CN116670177A - 玉米湿磨中改善的纤维洗涤 - Google Patents

玉米湿磨中改善的纤维洗涤 Download PDF

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Abstract

提供了在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与蛋白质二硫键异构酶或硫氧还蛋白混合。

Description

玉米湿磨中改善的纤维洗涤
技术领域
本发明涉及一种在湿磨工艺中(优选在纤维洗涤期间)通过使玉米籽粒与酶组合物接触来改善/提高来自所述玉米籽粒的淀粉和/或谷蛋白(gluten)产率的方法。
背景技术
常规的玉米湿磨是一种设计用于淀粉和几种副产物(包括胚芽、谷蛋白(蛋白质)和纤维)的回收和纯化的工艺。纤维是价值最低的副产物，因此工业已经投入大量精力来增加更有价值的产物(如淀粉和谷蛋白)的产率，同时减少纤维级分。高品质淀粉是有价值的，因为它可以在进一步加工成如干燥的淀粉、改性淀粉、糊精、甜味剂和醇等产物后用于各种商业目的。谷蛋白通常用于动物饲料，如玉米谷蛋白粉(约60％蛋白质)或玉米谷蛋白饲料(约20％蛋白质)。
该湿磨工艺取决于使用的特定研磨设备可以显著变化，但该工艺通常包括：谷物清洁、浸渍、碾磨、胚芽分离、第二次碾磨、纤维分离、谷蛋白分离和淀粉分离。在清洁玉米籽粒后，典型地通过在受控制的时间和温度条件下浸泡在水中或在稀释的SO2溶液中使它们软化。然后，碾磨籽粒以分解果皮，并将胚芽与籽粒的其余部分分离。剩余的浆液，主要由纤维、淀粉和谷蛋白组成，在纤维洗涤过程中进行精细碾磨和筛选，以将纤维从淀粉和谷蛋白分离，然后分离谷蛋白和淀粉，并且可以在洗涤/过滤过程中纯化淀粉。
已经建议在湿磨工艺的几个步骤中使用酶，比如使用酶用于湿磨工艺的浸渍步骤。已经示出，商业酶产品(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨工艺的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种经修饰的湿磨工艺，其使用蛋白酶以在玉米湿磨期间显著减少总的加工时间并消除对作为加工剂的二氧化硫的需求。Johnston等人,Cereal Chem[谷物化学],81,第626-632页(2004)。
US 6,566,125披露了用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液，以及将碾磨的玉蜀黍浆液与酶(例如，蛋白酶)一起孵育。
US 5,066,218披露了研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洁谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，然后用纤维素酶研磨谷物。
WO 2002/000731披露了处理作物籽粒的工艺，该工艺包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒，以及用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。
WO 2002/000911披露了淀粉谷蛋白分离的工艺，该工艺包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。
WO 2002/002644披露了洗涤获得自研磨工艺的淀粉谷蛋白分离步骤的淀粉浆液的工艺，该工艺包括用包含有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。
WO 2014/082566和WO 2014/082564披露了用于在湿磨中使用的纤维素分解组合物。
WO 2016/095856披露了包含木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合物以及这些组合物在玉米湿磨工艺中的纤维洗涤中的用途。
WO 2019/023222披露了一种在纤维洗涤步骤中与纤维素酶组合应用GH5木聚糖酶和GH30木聚糖酶的湿磨工艺。
WO 2017/088820披露了一种通过在纤维洗涤步骤中单独添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(GH62)或与木聚糖酶(GH10)组合来改善玉米湿磨中从纤维中释放淀粉的工艺。
WO 2018/053220披露了一种作为湿磨工艺的一部分的纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统经优化为通过使用专用的空间/槽进行酶孵育以在纤维洗涤步骤中应用酶。
尽管本领域已经研究了在玉米湿磨中使用酶的效果，但是在玉米籽粒的浸渍/浸泡期间、在玉米籽粒的碾磨期间和在淀粉谷蛋白分离期间，仍然需要改善的技术，其可以降低与玉米湿磨相关的能量支出和成本并且提供增加的淀粉和谷蛋白的产率。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使碾磨的玉米籽粒或碾磨的籽粒的级分(特别是富含纤维的级分)与有效量的多肽接触，该多肽催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)，例如硫氧还蛋白肽或蛋白质二硫键异构酶(PDI)(EC 5.3.4.1)。
在另外的方面，本发明涉及具有蛋白质二硫键活性的分离的多肽或能够催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)的硫氧还蛋白肽。
本发明还涉及编码具有蛋白质二硫键活性的多肽或能够催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)的硫氧还蛋白肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生本发明的多肽的方法。
此外，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法。
定义
酶的定义：
蛋白质二硫键异构酶(PDI)：术语蛋白质二硫键异构酶(本文也称为PDI)(EC5.3.4.1)意指当蛋白质通过氧化、还原或异构化的方式折叠时催化蛋白质内残基之间二硫键的形成和断裂的酶。PDI是氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的成员，并且典型地包含至少三个结构域，即由至少一个非催化结构域分隔的两个催化结构域，每个催化结构域包含特征在于具有CXXC、优选地CGHC基序的活性位点(Perri等人,2016,Front.Cell Dev.Biol.[细胞与发育生物学前沿]3:80，Hatahet和Ruddock,2007,FEBS Journal[FEBS杂志]274:5223–5234)。在一个实施例中，活性位点基序选自CGHC、CTHC、CPHC、和CSMC。催化结构域典型地属于蛋白质结构域家族Pf00085(硫氧还蛋白，https://pfam.xfam.org/family/Thioredoxin)，如由Pfam数据库(蛋白质结构域家族的大集合)分类的(Mistry等人,2020,“Pfam:The protein families database in 2021[Pfam：2021年蛋白质家族数据库]”,Nucleic Acids Research[核酸研究],doi:10.1093/nar/gkaa913；http://pfam.xfam.org/)。非催化结构域可以属于Pfam结构域Pf13848(硫氧还蛋白_6结构域，https://pfam.xfam.org/family/PF13848)。在优选的实施例中，适用于本发明的工艺的PDI包含至少一个Pf00085结构域，该结构域包括由以下多肽基序组成的活性位点：CGHC、CTHC、CPHC、或CSMC，优选地CGHC。在另一个优选的实施例中，PDI包含三个结构域结构，其中这些结构域按Pf00085、Pf13848、Pf00085的先后顺序排列。3个结构域可以通过肽接头分隔。PDI活性意指多肽在实例第57-59页中测定部分描述的(用二硫苏糖醇进行的胰岛素还原测定)且在实例7中应用的胰岛素还原测定(使用胰岛素作为底物并且在DTT的存在下)中具有活性。
硫氧还蛋白肽(Trx)：术语硫氧还蛋白意指通过半胱氨酸硫醇-二硫键交换催化蛋白质二硫键还原的蛋白质。硫氧还蛋白通过促进其他蛋白质的还原而充当抗氧化剂(Collet和Messens,2010,Antioxid.Redox Signal.[抗氧化剂与氧化还原信号传导]13,1205–1216)。硫氧还蛋白是小的氧化还原酶，典型地大小为约12-kD，并且含有二硫醇-二硫键活性位点，例如CGPC。它们是普遍存在的，并且存在于从植物和细菌到哺乳动物的许多生物中。已鉴定出硫氧还蛋白的多种体外底物，包括核糖核酸酶、绒毛膜促性腺激素、凝血因子、糖皮质激素受体和胰岛素。胰岛素还原通常用作活性测试。硫氧还蛋白在其氨基酸序列水平上的特征在于CXXC基序中存在两个邻近的半胱氨酸。这两个半胱氨酸是硫氧还蛋白还原其他蛋白质能力的关键。硫氧还蛋白还具有称为硫氧还蛋白折叠的特征性三级结构，该结构也被发现是其他蛋白质(如谷氧还蛋白、PDI和二硫键氧化酶)的组分。因此，根据本发明，硫氧还蛋白肽是氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的成员，并且典型地包含催化结构域，该催化结构域包含特征在于具有CXXC基序、优选地CGPC基序的活性位点。硫氧还蛋白样肽包含属于蛋白质结构域家族Pf00085的结构域(硫氧还蛋白，https://pfam.xfam.org/family/Thioredoxin)，如由Pfam数据库分类的(http://pfam.xfam.org/)。硫氧还蛋白肽活性意指包含Pf00085结构域的肽在实例中描述的胰岛素还原测定中具有活性。根据本发明的硫氧还蛋白肽应在实例(例如，实例7)中披露的胰岛素还原测定(使用胰岛素作为底物并且在DTT的存在下)中具有活性。
具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的阿拉伯呋喃糖苷酶/多肽：术语“阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,2)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme InternationalIreland,Ltd.)，布瑞公司(Bray,Co.)，爱尔兰威克洛郡(Wicklow,Ireland))以总体积200μl在40℃持续30分钟，接着通过HPX-87H柱色谱法(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)的伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行阿拉伯糖分析来确定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。阿拉伯呋喃糖苷酶可以在例如根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases[更新糖基水解酶的基于序列的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的GH43、GH62、GH51家族中找到。
具有β-葡糖苷酶活性的β-葡糖苷酶/多肽：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人,2002,J.BasicMicrobiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃，pH 4.8下，在含有0.01％ 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
具有β-木糖苷酶活性的β-木糖苷酶/多肽：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原性末端移除。可以在含有0.01％ 20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％ />20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
具有纤维二糖水解酶活性的纤维二糖水解酶/多肽：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维低聚糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从该链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。可以根据由以下所述的程序来确定纤维二糖水解酶活性：Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；vanTilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581。
具有纤维素酶活性或纤维素分解活性的纤维素分解酶或纤维素酶/多肽：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，几种)水解纤维素材料的酶，该材料包括任何包含纤维素(如纤维)的材料。纤维素分解酶包括一种或多种内切葡聚糖酶(E.C3.2.1.4)、一种或多种纤维二糖水解酶(E.C 3.2.1.91和E.C 3.2.1.150)、一种或多种β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解期间，糖的产生/释放的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)(或其他预处理的纤维素材料)中的纤维素，在适合的温度(比如40℃-80℃，例如，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)，以及在适合的pH(比如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解进行比较。典型的条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱色谱法(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐实验室有限公司)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原性糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases[更新糖基水解酶的基于序列的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。GH61多肽最近被归类为溶解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人,2011,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)，并且被称为“辅助活性9”或“AA9”多肽。
具有水解酶活性的水解酶(hydrolytic enzyme)或水解酶(hydrolase)/多肽：“水解酶”是指使用水分解底物的任何催化蛋白。水解酶包含纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶))、纤维二糖水解酶I(EC3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。
具有木聚糖酶活性的木聚糖酶/多肽：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％ X-100和200mM磷酸钠(pH6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。木聚糖酶可见于例如GH5、GH8、GH30、GH10和GH11家族中。
GH5多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族5的成员(http://www.cazy.org/)。
