125
Ala Lys Arg Leu Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu
130 135 140
Asn Asp Phe Val Thr Phe Met Lys Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp
165 170 175
Thr Pro Gln Glu Ile Leu Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile
180 185 190
Asn Ala Arg Val Ile Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Leu Lys Asn Leu
195 200 205
Ser Asp Pro Ile Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Ala Asn Met Asp Ile
210 215 220
Leu Gly Thr His Leu Tyr Gly Thr Gln Val Ser Gln Phe Pro Tyr Pro
225 230 235 240
Leu Phe Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Asp Leu Trp Met Thr Glu Val
245 250 255
Tyr Tyr Pro Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala
260 265 270
Leu Asp Val Ser Gln His Ile His Asn Ala Met Val Glu Gly Asp Phe
275 280 285
Gln Ala Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro Met Lys
290 295 300
Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala His Phe Ser
305 310 315 320
Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Ile Asp Ala Thr Lys Asn Pro
325 330 335
Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly Asp Asn Lys Val Val
340 345 350
Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly Val Asn Gln Asn Phe Val
355 360 365
Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Asn Val Ser Arg Trp Ile Thr Ser Ser
370 375 380
Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Gly Asn His
385 390 395 400
Phe Trp Ala His Leu Pro Ala Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Val Asn
405 410 415
Arg
<210> 8
<211> 557
<212> PRT
<213> 金黄杆菌属
<400> 8
Met His His His His His His Asp Glu Lys Asn Leu Leu Glu Asp Pro
1 5 10 15
Asp Ser Asn Leu Ser Ala Gly Ala Ser Ala Arg Ala Leu Ala Ala Thr
20 25 30
Pro Met Leu His Val Gly Gly Arg Tyr Leu Lys Asp Pro Cys Asp Asn
35 40 45
Asn Val Val Leu His Gly Val Ala Ile Thr Pro Ser Pro Trp Phe Asn
50 55 60
Gly Cys Gln Tyr Gly Ala Asn Ser Gly Tyr Cys Thr Trp Asp Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Val Gln Gly Ala Leu Asn Tyr Asn Lys Ala Val Met Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Ala Ala Asp Gly Trp Tyr Leu Asn Tyr Ile Arg Leu His Ile
100 105 110
Asp Pro Tyr Trp Thr Asn Asp Pro Gly Pro Ala Ile Pro Glu Asn Asp
115 120 125
Ile Ser Arg Phe Asn Tyr Asn Arg Leu Val Thr Tyr Thr Asp Gln Val
130 135 140
Ile Ile Pro Leu Ile Asn His Ala Arg Ser Leu Gly Met Tyr Val Ile
145 150 155 160
Leu Arg Pro Pro Gly Val Cys Pro Asn Arg Ile Ala Val Asn Asp Ala
165 170 175
Tyr His Ser Tyr Leu Lys Thr Val Trp Thr Phe Leu Ser Gln His Pro
180 185 190
Gly Leu Lys Asn Ala Asp Asn Val Met Phe Glu Leu Ala Asn Glu Pro
195 200 205
Val Glu Ile Leu Gly Thr Asn Gly Thr Trp Gly Ser Thr Gly Asn Glu
210 215 220
His Phe Ala Ala Leu Lys Asn Phe Phe Gln Pro Leu Val Asn Ile Ile
225 230 235 240
Arg Asn Asn Gly Ala Asn Asn Val Cys Trp Ile Pro Gly Thr Gly Trp
245 250 255