GH8多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族8的成员(http://www.cazy.org/)。
GH30多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族30的成员(http://www.cazy.org/)。
GH10多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在http://www.cazy.org/上可获得的碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族10的成员。(Lombard,V.；Golaconda Ramulu,H.；Drula,E.；Coutinho,P.M.；Henrissat,B.(2013年11月21日)."Thecarbohydrate-active enzymes database(CAZy)in 2013"[2013年碳水化合物活性酶数据库(CAZy)].Nucleic Acids Research[核酸研究].42(D1):D490–D495；Cantarel BL,Coutinho PM,Rancurel C,Bernard T,Lombard V,Henrissat B(2009年1月).“TheCarbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):an expert resource forGlycogenomics”[碳水化合物活性酶数据库(CAZy)：糖基因组学专家资源].Nucleic AcidsRes.[核酸研究]37(数据库期号):D233-8)。
GH11多肽是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族11的成员。
GH62多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族62的成员。
GH43多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族43的成员。
GH51多肽：是指具有酶活性的多肽，该多肽在碳水化合物活性酶(CAZyme)的数据库中被分类为糖苷水解酶家族51的成员。
其他定义：
在本上下文中，术语以对于技术人员而言是普通的方式使用。其中一些术语如下阐明：
接触时间：对于一种或多种酶与底物反应，该一种或多种酶必须与该底物接触。“接触时间”是指有效量的一种或多种酶与至少一部分底物物质接触的时间段。在接触时间期间，酶可以不与所有底物物质接触，然而将一种或多种酶与底物物质混合允许在接触时间期间酶催化水解一部分底物物质的潜力。
玉米籽粒：已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉蜀黍、甜玉米、糯玉米等。
一些玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。
玉米籽粒或玉米籽粒的级分：此术语用于描述湿磨工艺中的玉米籽粒。当玉米籽粒被分解和加工时，使用该术语时，玉米籽粒的所有分级部分应视为包括在内。该术语包括例如：浸泡的籽粒、碾磨的籽粒、玉米籽粒物质、第一级分、第二级分、玉米籽粒物质的一个或多个级分等。
玉米籽粒物质：优选地用于引用包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质，优选地通过汽蒸和碾磨作物籽粒并从胚芽中分离包含纤维、谷蛋白和淀粉的物质来实现。当玉米籽粒物质移动通过纤维洗涤时，它被分离成几个级分，包括第一级分(s)和第二级分(f)。因此，“玉米籽粒物质的级分”和“玉米籽粒物质的一个或多个级分”尤其是指这些第一级分(s)和第二级分(f)。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是天然的或异源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽，其中该片段具有可催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)的酶活性，例如，蛋白质二硫键异构酶活性或硫氧还蛋白肽活性。在一个实施例中，片段包含属于Pfam家族Pf00085的至少一个硫氧还蛋白结构域。
胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植物所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。被胚芽覆盖或包围的胚乳包含约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白质来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。
谷蛋白：谷蛋白是由两种更小的蛋白质—麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成的蛋白质。本文“谷蛋白”是指在玉米籽粒中发现的大多数蛋白质。在特定的实施例中，谷蛋白是指不溶性蛋白质(主要由α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白组成)。来自玉米湿磨的谷蛋白的主要产物是玉米谷蛋白粉(大约60％蛋白质)和玉米谷蛋白饲料(大约20％蛋白质)。
碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”是指将玉米籽粒分解成更小的组分。
异源的：对于宿主细胞，术语“异源的”意指多肽或核酸不是天然存在于宿主细胞中。对于多肽或核酸，术语“异源的”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子或结构域)不与该多肽或核酸天然地相关联，即，控制序列是来自编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5的成熟多肽的基因以外的基因。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指多肽、核酸、细胞或其他指定材料或组分与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
孵育时间：玉米籽粒物质的一个或多个级分在纤维洗涤期间与水解酶接触而未经过筛选的时间。
在许多优选的实施例中，根据本发明的方法利用包含空间(V)或“培养箱”的系统，在该系统内材料通过酶而“留下被影响”，并且在这种情况下，孵育时间可以通过以下确定：
可替代地，如果流入至培养箱以每时间单位的体积表示：
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。
在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸21至516。
在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸21至513。
在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸21至516。
在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸21至517。
在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至110。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白质二硫键异构酶活性或硫氧还蛋白活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:6的核苷酸61-362、419-797、868-1307、和1363-1732。在另一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸61-362、427-805、877-1316、1372-1744。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:20的核苷酸61-1548。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸61-1539。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:22的核苷酸61-1548。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸61-1551。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:24的核苷酸1-330。
天然的：术语“天然的”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。
研磨设备：“研磨设备”是指粉碎机上使用的所有设备。湿磨工艺将取决于可用的研磨设备而变化。研磨设备的实例可以是浸渍罐、蒸发器、螺旋压榨机、旋转干燥机、脱水筛网、离心机、水力旋流器等。每个研磨设备/研磨线的尺寸和数量可以在不同的粉碎机上变化，这将影响研磨过程。例如，纤维洗涤筛网单元的数量可以变化，离心机的尺寸也可以变化。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
保留时间：在纤维洗涤程序中允许一种或多种水解酶和玉米籽粒或玉米籽粒的级分反应的时间。
在一些实施例中，保留时间是在再次离开纤维洗涤系统之前，在第一筛网单元(S1)中接收的玉米籽粒物质及其一个或多个级分与有效量的一种或多种水解酶接触的时间段。在保留时间期间，玉米籽粒物质的一个或多个级分在空间(V)中与一种或多种水解酶孵育，然后离开纤维洗涤系统，作为来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)的一部分或作为来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)的一部分。
保留时间可以优选地估计为固形物在如本发明所定义的纤维洗涤系统中花费的平均持续时间。这可以通过以下关系估计：
可替代地，如果流入至系统以每时间单位的体积表示：
系统的体积典型地设定为等于系统中所有空隙的体积之和；然而，由于系统中的管道典型地做得很小，其可能优选地忽略管道的体积。
筛选的：术语“筛选的”(“screened”或“screening”)是指将玉米籽粒物质分离成第一级分s和第二级分f以及将这些级分从一个筛网单元移动到另一个筛网单元的过程。非筛选期是提供用于将玉米籽粒物质或其级分与酶一起孵育的非分离期。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)
淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖
构成、由广泛出现在植物组织中的呈储藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。
浸渍或浸泡：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO2浸泡作物籽粒。
具体实施方式
本发明的一个目的是提供一种改善来自玉米湿磨工艺的淀粉和谷蛋白产率的方法。
特别地，本发明的目的是提供用于在湿磨工艺中提高可以从玉米籽粒中获得的淀粉和/或谷蛋白产率的方法，该方法通过使碾磨的玉米籽粒或碾磨的籽粒的级分(特别是富含纤维的级分)与有效量的多肽接触，该多肽催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)。在一个实施例中，多肽包含属于Pfam家族Pf00085的至少一个Pfam家族结构域。这样的多肽也称为硫氧还蛋白多肽。在特定的实施例中，包含Pf00085结构域的多肽是蛋白质二硫键异构酶(PDI)。硫氧还蛋白多肽或PDI的作用可以通过存在至少一种木聚糖酶和/或纤维素酶以及有效量的SO2来进一步改善，这将进一步增加从纤维中结合的淀粉和谷蛋白的释放，并因此提高了可获得的淀粉和/或谷蛋白产率。
湿磨工艺：
将玉米籽粒湿磨以打开籽粒并将这些籽粒分成其四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维和谷蛋白。
湿磨工艺可以在研磨间显著变化，然而常规的湿磨通常包括以下步骤：
1.浸渍
2.碾磨
3.分离成包含以下的流：
i)胚芽；以及ii)纤维、淀粉和谷蛋白
4.精细碾磨
5.洗涤纤维、加压并干燥
6.淀粉/谷蛋白分离，以及
7.洗涤淀粉。
浸渍、碾磨并分离胚芽
玉米籽粒通过在约50℃、比如在约45℃至60℃之间的温度下在水中浸泡持续约30分钟至约48小时、优选30分钟至约15小时、比如约1小时至约6小时来软化。在浸泡期间，籽粒吸收水分，其水分含量从15％增加至45％，并且大小增加一倍以上。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中过度生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的谷蛋白键松散并释放淀粉。玉米籽粒浸渍后，通常通过粗碾磨步骤将这些玉米籽粒裂开以释放胚芽。胚芽含有玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、谷蛋白和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。随后，可对胚芽进行干燥并且提取油。在分离胚芽后，通常对包含纤维、淀粉和谷蛋白(蛋白质)的碾磨的籽粒物质进行精细碾磨步骤。
洗涤纤维、加压并干燥
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。因此，对精细碾磨的籽粒物质进行纤维洗涤程序。由此在筛选(洗涤)期间将游离淀粉和谷蛋白与纤维分离，并作为研磨淀粉收集。然后加压剩余的纤维以降低水含量。
为了得到最大的淀粉和谷蛋白回收同时将终产物中的任何纤维保持为绝对最小值，在加工期间必须从纤维级分中洗涤出游离淀粉和谷蛋白。收集纤维，并使其成浆液并过筛，通常在浸泡、碾磨和从玉米籽粒中分离出胚芽之后，以回收玉米籽粒物质中任何残留的淀粉或谷蛋白。该加工在本文中称为纤维洗涤程序/步骤。
分离淀粉谷蛋白
将来自纤维洗涤步骤的淀粉-谷蛋白悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和谷蛋白。与淀粉相比，谷蛋白具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出谷蛋白。
洗涤淀粉
来自淀粉分离步骤的淀粉浆液含有一些不溶性蛋白和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其去除。在水力旋流器中，将仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以去除最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。
湿磨的产物：可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浸出液、玉米谷蛋白饲料、胚芽、玉米油、玉米谷蛋白粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(比如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。
本发明的一个方面提供了在湿磨工艺中用来提高可以从玉米籽粒获得的总淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括：将玉米籽粒或玉米籽粒的级分与包含有效量的多肽的酶组合物混合，该多肽催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)。在一个实施例中，多肽包含属于Pfam家族Pf00085的至少一个Pfam家族结构域。这样的多肽也称为硫氧还蛋白多肽。在特定的实施例中，包含Pf00085结构域的多肽是蛋白质二硫键异构酶(PDI)。至少一种蛋白质二硫键异构酶或硫氧还蛋白多肽可以任选地与一种或多种水解酶组合，其中所述水解酶中的至少一种选自由以下组成的组：木聚糖酶多肽、和/或纤维素酶多肽、或其组合。还可以添加其他水解酶，如阿拉伯呋喃糖苷酶。在优选的实施例中，在对玉米籽粒物质进行纤维洗涤程序的步骤期间，将所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分与所述蛋白质二硫键异构酶或硫氧还蛋白肽、以及任选地一种或多种水解酶混合。
玉米籽粒或玉米籽粒级分中的一些淀粉和/或谷蛋白可以与纤维级分结合，并且在湿磨工艺期间从未释放。然而，添加水解酶(其可以包括任何可以使用水分解玉米籽粒中存在的底物的催化蛋白)可以释放一些结合的淀粉和/或谷蛋白，从而提高在湿磨工艺中淀粉和/或谷蛋白的总产率。
本发明的诸位发明人惊讶地发现，从碾磨的玉米籽粒中释放的淀粉和谷蛋白可以通过使碾磨的玉米籽粒物质或碾磨的籽粒的级分(特别是富含纤维的级分)与有效量的蛋白质二硫键异构酶(PDI)或硫氧还蛋白接触来增加。PDI的作用可以通过组合使用PDI、木聚糖酶、纤维素酶、和SO2来进一步加强。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使碾磨的玉米籽粒或碾磨的籽粒的级分(特别是富含纤维的级分)与有效量的多肽接触，该多肽催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI)(EC 5.3.4.1)或硫氧还蛋白肽。
在一个实施例中，本发明的方法使得与不存在/未添加PDI或硫氧还蛋白肽的工艺相比，在湿磨工艺期间从纤维中释放的淀粉和/或谷蛋白的量增加。
在另一个实施例中，本发明的方法使得浸渍时间和SO2添加减少。
湿磨工艺中使用的特定程序和设备可以变化，但是该工艺的主要原理保持不变(参见关于湿磨工艺的描述)。
在一个实施例中，PDI或硫氧还蛋白肽存在于/添加至纤维级分中，特别是在纤维洗涤步骤期间。
在一个特定的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)对该玉米籽粒物质、特别是富含纤维的级分(如精细纤维级分)进行纤维洗涤程序，从而将淀粉和谷蛋白从该纤维中分离出来；
其中在步骤d)之前或期间存在/添加至少一种PDI或硫氧还蛋白肽。
在一个实施例中，上述方法进一步包括以下步骤：
e)将该淀粉从该谷蛋白中分离出来；以及任选地
f)洗涤该淀粉。
在本发明的方法的一个实施例中，PDI或硫氧还蛋白肽在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少10μg EP/g DS、至少25μg EP/g DS、至少50μg EP/g DS、至少75μg EP/g DS、至少100μg EP/g DS、至少200μg EP/g DS、至少300μg EP/g DS、至少500μg EP/g DS，例如在以下范围中：10至2000μg EP/g DS、25至1000μg EP/g DS、50至800μg EP/g DS、100至500μgEP/g DS。
根据本发明，为了在纤维洗涤步骤期间使水解酶的作用最大化，在纤维洗涤期间存在有效量的SO2。
在一个实施例中，SO2在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少200ppm、至少300ppm、至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm。
在另一个实施例中，SO2在纤维洗涤期间存在/添加的量是在200-3000ppm、300-2000ppm、400–800ppm范围内。
在根据本发明的方法中，另外的酶活性可以有利地与PDI或硫氧还蛋白肽组合添加。因此，本发明的另外的实施例涉及一种方法，其中在纤维洗涤步骤之前或期间存在/添加有效量的一种或多种水解酶，并且其中所述水解酶中的至少一种选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
在一个实施例中，木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
在另一个实施例中，这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。
在一个实施例中，一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
在另一个实施例中，这些水解酶包含阿拉伯呋喃糖苷酶。
在一个实施例中，阿拉伯呋喃糖苷酶可以选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽和GH51多肽。
在本发明的方法的一个特定的实施例中，对来自步骤c)的包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质进行进一步的碾磨步骤，优选在步骤d)中的纤维洗涤程序之前进行精细碾磨步骤。
在纤维洗涤程序中使用的特定设备可以变化，但是该工艺的主要原理保持不变。WO 2018/053220描述了一种纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包括专用的酶孵育空间/槽。基于本披露和技术人员的一般知识，设计一种为水解酶发挥作用提供足够的孵育时间的纤维洗涤系统将是可能的。在一个实施例中，允许所述玉米籽粒或所述玉米籽粒的级分(例如，富含纤维的级分)与所述一种或多种水解酶反应至少15分钟，比如至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟。
在一个实施例中，所述纤维洗涤程序包含为引入一种或多种水解酶而优化的纤维洗涤系统，其中纤维洗涤系统包含空间(V)，该空间(V)被配置为在该纤维洗涤系统中提供以下总反应时间(保留时间)：至少35分钟(如至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。在一个实施例中，在纤维洗涤系统中的总保留时间在35分钟和48小时之间，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和12小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间、在1-48小时之间、在1-24小时之间、在1-12小时之间、在1-6小时之间、在1-5小时之间、在1-4小时之间、在1-3小时之间、在1-2小时之间。
在一个实施例中，该纤维洗涤系统包含：
-多个筛网单元(S1……S4)，这些筛网单元以逆流洗涤配置流体连接；每个筛网单元被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分(s)和第二级分(f)，所述第二级分(f)含有与第一级分(s)相比，以wt％测量的更高量纤维；
-空间(V)，该空间被设置在系统中并且流体连接以接收所述第一级分(s)，所述第二级分(f)，或混合的第一和第二级分(s，f)，优选地仅第二级分(f)，并配置成为在空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或两个级分导出到下游筛网单元(S4)，
其中该系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元(S1)
-将来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)作为含有淀粉的产物流导出，
-导入工艺用水，优选地设置用于将工艺用水导入最下游筛网单元(S4)，
-将来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该洗涤的玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白。
-将水解酶引入该系统中。
在一个实施例中，在配置成纤维洗涤系统中的所述空间(V)中的孵育时间为至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟)并且小于48小时(如小于40小时、小于36小时、小于30小时、小于24小时、小于20小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时)。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的孵育时间在35分钟和48小时之间，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间、在1-48小时之间、在1-24小时之间、在1-12小时之间、在1-6小时之间、在1-5小时之间、在1-4小时之间、在1-3小时之间、在1-2小时之间。
在一个实施例中，在所述空间(V)中的孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，比如在46℃和52℃之间。
此外，空间的尺寸(以m3为单位)优选地被配置成提供至少至少5分钟(如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟、至少120分钟)的孵育时间。
指定用于孵育的空间(V)优选地具有至少30m3、至少40m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、或至少500m3的体积。孵育时间也可以在多于一个的空间V中，具有至少100m3、至少110m3、至少120m3、至少130m3、至少140m3、至少150m3、至少160m3、至少170m3、至少180m3、至少190m3、至少200m3、至少210m3、至少220m3、至少230m3、至少240m3、至少250m3、至少260m3、至少270m3、至少280m3、至少290m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3的总体积或组合的体积。
在孵育时间期间，优选的不筛选在空间V中接收的流体。因此，离开空间V的流体具有与空间V中接收的流体相同的组成，例如淀粉和纤维，尽管它优选地含有更高比例的已从纤维中释放的淀粉和/或蛋白质。
为了确保酶和纤维之间的紧密接触，可以优选将空间V配置成用于搅拌在所述空间V中含有的物质，比如通过包含转子或叶轮。
优选将空间V设置在最上游筛网单元S1的下游和所述最下游筛网单元S4的上游；特别地，将空间V设置成将流体馈送入第二最下游筛网单元S3中。
蛋白质二硫键异构酶，EC 5.3.4.1。
在一个实施例中，PDI包含属于氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的至少一个催化结构域，并且其中该结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点。
在另一个实施例中，PDI包含两个催化结构域，每个催化结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点，这两个催化结构域由至少一个非催化结构域分隔。
特别地，CXXC基序选自由以下组成的组：CGHC、CTHC、CPHC和CSMC，最特别是CGHC。
在特定的实施例中，硫氧还蛋白结构域属于Pfam家族Pf00085或Pf13848。
在另一个特定的实施例中，PDI包含三个结构域结构Pf00085-Pf13848-Pf00085，其中催化活性结构域表示为Pf00085。
硫氧还蛋白肽
在一个实施例中，硫氧还蛋白是通过半胱氨酸硫醇-二硫键交换促进其他蛋白质的还原而充当抗氧化剂的蛋白质。它们是可以催化蛋白质二硫键还原的酶。在另一个实施例中，硫氧还蛋白肽包含活性位点基序CXXC，特别是CGPC。硫氧还蛋白还具有称为硫氧还蛋白折叠的特征性三级结构。因此，根据本发明，硫氧还蛋白肽是氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的成员，并且典型地包含催化结构域，该催化结构域包含特征在于具有CXXC、优选地CGPC基序的活性位点。硫氧还蛋白结构域属于Pfam家族Pf00085(https://pfam.xfam.org/ family/Thioredoxin)。
除PDI或Trx外适用于本发明的方法的水解酶
在一个实施例中，适合用于在本发明的方法中使用的水解酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55(非还原性末端α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)；EC 3.2.1.185(非还原性末端β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶))、纤维二糖水解酶I(EC 3.2.1.150)、纤维二糖水解酶II(E.C.3.2.1.91)、纤维二糖苷酶(E.C.3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)以及蛋白酶(E.C 3.4)。
优选地，酶选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
在一个实施例中，该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
在另一个实施例中，这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。这些纤维素酶可以至少选自由以下组成的组：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。更特别地，一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
在一个实施例中，这些水解酶进一步包含阿拉伯呋喃糖苷酶。阿拉伯呋喃糖苷酶可以选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽、GH51多肽、特别是GH62多肽。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物如里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达。根据这些实施例，根据本发明定义的木聚糖酶和或阿拉伯呋喃糖苷酶多肽与来自木霉属(Trichoderma)的内源纤维素酶一起表达。
在一个实施例中，包含一种或多种水解酶的酶组合物可包含衍生自里氏木霉或特异腐质霉(Humicula insolens)的纤维素酶。
在一个特定的实施例中，这些纤维素酶衍生自里氏木霉背景纤维素酶，并且具有衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的CBH I和CBH II。
在一个实施例中，纤维素酶组合物包含烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256)和烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2011/057140)与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)、和青霉属物种(埃默森)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂，其中内切葡聚糖酶活性由里氏木霉纤维素酶提供。
在另一个特定的实施例中，纤维素酶组合物包含含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO2012/044915)、和青霉属物种(埃默森)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂，其中内切葡聚糖酶活性由里氏木霉纤维素酶提供。
在一个实施例中，一种或多种水解酶是纯化的。这些纯化的酶可用于本发明其他实施例中所述的酶组合物中。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在液体组合物中。组合物可为均匀的或不均匀的。