Gln Ser His Tyr Gln Gly Tyr Val Asn Asn Gln Ile Thr Gly Gly Asn
260 265 270
Ile Gly Tyr Ala Val His Ile Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gly Leu Ser
275 280 285
Asn Tyr Gln Ala Phe Gln Asn Ala Trp Asn Ile Asn Val Lys Pro Ile
290 295 300
Ala Asp Ile Ala Pro Ile Ala Ile Thr Glu Thr Asp Trp Ala Pro Gln
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Thr Phe Gly Ile Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Phe Gly Ala Asn Leu Lys Tyr Ile Val Asp Gln Ser Gly Asn Val
340 345 350
Ser Trp Asn Val Leu Ala Pro Asp Asn Leu Leu His Lys Gly Asp Pro
355 360 365
Asn Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Asn Asp Trp Glu Ala Cys Ala Ala Pro
370 375 380
Val Lys Gln Trp Phe Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Asn Tyr Pro Val Gly
385 390 395 400
Asn Cys Asn Thr Thr Ser Ser Leu Val Asn Asn Gly Ile Tyr Glu Ile
405 410 415
Glu Phe Gln Thr Asp Ala Asn Lys Val Val Asp Leu Lys Ser Gly Glu
420 425 430
Asp Ala Asn Gly Ala Val Leu Arg Pro Trp Thr Arg Asn Gly Ala Ala
435 440 445
Ala Gln Arg Trp Val Ala Ile Asp Ala Gly Asn Gly Tyr Trp Arg Phe
450 455 460
Val Ser Lys Ala Ser Ala Thr Asn Arg Cys Ile Asp Leu Ala Ser Asn
465 470 475 480
Ser Asn Thr Leu Gly Thr Ser Ile Arg Leu Trp Gln Asn Tyr Gly Asn
485 490 495
Asp Ala Gln Ala Trp Gln Val Val Ala Val Ser Asn Gly Tyr Tyr Lys
500 505 510
Ile Leu Ser Lys Val Asp Pro Thr Arg Gly Trp Asp Ile Pro Asn Cys
515 520 525
Thr Met Asp Gly Asn Ser Asn Leu His Leu Trp Asp Tyr Tyr Gly Thr
530 535 540
Ser Cys Gln Leu Phe Lys Phe Lys Tyr Ile Gly Met Asn
545 550 555
<210> 9
<211> 2731
<212> DNA
<213> 鞘氨醇杆菌属
<220>
<221> CDS
<222> (501)..(2231)
<400> 9
tgactatggc ttggaaggca gtggcaacaa atgtaaaggg ctcatcgcct atgtcggcta 60
catcgaaggc aaaggggcca aagtggatgg aatcggcacc cagatgcaca tcgatatcaa 120
taccagtaaa gaccaaatcg tcagcatgtt caatctattg gccgcaacag gcaagctgat 180
taaagtgtct gagctcgata tcggccttgg aagcggcata aagaccagca atgcaacagc 240
tgaaatgtat cagaaacagg ctgatttata caagtttgtc gttgagaaat acctcgagat 300
cattcccaag gataaacagt acggtatcac cctatggagc ccgttggata gtccagacca 360
ggagggttca ttctggcgac gtggagagcc catcggctta tggaccgaag gatttgtccg 420
aaagccagcc tatcaggctg ttgctgaggc attgtcagct aaaaaataag atcattaatc 480
accctttaaa tatgtaaatt atg aga aca aac aac atg tgg tta ttg ctg atc 533
Met Arg Thr Asn Asn Met Trp Leu Leu Leu Ile
1 5 10
ttt tta tta gct att ttt tcc agc tgc tcg cgg ctg gaa gaa aaa aca 581
Phe Leu Leu Ala Ile Phe Ser Ser Cys Ser Arg Leu Glu Glu Lys Thr
15 20 25
ttg acc agc gaa tcc gaa aga agt ctt aaa tcc aat gtt tcc gcg caa 629
Leu Thr Ser Glu Ser Glu Arg Ser Leu Lys Ser Asn Val Ser Ala Gln
30 35 40
gcc gtt aca agc tgg ccg cgg cca acc ccg acc cta cat gtc gga ggc 677
Ala Val Thr Ser Trp Pro Arg Pro Thr Pro Thr Leu His Val Gly Gly
45 50 55
aag tac ctc aaa gat ccc tgc gac aat aat att gtc ctg cat ggg gta 725
Lys Tyr Leu Lys Asp Pro Cys Asp Asn Asn Ile Val Leu His Gly Val
60 65 70 75
gcc att acg cca agc cct tgg ttc aat ggc tgt cag tat gga gcc aac 773
Ala Ile Thr Pro Ser Pro Trp Phe Asn Gly Cys Gln Tyr Gly Ala Asn
80 85 90
tcg ggc tac tgc acc tgg gac aat tac aat gtg cag ggc gcg ctc aat 821
Ser Gly Tyr Cys Thr Trp Asp Asn Tyr Asn Val Gln Gly Ala Leu Asn
95 100 105
tac aac aag gcg gtc atg gac aag ctc agc agc gcc gcc gac ggt tgg 869
Tyr Asn Lys Ala Val Met Asp Lys Leu Ser Ser Ala Ala Asp Gly Trp
110 115 120
tac ctc aat tat atc cgt ctg cat att gat cct tat tgg acc aat gat 917
Tyr Leu Asn Tyr Ile Arg Leu His Ile Asp Pro Tyr Trp Thr Asn Asp
125 130 135
cca ggt gca ccc att ccc gaa gac gat atc tca cgg ttc aac tac aat 965
Pro Gly Ala Pro Ile Pro Glu Asp Asp Ile Ser Arg Phe Asn Tyr Asn
140 145 150 155
cgg ctg gtt acc tac acc gac cag gtc att gtc ccc tta atc aat cat 1013
Arg Leu Val Thr Tyr Thr Asp Gln Val Ile Val Pro Leu Ile Asn His
160 165 170
gcc cgc agc cgc ggt atg tat gtc atc ttg cgt cct cca ggt gta tgt 1061
Ala Arg Ser Arg Gly Met Tyr Val Ile Leu Arg Pro Pro Gly Val Cys
175 180 185
ccg cac cgt atc gcc gtc aat gat gcc tat cat acc tat ctc aag acc 1109
Pro His Arg Ile Ala Val Asn Asp Ala Tyr His Thr Tyr Leu Lys Thr
190 195 200
gta tgg acc ttt ctg tcg cag cac act gcc ctg aaa aat gca gac aat 1157
Val Trp Thr Phe Leu Ser Gln His Thr Ala Leu Lys Asn Ala Asp Asn
205 210 215
gtg atg ttt gaa ttg gct aac gag cct gtt gaa atc ctt ggg acg aac 1205
Val Met Phe Glu Leu Ala Asn Glu Pro Val Glu Ile Leu Gly Thr Asn
220 225 230 235
ggt act tgg gga atg acg gga aat gaa cat ttt gct gcg ctg aaa aat 1253
Gly Thr Trp Gly Met Thr Gly Asn Glu His Phe Ala Ala Leu Lys Asn
240 245 250
ttc ttt cag ccc tta gtc aat atc atc cgt aac aac ggt gcc aac aac 1301
Phe Phe Gln Pro Leu Val Asn Ile Ile Arg Asn Asn Gly Ala Asn Asn
255 260 265
gtc tgc tgg ata ccc ggt acc ggt tgg caa tcc cat tac cag ggt tat 1349
Val Cys Trp Ile Pro Gly Thr Gly Trp Gln Ser His Tyr Gln Gly Tyr
270 275 280
gtc act aat cag att acc ggc gga aat atc ggc tac gcc gta cat atc 1397
Val Thr Asn Gln Ile Thr Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Val His Ile
285 290 295
tat ccg ggt tat tgg ggc ggt gtc aat acc tat caa gct ttc caa aat 1445
Tyr Pro Gly Tyr Trp Gly Gly Val Asn Thr Tyr Gln Ala Phe Gln Asn
300 305 310 315
gcc tgg aat acc aat gtc aaa cct att gct gac att gcg cca atc gct 1493
Ala Trp Asn Thr Asn Val Lys Pro Ile Ala Asp Ile Ala Pro Ile Ala
320 325 330
att aca gag acc gac tgg gct cca cag gga tat ggt act ttc ggc aca 1541
Ile Thr Glu Thr Asp Trp Ala Pro Gln Gly Tyr Gly Thr Phe Gly Thr
335 340 345
gga tct acg ggc acc gct ggt ggt aat ggt ttt ggt gca aat ttg aaa 1589
Gly Ser Thr Gly Thr Ala Gly Gly Asn Gly Phe Gly Ala Asn Leu Lys
350 355 360
tat atc gtc gat cag tct ggc aat gtc agc tgg aac ctc ctt act ccc 1637
Tyr Ile Val Asp Gln Ser Gly Asn Val Ser Trp Asn Leu Leu Thr Pro
365 370 375
gat gac ctg ctc cat aaa ggg gac ccc aat gcc ggc acc gcc ttt aat 1685