在一个实施例中，一种或多种水解酶在固体组合物中。
在一个实施例中，与所述玉米籽粒物质的一个或多个级分混合的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白(EP)/公吨(MT)进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间，如0.010-0.5kg EP/MT玉米籽粒之间，如0.05-0.5kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.5kg/MT之间、或0.1-0.5kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.01-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.1-0.4kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.01-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.3kg/MT之间或0.1-0.3kg/MT玉米籽粒之间、或0.005-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.010-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.05-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.2kg/MT之间、或0.1-0.2kg/MT玉米籽粒之间、或如0.075-0.10kg/MT玉米籽粒之间、或0.075-0.11kg/MT玉米籽粒之间。
在优选的实施例中，酶组合物包含获得自里氏木霉培养物的纤维素酶，如里氏木霉ATCC 26921的培养物。适合的纤维素酶是可获得的；例如来自诺维信公司，商品名为
具有木聚糖酶活性的多肽
木聚糖酶适合应用于根据本发明的方法中。木聚糖酶多肽可以选自家族GH5、GH10、GH30、GH11和GH8。
更多特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH5木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:8的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:8的氨基酸1至551。
另一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH5木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:9的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:9的氨基酸1至551。
另一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH10木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:11的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:11的氨基酸21至405。
另一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH10木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:10的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:10的氨基酸20至319。
具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽
另一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH62阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:12的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:12的氨基酸27至332。
另一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中GH62阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:13的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:13的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
在一个实施例中，成熟多肽为SEQ ID NO:13的氨基酸17至325。具有蛋白质二硫键异构酶(PDI)活性或硫氧还蛋白活性的多肽
在一些实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多肽，这些分离的或纯化的多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且具有蛋白质二硫键异构酶活性，并且优选地该PDI活性是SEQ ID NO:1的成熟多肽的PDI活性的至少75％，是SEQ ID NO:1的成熟多肽的活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽的氨基酸序列；或是具有PDI活性的其片段。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸21至516。
在一个实施例中，具有PDI活性的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
在一些实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多肽，这些分离的或纯化的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且具有蛋白质二硫键异构酶活性，并且优选地该PDI活性是SEQ ID NO:2的成熟多肽的PDI活性的至少75％，是SEQ ID NO:2的成熟多肽的活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:2或其成熟多肽的氨基酸序列；或是具有PDI活性的其片段。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸21至513。
在一个实施例中，具有PDI活性的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
在一些实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多肽，这些分离的或纯化的多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且具有蛋白质二硫键异构酶活性，并且优选地该PDI活性是SEQ ID NO:3的成熟多肽的PDI活性的至少75％，是SEQ ID NO:3的成熟多肽的活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:3或其成熟多肽的氨基酸序列；或是具有PDI活性的其片段。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸21至516。
在一个实施例中，具有PDI活性的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
在一些实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多肽，这些分离的或纯化的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且具有蛋白质二硫键异构酶活性，并且优选地该PDI活性是SEQ ID NO:4的成熟多肽的PDI活性的至少75％，是SEQ ID NO:4的成熟多肽的活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:4或其成熟多肽的氨基酸序列；或是具有PDI活性的其片段。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸21至517。
在一个实施例中，具有PDI活性的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
在一些实施例中，本发明涉及分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽，这些分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且具有硫氧还蛋白肽活性，并且优选地该硫氧还蛋白活性是SEQ ID NO:5的成熟多肽的硫氧还蛋白活性的至少75％，是SEQID NO:5的成熟多肽的活性的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:5或其成熟多肽的氨基酸序列；或具有硫氧还蛋白肽活性的其片段。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至110。
在一个实施例中，具有硫氧还蛋白活性的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:24的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
具有蛋白质二硫键异构酶活性或硫氧还蛋白肽活性的多肽的来源
本发明的具有蛋白质二硫键异构酶活性的多肽可以获得自任何适合的来源。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株生产的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在另一方面，多肽是获得自嗜热子囊菌属(Themoascus)的菌株、特别是坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的多肽，例如，获得自坚脆嗜热子囊菌CBS181.67的多肽。
在另一方面，多肽是获得自基思菌属(Keithomyces)的菌株、特别是肉色基思菌(Keithomyces carneus)的多肽。
在另一方面，多肽是获得自曲霉属(Aspergillus)的菌株、特别是多刺孢曲霉(Aspergillus spinulosporus)的多肽。
在另一方面，多肽是获得自嗜热子囊菌属的菌株、特别是橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的多肽。
在另一方面，多肽是获得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的多肽，例如，获得自棘孢曲霉CBS101.43的多肽。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段以及其他分类学等同物，例如无性型，而与它们已知的物种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，比如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如本文所述。
在一个实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多核苷酸，这些分离的或纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多核苷酸，这些分离的或纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多核苷酸，这些分离的或纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多核苷酸，这些分离的或纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及分离的或纯化的多核苷酸，这些分离的或纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:24的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。多核苷酸可以克隆自嗜热子囊菌属、基思菌属、或曲霉属的菌株或相关生物，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的物种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如，其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变多肽的氨基酸序列，但对应于预期用于产生酶的宿主生物的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,1991,Protein Expression and Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可用多种方式操纵多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。在一个实施例中，一个或多个控制序列对于编码本发明的多肽的多核苷酸是天然的或异源的。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明多核苷酸的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于以下文献中：Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明多核苷酸的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，该前导序列是对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下的基因中获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对于该编码序列是异源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要异源信号肽编码序列。可替代地，异源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiol.Rev.[微生物评论]57:109-137描述。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的信号肽从以下的基因中获得：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。
还可能希望的是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节序列的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是使基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以生产重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以使编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于在木霉属(Trichoderma)细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数量，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的生产。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
在一些实施例中，多肽与重组宿主细胞是异源的。
在一些实施例中，一个或多个控制序列中的至少一个与编码多肽的多核苷酸是异源的。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个或五个。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何微生物或植物细胞，例如原核细胞或真菌细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶状微生物学(布拉格)]49：399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171：3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98：6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门细分的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上所定义)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管霉(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑根毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该多肽。
宿主细胞是在合适的使用本领域已知的方法生产多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不被分泌，则可以从细胞裂解物中将其回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从发酵培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的全发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
酶组合物
用于在根据本发明的方法中使用的酶组合物可以包含催化蛋白质二硫键的变化(包括氧化、还原、或异构化)的酶，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI)(EC 5.3.4.1)或硫氧还蛋白肽作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，几种)选自由以下组成的组的酶：木聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。
液体配制品
本发明还涉及液体组合物，这些液体组合物包含本发明的蛋白质二硫键异构酶或硫氧还蛋白肽。该组合物可包含酶稳定剂(酶稳定剂的实例包括多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸))。
在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种运载体材料以增加此类组合物的体积。适合的填料或运载体材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的适合的填料或运载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5％至约90％的此类材料。
在一个方面，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％至25％w/w的一种或多种具有[酶]活性的本发明的多肽；以及
(B)水。
在另一个实施例中，液体配制品包含20％至80％w/w的多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％至25％w/w的一种或多种具有[酶]活性的本发明的多肽；
(B)20％至80％w/w的多元醇；
(C)任选地0.001％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(D)水。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％至25％w/w的一种或多种具有[酶]活性的本发明的多肽；
(B)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；
(C)任选地20％至80％w/w的多元醇；以及
(D)水。
在另一个实施例中，液体配制品包含一种或多种配制剂，例如选自下组的配制剂，该组由以下组成：多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自由以下组成的组：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。在一个实施例中，多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。
在另一个实施例中，防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，例如，0.05％至1.0％w/w防腐剂、或0.1％至0.5％w/w防腐剂。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，例如，0.02％至1.5％w/w防腐剂、0.05％至1.0％w/w防腐剂、或0.1％至0.5％w/w防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品进一步包含一种或多种另外的酶，例如，水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。该一种或多种另外的酶优选地选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液配制品或细胞组合物进一步包含在发酵工艺中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文所用的术语“发酵液”是指由细胞发酵生产的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，生产发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一些实施例中，发酵液配制品或细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一些实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一些实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)在蛋白质合成的碳限制条件下孵育生长到饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。
在以下编号的实施例中进一步披露本发明。
实施例[1].一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使碾磨的玉米籽粒、特别是这些碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的多肽接触，该多肽催化蛋白质二硫键的变化，包括氧化、还原、或异构化，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI)(EC 5.3.4.1)或硫氧还蛋白肽。
实施例[2].根据实施例1所述的方法，其中与不存在/未添加PDI或硫氧还蛋白肽的工艺相比，在该湿磨工艺期间从碾磨的籽粒中释放的淀粉和/或谷蛋白、特别是不溶性淀粉和谷蛋白的量增加。
实施例[3].根据实施例2所述的方法，其中与未添加PDI相比，测量为每克干固体释放的mg蛋白质(mg/gDS)的该增加是至少0.5％点、至少0.75％点、至少1.0％点、至少1.5％点、至少2.5％点、如至少5.0％点，其中纤维洗涤在pH范围3.5–5.5，如pH 4.0、4.5或5.0，且至少300μg EP/gDS的酶剂量下进行。
实施例[4].根据实施例1-3中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽存在于/添加至纤维级分中，特别是在纤维洗涤步骤期间。
实施例[5].根据前述实施例中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)对该玉米籽粒物质、特别是精细纤维级分进行纤维洗涤程序，从而将淀粉和谷蛋白从该纤维中分离出来；
其中在步骤d)之前或期间存在/添加至少一种PDI或硫氧还蛋白肽。
实施例[6].根据实施例4所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
e)将该淀粉从该谷蛋白中分离出来；以及任选地
f)洗涤该淀粉。
实施例[7].根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少10μg EP/gDS、至少25μg EP/g DS、至少50μg EP/g DS、至少75μg EP/g DS、至少100μg EP/g DS、至少200μg EP/g DS、至少300μg EP/g DS、至少500μg EP/g DS，例如在以下范围中：10至2000μg EP/g DS、25至1000μg EP/g DS、50至800μgEP/g DS、100至500μg EP/g DS。
实施例[8].根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少200ppm、至少300ppm、至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm，例如像在以下范围中：200-3000ppm、300-2000ppm、400–800ppm。
实施例[9].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在该纤维洗涤步骤之前或期间存在/添加有效量的一种或多种水解酶，并且其中所述水解酶中的至少一种选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
实施例[10].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH8多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、GH8多肽或其组合。
实施例[11].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。
实施例[12].根据实施例10所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)、和β-葡糖苷酶。
实施例[13].根据实施例11所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
实施例[14].根据实施例11-13所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自里氏木霉。
实施例[15].根据实施例11-13中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶选自由以下组成的组：烟曲霉GH10木聚糖酶，烟曲霉β-木糖苷酶，与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I、烟曲霉纤维二糖水解酶II、烟曲霉β-葡糖苷酶变体、和青霉属物种(埃默森)GH61多肽的里氏木霉纤维素酶制剂。
实施例[16].根据实施例15所述的方法，其中这些纤维素酶选自包含以下的组合物：
i)SEQ ID NO 14的GH10木聚糖酶、SEQ ID NO:15的β-木糖苷酶、SEQ ID NO:16的纤维二糖水解酶I、SEQ ID NO:17的纤维二糖水解酶II、SEQ ID NO:18的β-葡糖苷酶、SEQID NO:19的GH61；
或
ii)与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ IDNO:15具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ IDNO:19具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽；
以及
iii)至少一种衍生自里氏木霉的内切葡聚糖酶。
实施例[17].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含阿拉伯呋喃糖苷酶。
实施例[18].根据实施例17所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽和GH51多肽。
实施例[19].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中对来自步骤c)的包含纤维、淀粉和谷蛋白的该玉米籽粒物质进行进一步的碾磨步骤，优选在步骤d)中的该纤维洗涤程序之前进行精细碾磨步骤。
实施例[20].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中使用纤维洗涤系统进行所述纤维洗涤程序，该纤维洗涤系统包含多个筛网单元(S1…S4)，这些筛网单元以逆流洗涤配置流体连接；每个筛网单元被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分(s)和第二级分(f)；所述第二级分(f)含有与该第一级分(s)相比，以wt％测量的更高量的纤维；以及任选地空间(V)，该空间被设置在该系统中并且流体连接以接收所述第一级分(s)之一、所述第二级分(f)之一、或混合的第一和第二级分(s，f)、优选地仅第二级分(f)，并配置成为在该空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或两个级分导出到下游筛网单元(S4)，
其中该系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元(S1)
-将来自最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)作为含有淀粉的产物流导出，
-导入工艺用水，优选地设置用于将工艺用水导入最下游筛网单元(S4)，
-将来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该洗涤的玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白；以及
-任选地将水解酶引入该系统。
实施例[21].根据实施例20所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包括使用纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包含被配置成为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟且小于48小时的总保留时间的空间(V)/槽。
实施例[22].根据实施例20-21中任一项所述的方法，其中所述空间(V)具有在50-1000m3的范围内的体积。
实施例[23].根据实施例20-22中任一项所述的方法，其中所述空间(V)具有在80和250m3的范围内的体积。
实施例[24].根据实施例20-23中任一项所述的方法，其中在配置于该纤维洗涤系统中的所述空间(V)/槽中的孵育时间为至少5分钟且小于48小时，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间。
实施例[25].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，优选在46℃和52℃之间。
实施例[26].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物如里氏木霉中表达。