Asp Asp Leu Leu His Lys Gly Asp Pro Asn Ala Gly Thr Ala Phe Asn
380 385 390 395
aac gat tgg gag gcc tgc gct gca ccg agc aaa caa tgg ttt cag caa 1733
Asn Asp Trp Glu Ala Cys Ala Ala Pro Ser Lys Gln Trp Phe Gln Gln
400 405 410
tat gcc gcc tac aat tac ccc atg tct aac tgc acc gtc acc agc ttg 1781
Tyr Ala Ala Tyr Asn Tyr Pro Met Ser Asn Cys Thr Val Thr Ser Leu
415 420 425
gtg aac aat ggg att tac gaa att gaa ttt cag acc gat gcc aac aaa 1829
Val Asn Asn Gly Ile Tyr Glu Ile Glu Phe Gln Thr Asp Ala Asn Lys
430 435 440
gtc ctt gat ttg aaa tca ggg gaa gat gcc aac ggt gca gca ctc aga 1877
Val Leu Asp Leu Lys Ser Gly Glu Asp Ala Asn Gly Ala Ala Leu Arg
445 450 455
ccc tgg acc cga aat ggt gca aac gca cag cgc tgg gta gcc atc gat 1925
Pro Trp Thr Arg Asn Gly Ala Asn Ala Gln Arg Trp Val Ala Ile Asp
460 465 470 475
gca ggc aat ggt tac tgg cgc ttt gtc tcc aaa gca agc gca agc agt 1973
Ala Gly Asn Gly Tyr Trp Arg Phe Val Ser Lys Ala Ser Ala Ser Ser
480 485 490
cgt tgc atc gat ctg aca agt aac agt aat gta ctc gga act gcg atc 2021
Arg Cys Ile Asp Leu Thr Ser Asn Ser Asn Val Leu Gly Thr Ala Ile
495 500 505
cgg ctc tgg cag aac tat ggc aat gat gcg cag gcc tgg aag gtt aca 2069
Arg Leu Trp Gln Asn Tyr Gly Asn Asp Ala Gln Ala Trp Lys Val Thr
510 515 520
gct gta gct aat ggc tat tac aaa att acc tca aag gta gat gcc aca 2117
Ala Val Ala Asn Gly Tyr Tyr Lys Ile Thr Ser Lys Val Asp Ala Thr
525 530 535
cgc ggt tgg gat gta ccc agc tgc acg atg gat ggc aac tcc aat ctg 2165
Arg Gly Trp Asp Val Pro Ser Cys Thr Met Asp Gly Asn Ser Asn Leu
540 545 550 555
cag ctt tgg gat tac tat ggt aca tcc tgt cag ttg ttt aaa ttc aaa 2213
Gln Leu Trp Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Cys Gln Leu Phe Lys Phe Lys
560 565 570
ttt ata gcg atg aac taa aggtcatctt ttcgcggtaa gctattctta 2261
Phe Ile Ala Met Asn
575
ccgcgaaata gtttatttta atcacatgaa aaacttcacc atgcgacaaa cacaatttaa 2321
aatcctgtta atgatcttcc tactatgcgg tttttcaggt acagcagcgt tcgcccaaga 2381
caaaaacttc catatttacc tttgctttgg acaatccaat atggaagggc acggtaaatt 2441
cgaacctcag gataccatgg ccatcgaacg gttcaaggta ctatcggcag tagattgccc 2501
cgatttaggg cggcaatatg gccgatggtc gccggcccgg gcaccgctca cacgctgcca 2561
caccggactt acacctgcag attattttag ccgaacactt gtagaaaatc ttcccaaaaa 2621
tattgaggtc ggtgtcatca acgtttcagt aggtggctgt catattcaat tatttgatca 2681
ggacagcaca gcaagttatg ttgcaaagtc accggaatgg atgaaatcca 2731
<210> 10
<211> 576
<212> PRT
<213> 鞘氨醇杆菌属
<400> 10
Met Arg Thr Asn Asn Met Trp Leu Leu Leu Ile Phe Leu Leu Ala Ile
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Phe Ser Ser Cys Ser Arg Leu Glu Glu Lys Thr Leu Thr Ser Glu Ser
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Glu Arg Ser Leu Lys Ser Asn Val Ser Ala Gln Ala Val Thr Ser Trp
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Pro Arg Pro Thr Pro Thr Leu His Val Gly Gly Lys Tyr Leu Lys Asp
50 55 60