实施例[27].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中与所述碾磨的玉米籽粒物质的一个或多个级分混合/接触的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间。
实施例[28].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中SO2的来源选自焦亚硫酸钠(Na2S2O5)、NaHSO3和/或添加的SO2气体。
实施例[29].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽包含属于氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的至少一个催化结构域，并且其中该结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点。
实施例[30].根据实施例29所述的方法，其中该PDI包含两个催化结构域，每个催化结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点，这两个催化结构域由至少一个非催化结构域分隔。
实施例[31].根据实施例29-30所述的方法，其中该CXXC基序选自由以下组成的组：CGHC、CTHC、CPHC、CGPC和CSMC，特别是CGHC或CGPC。
实施例[32].根据实施例29-31中任一项所述的方法，其中该催化结构域属于家族Pf00085。
实施例[33].根据实施例29-32所述的方法，其中该PDI包含三个结构域结构Pf00085-Pf13848-Pf00085，其中中央Pf13848结构域的侧翼为两个Pf00085结构域，一个在N末端并且另一个在C末端。
实施例[34].根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(几个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
实施例[35].根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
实施例[36].根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
实施例[37].根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
实施例[38].根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该硫氧还蛋白肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:5的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有硫氧还蛋白肽活性。
实施例[39].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
实施例[40].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
实施例[41].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:13的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
实施例[42].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
实施例[43].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
实施例[44].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自里氏木霉或特异腐质霉。
实施例[45].根据前述实施例中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自具有来自烟曲霉的CBH I和CBH II的里氏木霉背景纤维素酶。
实施例[46].一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:1的氨基酸21-516具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:1的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
实施例[47].根据实施例46所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[48].根据实施例46-47中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[49].根据实施例46所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:1的氨基酸21-516。
实施例[50].一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸21-513具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:2的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
实施例[51].根据实施例46所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[52].根据实施例50-51中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[53].根据实施例50所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:2的氨基酸21-513。
实施例[54].一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:3的氨基酸21-516具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:3的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:3的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
实施例[55].根据实施例54所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[56].根据实施例54-55中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[57].根据实施例54所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:3或其成熟多肽；或SEQ ID NO:3的氨基酸21-516。
实施例[58].一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:4的氨基酸21-517具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:4的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:4的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
实施例[59].根据实施例58所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[60].根据实施例58-59中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[61].根据实施例58所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:4的氨基酸21-517。
实施例[62].一种具有还原蛋白质二硫键的能力的分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽，该分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:5的氨基酸1-110具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:5的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:5的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:24的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有硫氧还蛋白活性活性。
实施例[63].根据实施例62所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[64].根据实施例62-63中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
实施例[65].根据实施例62所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:5或其成熟多肽；或SEQ ID NO:5的氨基酸1-110。
实施例[66].根据实施例46-65中任一项所述的多肽，其中与在纤维洗涤步骤中不存在/未添加PDI或硫氧还蛋白肽的工艺相比，在该湿磨工艺期间从碾磨的籽粒的富含纤维的级分中释放的淀粉和/或谷蛋白、特别是不溶性淀粉和谷蛋白的量增加。
实施例[67].一种组合物，该组合物包含根据实施例46-66中任一项所述的多肽。
实施例[68].根据实施例67所述的组合物，该组合物进一步包含根据实施例10所述的木聚糖酶和/或根据实施例11-16所述的纤维素酶。
实施例[69].一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含根据实施例46-66中任一项所述的多肽。
实施例[70].一种分离的或纯化的多核苷酸，该分离的或纯化的多核苷酸编码根据实施例46-66中任一项所述的多肽。
实施例[71].一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据实施例70所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个异源控制序列。
实施例[72].一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据实施例70所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个异源控制序列。
实施例[73].一种产生具有蛋白质二硫键异构酶活性或硫氧还蛋白肽活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养根据实施例72所述的重组宿主细胞，以及任选地回收该多肽。
实例
测定
用二硫苏糖醇进行的胰岛素还原测定
原理
牛胰岛素中的两种胱氨酸在二硫苏糖醇(DTT)的存在下被PDI还原。反应后，通过基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI MS)分析完整胰岛素的消失和两种肽的形成。
化学品
碳酸氢铵(ABC)，福禄克公司(Fluka)09830
乙二胺四乙酸(EDTA)，二钠盐，默克公司(Merck)1.08418乙酸铵，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)32301
二硫苏糖醇(DTT)，西格玛公司(Sigma)D0632
来自牛胰腺的胰岛素，西格玛公司I5500
三氟乙酸(TFA)，西格玛公司302031
2′,5′-二羟基苯乙酮(DHAP)，西格玛公司D107603
乙腈，西格玛公司34888
试剂
ABC缓冲液：10mM碳酸氢铵，pH 7
EDTA溶液：100mM EDTA，pH 8
乙酸盐缓冲液：25mM乙酸铵，pH 5
底物原液：在ABC缓冲液中的10mg/mL胰岛素
底物工作溶液：100μL底物原液+20μL EDTA溶液+780μL25mM乙酸盐缓冲液。添加EDTA后，等到溶液澄清后再添加乙酸盐缓冲液
DTT溶液：在Milli Q水中的200mM DTT
终止剂：在Milli Q水中的2％(V/V)TFA
基质：在乙腈中的20mg/mL DHAP
材料
MALDI MS：布鲁克公司(Bruker)UltrafleXtremeTM
布鲁克公司AnchorChip MALDI靶板
博圣公司(Biosan)板热振荡器PST 100-HL
酶
蛋白质二硫键异构酶(PDI)
程序
1)制备酶工作溶液(典型地为0-100μg酶蛋白/mL，产生0-10ppm(测定内))和新鲜制备的底物工作溶液
2)将90μL底物工作溶液和10μL酶工作溶液混合在96孔微量滴定板中。对于酶空白，添加10μL Milli Q水代替酶溶液。
3)通过添加1μL DTT溶液或对于空白1μL Milli Q水(试剂空白)开始反应
4)将板在40℃下以550rpm振荡孵育10分钟
5)孵育后，通过添加100μL终止剂停止反应
6)对于MALDI MS分析，将2μL样品与4μL DHAP混合，并将0.7μL转移到靶板。质谱是以正线性模式获得的。离子源1和2分别设置为20kV和18.8kV，延迟为11340ns，且采样率为6.4ns。每个光谱是每个样品点5000次拍摄(shot)的累积平均值，且离子质量范围设置为500-7000。
7)可以观察到与酶空白和试剂空白的光谱相比，酶的活性表现为完整牛胰岛素的质量峰面积(质量范围5670–6000)的减小以及两条A和B肽链(质量范围分别为2300-2450和3325-3500)的出现的增加。(应该注意的是，可以观察到对应于完整胰岛素和两种肽的几种钠加合物的峰，这些峰包括在所使用的质量范围内。)
8)如果需要，可以通过使用不同酶浓度运行测定来制备标准曲线。计算链A(或B)的离子峰面积与完整牛胰岛素的离子的离子峰面积之间的比率，并绘制该比率与酶浓度的图表。
用亚硫酸盐进行的胰岛素还原测定
原理
牛胰岛素中的两种胱氨酸在亚硫酸盐的存在下被PDI还原。反应后，通过基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI MS)分析完整胰岛素的消失和两种肽的形成。
化学品
碳酸氢铵(ABC)，福禄克公司09830
乙二胺四乙酸(EDTA)，二钠盐，默克公司1.08418
乙酸铵，西格玛奥德里奇公司32301
焦亚硫酸钠，默克公司31448
来自牛胰腺的胰岛素，西格玛公司I5500
三氟乙酸(TFA)，西格玛公司302031
2′,5′-二羟基苯乙酮(DHAP)，西格玛公司D107603
乙腈，西格玛公司34888
试剂
ABC缓冲液：10mM碳酸氢铵，pH 7
EDTA溶液：100mM EDTA，pH 8
乙酸盐缓冲液：25mM乙酸铵，pH 5
底物原液：在ABC缓冲液中的10mg/mL胰岛素
底物工作溶液：100μL底物原液+20μL EDTA溶液+780μL25mM乙酸盐缓冲液。添加EDTA后，等到溶液澄清后再添加乙酸盐缓冲液
亚硫酸盐溶液：在Milli Q水中的60mM焦亚硫酸钠
终止剂：在Milli Q水中的2％(V/V)TFA
基质：在乙腈中的20mg/mL DHAP
材料
MALDI MS：布鲁克公司UltrafleXtremeTM
布鲁克公司AnchorChip MALDI靶板
博圣公司板热振荡器PST 100-HL
酶
蛋白质二硫键异构酶(PDI)(坚脆嗜热子囊菌(P73RVY))
程序
1)制备酶工作溶液(典型地为0-100μg酶蛋白/mL，产生0-10ppm(测定内))和新鲜制备的底物工作溶液以及新鲜制备的亚硫酸盐溶液。
2)将90μL底物工作溶液和10μL酶工作溶液混合在96孔微量滴定板中。对于酶空白，添加10μL Milli Q水代替酶溶液。
3)通过添加5μL亚硫酸盐溶液或对于空白5μL Milli Q水(试剂空白)开始反应
4)将板在40℃下以550rpm振荡孵育30分钟
5)孵育后，通过添加100μL终止剂停止反应
6)对于MALDI MS分析，将2μL样品与4μL DHAP混合，并将0.7μL转移到靶板。质谱是以正线性模式获得的。离子源1和2分别设置为20kV和18.8kV，延迟为11340ns，且采样率为6.4ns。每个光谱是每个样品点5000次拍摄的累积平均值，且离子质量范围设置为500-7000。
7)可以观察到与酶空白和试剂空白的光谱相比，酶的活性表现为完整牛胰岛素的质量峰面积(质量范围5670–6000)的减小以及两条A和B肽链(质量范围分别为2300-2640和3325-3630)的出现的增加。(应该注意的是，可以观察到对应于完整胰岛素和两种肽的几种钠加合物的峰，这些峰包括在所使用的质量范围内。另外，形成的A和B肽链以还原形式和添加了SO3残基的形式的混合物存在，这两种形式都包括在质量范围设置中。)
8)如果需要，可以通过使用不同酶浓度运行测定来制备标准曲线。计算链A(或B)的离子峰面积与完整牛胰岛素的离子的离子峰面积之间的比率，并绘制该比率与酶浓度的图表。
菌株
菌株橙色嗜热子囊菌分离自1998年中国云南的土壤。菌株坚脆嗜热子囊菌分离自美国加利福尼亚州的植物(CBS181.67)。鉴别菌株并基于ITS的DNA测序对分类进行指定(表1)。
表1
SEQ ID NO 生物_名称 来源国
1 坚脆嗜热子囊菌 美国
2 肉色基思菌 中国
3 多刺孢曲霉 中国
4 橙色嗜热子囊菌 中国
5 棘孢曲霉 CBS101.43
实例1：来自橙色嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶(SEQ ID NO:4)的克隆
将具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的蛋白质二硫键异构酶从分离自橙色嗜热子囊菌的基因组DNA中进行PCR扩增，并克隆到表达载体pDAU724(WO 2018/113745)中。
将最终的表达质粒转化到米曲霉DAU785表达宿主(WO 95/002043)中。将100μl的原生质体与2.5-10μg的包含蛋白质二硫键异构酶基因的表达质粒和300μl的60％ PEG4000、10mM CaCl2、和10mM Tris-HCl pH7.5混合，并且轻轻地混合。将混合物在室温下孵育30分钟，并将原生质体涂布到补充有100mM硝酸钠的蔗糖板上进行选择。
选择一个含有蛋白质二硫键异构酶表达构建体的重组米曲霉克隆，并且在摇瓶中于2400ml YPM(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％麦芽糖)中在30℃下在80rpm搅拌下培养3天。使用0.22μm 1-升瓶顶部真空滤器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher ScientificInc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)通过过滤收获含酶的上清液。
实例2：来自坚脆嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶(SEQ ID NO:1)的克隆
将具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的蛋白质二硫键异构酶从分离自坚脆嗜热子囊菌的基因组DNA中进行PCR扩增，并克隆到表达载体pDAU724(WO 2018/113745)中。
将最终的表达质粒转化到米曲霉DAU785表达宿主(WO 95/002043)中。将100μl的原生质体与2.5-10μg的包含蛋白质二硫键异构酶基因的表达质粒和300μl的60％ PEG4000、10mM CaCl2、和10mM Tris-HCl pH7.5混合，并且轻轻地混合。将混合物在室温下孵育30分钟，并将原生质体涂布到补充有100mM硝酸钠的蔗糖板上进行选择。
选择一个含有蛋白质二硫键异构酶表达构建体的重组米曲霉克隆，并且在摇瓶中于2400ml YPM(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％麦芽糖)中在30℃下在80rpm搅拌下培养3天。使用0.22μm 1-升瓶顶部真空滤器(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)通过过滤收获含酶的上清液。
实例3：在纤维洗涤中添加PDI的作用
将在玉米湿磨工艺中纤维压榨后的粗果皮纤维用作底物，并且在工艺相关条件下(即pH 4-5，40℃-48℃和400ppm二氧化硫)与酶一起孵育。孵育后，将纤维通过60μm孔径大小滤器进行真空过滤。将纤维饼重悬于水中并再次过滤。将提取的固体蛋白质和淀粉收集，并且通过离心彻底洗涤。通过LECO测量总氮并使用6.25的氮与蛋白质换算系数(Jones，USDA通告编号183，1931)确定含有从收集的滤液中提取的淀粉和谷蛋白的所得沉淀中蛋白质的量，并相对于起始纤维干固体的重量归一化。
化学品
粗果皮纤维样品
焦亚硫酸钠，默克公司货号31448
乙酸钠，西格玛奥德里奇公司，S8625
试剂
亚硫酸盐：在Na2S2O5+H2O->2Na++2HSO3 -反应后，将焦亚硫酸钠(Na2S2O5)加入缓冲液中，生成亚硫酸氢盐。因此，由593,6mg/L焦亚硫酸盐制备400ppm SO2。
缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH 4.0
材料
Infors-HT Multitron Pro孵育振荡器
Avanti J-E离心机
Millipore无菌管顶部滤器单元，60μm孔径大小(默克公司，订单号SCNY0060)
EZ-2Elite溶剂蒸发器
LECO氮测定仪FP628
酶
PDI A：来自坚脆嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶，披露为SEQ ID NO:1
PDIB：衍生自肉色基思菌的蛋白质二硫键异构酶，披露为SEQ ID NO:2
PDI C：衍生自多刺孢曲霉的蛋白质二硫键异构酶，披露为SEQ ID NO:3
PDI D：衍生自橙色嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶，披露为SEQ ID NO:4
衍生自棘孢曲霉的Trx硫氧还蛋白硫氧还蛋白肽，披露为SEQ ID NO:5
GH5木聚糖酶A：衍生自金黄杆菌属物种-10696并且披露为SEQ ID NO:8的GH5木聚糖酶
GH10木聚糖酶B：衍生自黑曲霉并且披露为SEQ ID NO:10的GH10木聚糖酶
GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A：衍生自黑曲霉并且披露为SEQ ID NO:12的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶
纤维素酶A/Celluclast 1.5L：衍生自里氏木霉的纤维素酶混合物。该纤维素酶组合物将包含在里氏木霉中表达的所有纤维素酶活性；例如，内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。可商购自西格玛奥德里奇公司，Celluclast 1.5L
用于15mL纤维洗涤测定的程序
1.将粗纤维样品悬浮在缓冲液(pH 4-5，0.02M乙酸钠终浓度)中，至15mL含有5％干固体的浆液。记录总纤维干重的量(重量纤维)。
(确切的pH在实例中指定)
2.向该浆液酶中添加木聚糖酶和纤维素酶的混合物(酶的确切量在实例中指定)以及400ppm SO2(终浓度)。
3.将样品在孵育振荡器中在温度为40℃-48℃(确切的温度在实例中指定)下以600rpm孵育4小时。
4.孵育后，将纤维在Millipore无菌滤器单元中进行真空过滤
5.将保留的纤维用蒸馏水重悬至20mL的体积，彻底涡旋并再次真空过滤。
6.将含有提取的淀粉和谷蛋白的两种滤液合并。
7.将来自(6)的合并的滤液离心(3,500rpm，20分钟)
8.离心后，使用50mL血清移液器缓慢去除上清液，以免干扰淀粉和谷蛋白沉淀。再次重复步骤5到8。
9.在每个洗涤步骤中将来自(8)的沉淀使用20mL蒸馏水洗涤两次以去除溶解的组分。
10.洗涤并最终去除上清液后，剩余总体积为10mL，包括沉淀。使用溶剂蒸发器(方法：水性，最高62℃，2小时，3,000rpm，5mbar)去除过量的水。
11.冷却后，称量样品(重量沉淀)并剧烈涡旋以达到均一性。
12.使用宽口径吸头将170μL的来自(11)的浆液移液到LECO锡囊(NC9804300，飞世尔科技公司(Fisher Scientific))中，并记录确切的重量(重量浆液)。
13.使用LECO FP628分析样品的总氮(TotN)，并使用6.25的氮与蛋白质系数(Jones，USDA通告编号183，1931)换算成样品的蛋白质百分比。
14.使用沉淀的蛋白质百分比和最终重量计算蛋白质释放的总量。然后将释放的蛋白质的克数相对于起始纤维干固体的克数归一化。
计算
在表2中所示的实验条件下，使用15mL纤维洗涤测定测试来自坚脆嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶(SEQ ID NO:1)的性能。表3示出了释放的蛋白质的量。结果基于每种条件下的3个单独的实验。
表2：实验条件
表3：蛋白质提取产率
结果显示为平均值±标准偏差，n＝3
在表4中所示的实验条件下，使用15mL纤维洗涤测定测试来自肉色基思菌的蛋白质二硫键异构酶(SEQ ID NO:2)的性能。表5示出了释放的蛋白质的量。结果基于每种条件下的3个单独的实验。
表4：实验条件
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表5：蛋白质提取产率
结果显示为平均值±标准偏差，n＝3
实例4：
酶：
蛋白质二硫键异构酶A：衍生自坚脆嗜热子囊菌的蛋白质二硫键异构酶，SED IDNO:1
GH10木聚糖酶B：衍生自黑曲霉的GH10木聚糖酶，SEQ ID NO:10
GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A：衍生自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶，SEQ ID NO:12
纤维素酶A：衍生自里氏木霉的纤维素酶混合物。该纤维素酶组合物将包含在里氏木霉中表达的所有纤维素酶活性；例如，内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。可商购自西格玛奥德里奇公司，Celluclast 1.5L
使用包括纤维素酶A、GH10木聚糖酶B和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A与蛋白质二硫键异构酶A组合的共混物，用5％纤维干物质进行0.5g中等通量(MTP)纤维测定(15mL纤维洗涤 测定)，该5％纤维干物质以每克纤维干物质1000μg酶蛋白的剂量在pH4.0下在20mM乙酸钠缓冲液中于48℃与400ppm亚硫酸氢(HSO3 -)一起孵育120分钟。共混物基于酶蛋白由30％蛋白质二硫键异构酶A、10.5％的GH10木聚糖酶B、3.5％的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A以及剩余的56％的纤维素酶组成。在Na2S2O5+H2O->2Na++2HSO3 -反应后，将焦亚硫酸钠(Na2S2O5)加入缓冲液中，生成亚硫酸氢盐。作为比较，包括低剂量(700μg EP/g-ds纤维)和高剂量(1000μgEP/g-ds纤维)两者的仅含有80％纤维素酶A、15％ GH10木聚糖酶A和5％ GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(不含蛋白质二硫键异构酶A)的共混物。在MTP纤维测定中，将具有16.79％残留淀粉和10.00％残留蛋白质的玉米纤维用作底物。测量淀粉+谷蛋白(干物质)以及单个蛋白质在以下指定处理下从玉米纤维中的释放。
表6
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因此，在纤维素酶A+GH10木聚糖酶B+GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A的基础上添加蛋白质二硫键异构酶A，可显著提高玉米湿磨工艺中淀粉+谷蛋白以及蛋白质的产率。
实例5通过在纤维洗涤中使用蛋白质二硫键异构酶而增加的蛋白质释放
在表7中的条件下，通过两个实验进行15mL纤维洗涤测定。所有处理均采用里氏木霉纤维素酶和木聚糖酶A的共混物。基于毫克酶蛋白，里氏木霉纤维素酶与木聚糖酶A的比率大约为90:10。将每种蛋白质二硫键异构酶(PDI)添加到适当的处理中，而对照仅含有纤维素酶和木聚糖酶A。使用LECO FP628确定总氮，并将其相对于起始纤维干固体的克数(gDS)归一化。测试的PDI多样性见表2，并且通过几个实验得到的蛋白质释放结果见表3。
表7：实验条件
表8：评估的蛋白质二硫键异构酶多样性
表9：来自15mL纤维测定的结果
(±标准偏差，n＝3)
实例6在大规模纤维洗涤测定中，单个硫氧还蛋白结构域提高来自玉米纤维的蛋白质产率的有效性
大规模玉米纤维洗涤测定(5克测定)：
5克玉米纤维测定通常包括：在酶存在下，在与该方法相关的条件(pH 3.5至4，温度约48℃-52℃)下并且经1至4hr之间的时间段，孵育从湿磨设备获得的湿纤维样品。孵育后，将纤维转移并且按压在75微米或更小的筛网上，其中滤液主要由分离的淀粉和谷蛋白组成。在筛网上重复洗涤工艺几次，并将洗涤液与初始滤液一起收集。使收集的滤液沉降过夜，然后经由真空吸出上清液。将剩余的滤液和不溶物倒入50mL管中，并在Avanti J-E中以3,500rpm离心10分钟以沉淀淀粉和谷蛋白。轻轻倒出上清液，并且将剩余的沉淀在Labconco冷冻干燥机中冷冻干燥过夜或直到去除所有水分。使用SPEX SamplePrepGenogrinder以1750rpm碾磨样品一分钟。称量、记录100至150毫克的样品。使用LECO FP628测定(run)样品的总氮，并使用6.25的氮与蛋白质系数换算成样品的蛋白质百分比(Jones,D.B.(1931)Factors for converting percentage of nitrogen in foods and feedsinto percentages of proteins[将食品和饲料中氮的百分比换算成蛋白质的百分比的系数]USDA Circular[USDA通告],183,1-22.)。使用沉淀的蛋白质百分比和最终重量计算蛋白质释放的总量。然后将释放的蛋白质的克数相对于起始纤维干固体的克数归一化。
5克纤维测定在pH 4下进行，将纤维在48℃下与400ppm二氧化硫一起孵育2小时。所有处理均采用酶组合物，该酶组合物由里氏木霉纤维素酶和GH5木聚糖酶A的共混物构成。基于毫克酶蛋白，里氏木霉与GH5木聚糖酶A的比率大约为90:10。将每种实验酶SEQ IDNO:1或5添加到适当的处理中，而对照仅含有里氏木霉纤维素酶和GH5木聚糖酶A的共混物。使用LECO FP628确定总氮，并将其相对于起始纤维干固体的克数(gDS)归一化。测试的PDI多样性见表10，并且通过几个实验得到的蛋白质释放结果见表11。
表10：评估的蛋白质二硫键异构酶和硫氧还蛋白多样性
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表11：来自15mL纤维测定的结果
(±标准偏差，n＝3)
实例7
测定来自坚脆嗜热子囊菌的PDI(SEQ ID NO:1)的活性，如用0至10μg/mL PDI(测定内浓度)和2mM DTT进行的胰岛素活性测定中所述。表12示出了所得的A肽链与完整胰岛素的质量峰面积以及B肽链与完整胰岛素的质量峰面积。
表12.
在不存在酶或DTT的情况下，牛胰岛素中非常少量的胱氨酸被还原，而在存在PDI的情况下，大量的胱氨酸被还原，导致胰岛素分离成A肽和B肽。
实例8
测定来自坚脆嗜热子囊菌的PDI(SEQ ID NO:1)的活性，如用0至10μg/mL PDI(测定内浓度)和2.9mM亚硫酸盐进行的胰岛素活性测定中所述。表13示出了所得的A肽链与完整胰岛素的质量峰面积以及B肽链与完整胰岛素的质量峰面积。
表13.