Pro Cys Asp Asn Asn Ile Val Leu His Gly Val Ala Ile Thr Pro Ser
65 70 75 80
Pro Trp Phe Asn Gly Cys Gln Tyr Gly Ala Asn Ser Gly Tyr Cys Thr
85 90 95
Trp Asp Asn Tyr Asn Val Gln Gly Ala Leu Asn Tyr Asn Lys Ala Val
100 105 110
Met Asp Lys Leu Ser Ser Ala Ala Asp Gly Trp Tyr Leu Asn Tyr Ile
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Arg Leu His Ile Asp Pro Tyr Trp Thr Asn Asp Pro Gly Ala Pro Ile
130 135 140
Pro Glu Asp Asp Ile Ser Arg Phe Asn Tyr Asn Arg Leu Val Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Ile Val Pro Leu Ile Asn His Ala Arg Ser Arg Gly
165 170 175
Met Tyr Val Ile Leu Arg Pro Pro Gly Val Cys Pro His Arg Ile Ala
180 185 190
Val Asn Asp Ala Tyr His Thr Tyr Leu Lys Thr Val Trp Thr Phe Leu
195 200 205
Ser Gln His Thr Ala Leu Lys Asn Ala Asp Asn Val Met Phe Glu Leu
210 215 220
Ala Asn Glu Pro Val Glu Ile Leu Gly Thr Asn Gly Thr Trp Gly Met
225 230 235 240
Thr Gly Asn Glu His Phe Ala Ala Leu Lys Asn Phe Phe Gln Pro Leu
245 250 255
Val Asn Ile Ile Arg Asn Asn Gly Ala Asn Asn Val Cys Trp Ile Pro
260 265 270
Gly Thr Gly Trp Gln Ser His Tyr Gln Gly Tyr Val Thr Asn Gln Ile
275 280 285
Thr Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Val His Ile Tyr Pro Gly Tyr Trp
290 295 300
Gly Gly Val Asn Thr Tyr Gln Ala Phe Gln Asn Ala Trp Asn Thr Asn
305 310 315 320
Val Lys Pro Ile Ala Asp Ile Ala Pro Ile Ala Ile Thr Glu Thr Asp
325 330 335
Trp Ala Pro Gln Gly Tyr Gly Thr Phe Gly Thr Gly Ser Thr Gly Thr
340 345 350
Ala Gly Gly Asn Gly Phe Gly Ala Asn Leu Lys Tyr Ile Val Asp Gln
355 360 365
Ser Gly Asn Val Ser Trp Asn Leu Leu Thr Pro Asp Asp Leu Leu His
370 375 380
Lys Gly Asp Pro Asn Ala Gly Thr Ala Phe Asn Asn Asp Trp Glu Ala
385 390 395 400
Cys Ala Ala Pro Ser Lys Gln Trp Phe Gln Gln Tyr Ala Ala Tyr Asn
405 410 415
Tyr Pro Met Ser Asn Cys Thr Val Thr Ser Leu Val Asn Asn Gly Ile
420 425 430
Tyr Glu Ile Glu Phe Gln Thr Asp Ala Asn Lys Val Leu Asp Leu Lys
435 440 445
Ser Gly Glu Asp Ala Asn Gly Ala Ala Leu Arg Pro Trp Thr Arg Asn
450 455 460
Gly Ala Asn Ala Gln Arg Trp Val Ala Ile Asp Ala Gly Asn Gly Tyr
465 470 475 480
Trp Arg Phe Val Ser Lys Ala Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ile Asp Leu
485 490 495
Thr Ser Asn Ser Asn Val Leu Gly Thr Ala Ile Arg Leu Trp Gln Asn
500 505 510
Tyr Gly Asn Asp Ala Gln Ala Trp Lys Val Thr Ala Val Ala Asn Gly
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Tyr Tyr Lys Ile Thr Ser Lys Val Asp Ala Thr Arg Gly Trp Asp Val
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 半解纤维素芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
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<400> 11
atg cgc gag gta ggt cgc atg acg aaa atg ctt ctt gtt gtt atg ttc 48
Met Arg Glu Val Gly Arg Met Thr Lys Met Leu Leu Val Val Met Phe
1 5 10 15
atc gtt ccg ctt ctt ctt tct ggc cat tct gcg gag gct tgg act gga 96
Ile Val Pro Leu Leu Leu Ser Gly His Ser Ala Glu Ala Trp Thr Gly