在不存在酶或亚硫酸盐的情况下，牛胰岛素中非常少量的胱氨酸被还原，而在存在PDI的情况下，大量的胱氨酸被还原，导致胰岛素分离成A肽和B肽。

Claims (73)

1.一种用于在湿磨工艺中提高来自玉米籽粒的淀粉产率和/或谷蛋白产率的方法，该方法包括使碾磨的玉米籽粒、特别是这些碾磨的籽粒的富含纤维的级分与有效量的多肽接触，该多肽催化蛋白质二硫键的变化，包括氧化、还原、或异构化，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI)(EC 5.3.4.1)或硫氧还蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与不存在/未添加PDI或硫氧还蛋白肽的工艺相比，在该湿磨工艺期间从碾磨的籽粒中释放的淀粉和/或谷蛋白、特别是不溶性淀粉和谷蛋白的量增加。
3.根据权利要求2所述的方法，其中与未添加PDI相比，测量为每克干固体释放的mg蛋白质(mg/gDS)的该增加是至少0.5％点、至少0.75％点、至少1.0％点、至少1.5％点、至少2.5％点、如至少5.0％点，其中纤维洗涤在pH范围3.5–5.5，如pH 4.0、4.5或5.0，且至少300μg EP/gDS的酶剂量下进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽存在于/添加至纤维级分中，特别是在纤维洗涤步骤期间。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
a)将这些玉米籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；
b)将这些浸泡的籽粒碾磨，以产生碾磨的籽粒；
c)从这些碾磨的籽粒中分离胚芽，以产生包含纤维、淀粉和谷蛋白的玉米籽粒物质；以及
d)对该玉米籽粒物质、特别是精细纤维级分进行纤维洗涤程序，从而将淀粉和谷蛋白从该纤维中分离出来；
其中在步骤d)之前或期间存在/添加至少一种PDI或硫氧还蛋白肽。
6.根据权利要求5所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
e)将该淀粉从该谷蛋白中分离出来；以及任选地
f)洗涤该淀粉。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少10μg EP/g DS、至少25μg EP/g DS、至少50μg EP/g DS、至少75μgEP/g DS、至少100μg EP/gDS、至少200μg EP/g DS、至少300μg EP/g DS、至少500μg EP/gDS，例如在以下范围中：10至2000μg EP/g DS、25至1000μg EP/g DS、50至800μg EP/g DS、100至500μg EP/g DS。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中SO2在纤维洗涤期间存在/添加的量是至少200ppm、至少300ppm、至少400ppm、至少450ppm、至少500ppm、至少600ppm、至少700ppm、至少800ppm，例如像在以下范围中：200-3000ppm、300-2000ppm、400–800ppm。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在该纤维洗涤步骤之前或期间存在/添加有效量的一种或多种水解酶，并且其中所述水解酶中的至少一种选自木聚糖酶和/或纤维素酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：GH5多肽、GH8多肽、GH30多肽、GH10多肽、GH11多肽、或其组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含一种或多种纤维素酶。
12.根据权利要求10所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)、和β-葡糖苷酶。
13.根据权利要求11所述的方法，其中该一种或多种纤维素酶包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或其组合。
14.根据权利要求11-13所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自里氏木霉。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶选自由以下组成的组：烟曲霉GH10木聚糖酶，烟曲霉β-木糖苷酶，与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I、烟曲霉纤维二糖水解酶II、烟曲霉β-葡糖苷酶变体、和青霉属物种(埃默森)GH61多肽的里氏木霉纤维素酶制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中这些纤维素酶选自包含以下的组合物：
i)SEQ ID NO 14的GH10木聚糖酶、SEQ ID NO:15的β-木糖苷酶、SEQ ID NO:16的纤维二糖水解酶I、SEQ ID NO:17的纤维二糖水解酶II、SEQ ID NO:18的β-葡糖苷酶、SEQ IDNO:19的GH61；
或
ii)与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽，与SEQ ID NO:19具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的多肽；
以及
iii)至少一种衍生自里氏木霉的内切葡聚糖酶。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些水解酶包含阿拉伯呋喃糖苷酶。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：GH43多肽、GH62多肽和GH51多肽。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对来自步骤c)的包含纤维、淀粉和谷蛋白的该玉米籽粒物质进行进一步的碾磨步骤，优选在步骤d)中的该纤维洗涤程序之前进行精细碾磨步骤。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用纤维洗涤系统进行所述纤维洗涤程序，该纤维洗涤系统包含多个筛网单元(S1…S4)，这些筛网单元以逆流洗涤配置流体连接；每个筛网单元被配置成用于将玉米籽粒物质和液体流分离成两个级分：第一级分(s)和第二级分(f)；所述第二级分(f)含有与该第一级分(s)相比，以wt％测量的更高量的纤维；以及任选地空间(V)，该空间被设置在该系统中并且流体连接以接收所述第一级分(s)之一、所述第二级分(f)之一、或混合的第一和第二级分(s，f)、优选地仅第二级分(f)，并配置成为在该空间中接收的一个或两个级分提供孵育时间；并且将由此孵育的一个或两个级分导出到下游筛网单元(S4)，
其中该系统被配置成用于
-将玉米籽粒物质和液体导入最上游筛网单元(S1)
-将来自该最上游筛网单元(S1)的第一级分(s1)作为含有淀粉的产物流导出，
-导入工艺用水，优选地设置用于将工艺用水导入最下游筛网单元(S4)，
-将来自最下游筛网单元(S4)的第二级分(f4)作为洗涤的玉米籽粒物质导出，该洗涤的玉米籽粒物质含有比初始玉米籽粒物质更少量的淀粉和谷蛋白；以及
-任选地将水解酶引入该系统。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述纤维洗涤程序包括使用纤维洗涤系统，该纤维洗涤系统包含被配置成为在该纤维洗涤系统中提供至少35分钟且小于48小时的总保留时间的空间(V)/槽。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述空间(V)具有在50-1000m3的范围内的体积。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述空间(V)具有在80和250m3的范围内的体积。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中在配置于该纤维洗涤系统中的所述空间(V)/槽中的孵育时间为至少5分钟且小于48小时，比如在35分钟和24小时之间、在35分钟和小时之间、在35分钟和6小时之间、在35分钟和5小时之间、在35分钟和4小时之间、在35分钟和3小时之间、在35分钟和2小时之间、在45分钟和48小时之间、在45分钟和24小时之间、在45分钟和12小时之间、在45分钟和6小时之间、在45分钟和5小时之间、在45分钟和4小时之间、在45分钟和3小时之间、在45分钟和2小时之间。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中孵育温度在25℃和95℃之间，比如在25℃和90℃之间、在25℃和85℃之间、在25℃和80℃之间、在25℃和75℃之间、在25℃和70℃之间、在25℃和65℃之间、在25℃和60℃之间、在25℃和55℃之间、在25℃和53℃之间、在25℃和52℃之间、在30℃和90℃之间、在30℃和85℃之间、在30℃和80℃之间、在30℃和75℃之间、在30℃和70℃之间、在30℃和65℃之间、在30℃和60℃之间、在30℃和55℃之间、在30℃和53℃之间、在30℃和52℃之间、在35℃和90℃之间、在35℃和85℃之间、在35℃和80℃之间、在35℃和75℃之间、在35℃和70℃之间、在35℃和65℃之间、在35℃和60℃之间、在35℃和55℃之间、在35℃和53℃之间、在35℃和52℃之间、在39℃和90℃之间、在39℃和85℃之间、在39℃和80℃之间、在39℃和75℃之间、在39℃和70℃之间、在39℃和65℃之间、在39℃和60℃之间、在39℃和55℃之间、在39℃和53℃之间、在39℃和52℃之间，优选在46℃和52℃之间。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种水解酶在具有纤维素酶背景的生物如里氏木霉中表达。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述碾磨的玉米籽粒物质的一个或多个级分混合/接触的一种或多种水解酶的有效量在0.005-0.5kg酶蛋白/公吨进入该湿磨工艺的玉米籽粒之间。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SO2的来源选自焦亚硫酸钠(Na2S2O5)、NaHSO3和/或添加的SO2气体。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该PDI或硫氧还蛋白肽包含属于氧化还原蛋白的硫氧还蛋白超家族的至少一个催化结构域，并且其中该结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该PDI包含两个催化结构域，每个催化结构域包含特征在于具有CXXC基序的活性位点，这两个催化结构域由至少一个非催化结构域分隔。
31.根据权利要求29-30所述的方法，其中该CXXC基序选自由以下组成的组：CGHC、CTHC、CPHC、CGPC和CSMC，特别是CGHC或CGPC。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中该催化结构域属于家族Pf00085。
33.根据权利要求29-32所述的方法，其中该PDI包含三个结构域结构Pf00085-Pf13848-Pf00085，其中中央Pf13848结构域的侧翼为两个Pf00085结构域，一个在N末端并且另一个在C末端。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(几个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
37.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该PDI选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有PDI活性。
38.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该硫氧还蛋白肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO:5的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有硫氧还蛋白肽活性。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:13的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有木聚糖酶活性。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，该片段具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自里氏木霉或特异腐质霉。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些纤维素酶衍生自具有来自烟曲霉的CBH I和CBH II的里氏木霉背景纤维素酶。
46.一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:1的氨基酸21-516具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:1的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
47.根据权利要求46所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
48.根据权利要求46-47中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
49.根据权利要求46所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:1的氨基酸21-516。
50.一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸21-513具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:2的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
51.根据权利要求50所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
52.根据权利要求50-51中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
53.根据权利要求50所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:2的氨基酸21-513。
54.一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:3的氨基酸21-516具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:3的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:3的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
55.根据权利要求54所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
56.根据权利要求54-55中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
57.根据权利要求54所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:3或其成熟多肽；或SEQ ID NO:3的氨基酸21-516。
58.一种具有蛋白质二硫键异构酶活性的分离的或纯化的多肽，该分离的或纯化的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:4的氨基酸21-517具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:4的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:4的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有蛋白质二硫键异构酶活性。
59.根据权利要求58所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
60.根据权利要求58-59中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
61.根据权利要求58所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1或其成熟多肽；或SEQ ID NO:4的氨基酸21-517。
62.一种具有还原蛋白质二硫键的能力的分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽，该分离的或纯化的硫氧还蛋白多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:5的氨基酸1-110具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)通过在SEQ ID NO:5的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:5的成熟多肽的多肽；
(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:24的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的多肽的片段，该片段具有硫氧还蛋白活性活性。
63.根据权利要求62所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
64.根据权利要求62-63中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
65.根据权利要求62所述的多肽，该多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:5或其成熟多肽；或SEQ ID NO:5的氨基酸1-110。
66.根据权利要求46-65中任一项所述的多肽，其中与在纤维洗涤步骤中不存在/未添加PDI或硫氧还蛋白肽的工艺相比，在该湿磨工艺期间从碾磨的籽粒的富含纤维的级分中释放的淀粉和/或谷蛋白、特别是不溶性淀粉和谷蛋白的量增加。
67.一种组合物，该组合物包含根据权利要求46-66中任一项所述的多肽。
68.根据权利要求67所述的组合物，该组合物进一步包含根据权利要求10所述的木聚糖酶和/或根据权利要求11-16所述的纤维素酶。
69.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含根据权利要求46-66中任一项所述的多肽。
70.一种分离的或纯化的多核苷酸，该分离的或纯化的多核苷酸编码根据权利要求46-66中任一项所述的多肽。
71.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求70所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个异源控制序列。
72.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据权利要求70所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个异源控制序列。
73.一种产生具有蛋白质二硫键异构酶活性或硫氧还蛋白肽活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养根据权利要求72所述的重组宿主细胞，以及任选地回收该多肽。
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