20 25 30
atg cct atg gac aaa ctt cat gta agc ggc aac caa ctt gta aac agc 144
Met Pro Met Asp Lys Leu His Val Ser Gly Asn Gln Leu Val Asn Ser
35 40 45
tct ggc caa act gta ctt ctt aac ggc tgg cac caa cct tct ggc tct 192
Ser Gly Gln Thr Val Leu Leu Asn Gly Trp His Gln Pro Ser Gly Ser
50 55 60
tac tgg act tac cag ggc tca aac tac tat ctt gac cgc aac ggt ggc 240
Tyr Trp Thr Tyr Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Leu Asp Arg Asn Gly Gly
65 70 75 80
aac cgc cat gcc gct aac ctt gag tat ctt aaa gac atc agc gac act 288
Asn Arg His Ala Ala Asn Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Ile Ser Asp Thr
85 90 95
ttc act gac aca tct ccg aaa tac ggc aac gac cac ggc tgg tac atg 336
Phe Thr Asp Thr Ser Pro Lys Tyr Gly Asn Asp His Gly Trp Tyr Met
100 105 110
aac caa atc cgc ctt ttc atc gac cgc gag gac atg ggc gac gta gcg 384
Asn Gln Ile Arg Leu Phe Ile Asp Arg Glu Asp Met Gly Asp Val Ala
115 120 125
gct ggc acg tat aac ttc gct ggc ctt caa gag gtt acg caa aac gtt 432
Ala Gly Thr Tyr Asn Phe Ala Gly Leu Gln Glu Val Thr Gln Asn Val
130 135 140
atc atc cca tac gtt gag tac gct aaa aca aaa ggc ctt tat gtt act 480
Ile Ile Pro Tyr Val Glu Tyr Ala Lys Thr Lys Gly Leu Tyr Val Thr
145 150 155 160
ctt ggt ctt gac ttc acg ctt ctt aac gac cag gct act act caa tct 528
Leu Gly Leu Asp Phe Thr Leu Leu Asn Asp Gln Ala Thr Thr Gln Ser
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aac tta gac aag ttc aac gag atc tgg ggc tat ctt gct tca cgt ccg 576
Asn Leu Asp Lys Phe Asn Glu Ile Trp Gly Tyr Leu Ala Ser Arg Pro
180 185 190
gag ctt cgc agc gct gac cac gtt atg ttt gag atc gta aac gag cct 624
Glu Leu Arg Ser Ala Asp His Val Met Phe Glu Ile Val Asn Glu Pro
195 200 205
gta ctt tca tac gca aac ggt aaa tgg ggt ggc cat cca tct gac cca 672
Val Leu Ser Tyr Ala Asn Gly Lys Trp Gly Gly His Pro Ser Asp Pro
210 215 220
gac ttc gtt gac cac tgg aac gct ctt cgc gac ttc cag aac tct atc 720
Asp Phe Val Asp His Trp Asn Ala Leu Arg Asp Phe Gln Asn Ser Ile
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atc gca aca atc cgc aac caa ggc gct gac aac gtt atc tgg gca gct 768
Ile Ala Thr Ile Arg Asn Gln Gly Ala Asp Asn Val Ile Trp Ala Ala
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ggc ctt ggc tgg gac caa tac tac caa ctt tgc gca tct cac cca ctt 816
Gly Leu Gly Trp Asp Gln Tyr Tyr Gln Leu Cys Ala Ser His Pro Leu
260 265 270
act gac cct ctt aac aac aca ggt tac gca gta cac tgg tat cct ggc 864
Thr Asp Pro Leu Asn Asn Thr Gly Tyr Ala Val His Trp Tyr Pro Gly
275 280 285
tat ggc gca aac gac gac tat gct act ctt caa caa caa tgg gac aca 912
Tyr Gly Ala Asn Asp Asp Tyr Ala Thr Leu Gln Gln Gln Trp Asp Thr
290 295 300
aac atc aaa ccg tgc gca gac cat tac cct atc aac atc act gag acg 960
Asn Ile Lys Pro Cys Ala Asp His Tyr Pro Ile Asn Ile Thr Glu Thr
305 310 315 320
act tgg tac aaa tgg caa cca ggc gac ccg gag tac tgg cac ctt ttt 1008
Thr Trp Tyr Lys Trp Gln Pro Gly Asp Pro Glu Tyr Trp His Leu Phe
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gac gga acg aac gag ggc ttc ggc aag aac aca aaa gcg atc ttt acg 1056
Asp Gly Thr Asn Glu Gly Phe Gly Lys Asn Thr Lys Ala Ile Phe Thr
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Asp Ala Gly Asn Val Ser Ile Ala Val His Met Asn Gly Phe Leu Leu
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Glu Pro Gly Val Arg Ser Thr Phe Ala Asp Pro Thr Ala Gly Leu Lys
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Lys Met Ile Asp Val Pro Gly Gly Gln Asn Asn Asn Gly Leu Gln Leu
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tca gac aac aag gta atg gac gta cgc aac ggt tct tct cac aac ggt 1488
Ser Asp Asn Lys Val Met Asp Val Arg Asn Gly Ser Ser His Asn Gly
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gag gcg atc caa ctt atg tct gac ttt ggc aac tca gcg caa caa ttc 1536
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Leu Leu Gln Gln Asn Met Tyr Arg Gly Asp Leu His Gln Gln Trp Asp
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<213> 半解纤维素芽孢杆菌
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180 185 190
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195 200 205
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465 470 475 480
Ser Asp Asn Lys Val Met Asp Val Arg Asn Gly Ser Ser His Asn Gly
485 490 495
Glu Ala Ile Gln Leu Met Ser Asp Phe Gly Asn Ser Ala Gln Gln Phe
500 505 510
Arg Leu Ile Arg Leu Ser Asn Gly Tyr Trp Ser Ile Leu Asn Val Asn
515 520 525
Ser Asn Lys Ala Val Glu Val Thr Gly Ser Ser Ser Ala Asp Gly Ala
530 535 540
Leu Leu Gln Gln Asn Met Tyr Arg Gly Asp Leu His Gln Gln Trp Asp
545 550 555 560
Leu Ile Arg Ile Asn
565

Claims (23)

1.一种在湿磨过程中改善来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的一种或多种水解酶的酶组合物混合，其中至少一种所述水解酶选自由以下组成的组：GH30多肽、GH5多肽或其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在该湿磨过程期间从纤维释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生浸泡的和碾磨的籽粒；
c)从这些浸泡和碾磨的籽粒中分离胚芽以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)将该所得玉米籽粒物质进行纤维洗涤程序。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在根据权利要求3所述的步骤d)之前、期间或之后，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在根据权利要求3所述的步骤d)期间，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶混合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中允许所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述一种或多种水解酶接触至少15分钟。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包含使用为引入一种或多种水解酶而优化的纤维洗涤系统，并且其中该纤维洗涤系统包含配置为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟并且少于48小时的总保留时间的空间。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中配置成该纤维洗涤系统中的所述空间中的孵育时间为至少5分钟并且小于48小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该孵育温度在25℃和95℃之间。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GH5多肽具有木聚糖酶活性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GH30多肽具有木聚糖酶活性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GH5多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶(EC 3.2.1.4)活性和/或内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性和/或β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)活性和/或β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)活性和/或β-葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性和/或葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58)活性和/或地衣多糖酶(EC 3.2.1.73)活性和/或外切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维糊精酶(EC 3.2.1.74)活性和/或葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)活性和/或甘露聚糖内切-β-1,4-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)活性和/或纤维素β-1,4-纤维二糖苷酶(EC 3.2.1.91)活性和/或甾醇β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.104)活性或内切糖神经酰胺酶(EC 3.2.1.123)活性和/或脱乙酰壳多糖酶(EC 3.2.1.132)活性和/或β-樱草苷酶(EC3.2.1.149)活性和/或木葡聚糖-特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)活性和/或内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.164)活性和/或橘皮苷6-O-α-L-鼠李糖-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.168)活性和/或β-1,3-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.-)活性和/或阿拉伯糖基木聚糖-特异性内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.-)活性和/或甘露聚糖转糖苷酶(EC 2.4.1.-)活性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GH30多肽进一步包含以下活性的一种或多种：内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)活性和/或β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)活性和/或β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)活性和/或β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)活性和/或β-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.38)活性和/或葡萄糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)活性和/或β-1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)活性和/或葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.136)活性和/或内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC:3.2.1.164)活性和/或[还原性末端]β-木糖苷酶(EC 3.2.1.-)活性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该GH5多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％同一性
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该GH30多肽选自由以下组成的组：
i)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的成熟多肽；
ii)成熟多肽，该成熟多肽与i)中的成熟多肽具有至少60％同一性
iii)i)和ii)中成熟多肽中的任一项的子序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含一种或多种水解酶的所述酶组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)或蛋白酶(E.C XXXX)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物中表达，例如里氏木霉。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶是纯化的。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在液体组合物中。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在固体组合物中。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与一种或多种所述玉米籽粒物质的级分混合的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨过程的玉米籽粒之间。
22.一种包含玉米纤维的组合物，所述组合物可通过如权利要求1-21中任一项所述的方法获得。
23.GH30多肽和/或GH5多肽在用于在如权利要求1-21中任一项中所定义的湿磨过程中改善来自玉米籽粒的淀粉产率和/或总谷蛋白产率的方法中的用途。
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